一种小麦抗旱基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种新的小麦抗旱基因TaNAC，同时涉及TaNAC基因在提高植物抗旱能力中的相关应用。在技术上，根据ES?T，利用RACE技术扩增得到TaNAC的全长cDNA序列，命名为TaNAC。本发明中小麦抗旱基因TaNAC具有SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列。该基因所编码的蛋白具有NAC家族成员所共有的保守结构域NAM。通过遗传转化，获得了转TaNAC基因烟草阳性植株。表型及生理学分析表明过表达TaNAC可明显提高烟草抗旱性。这些结果表明TaNAC具有作物品质改良和育种应用前景。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种小麦抗旱基因 TaNAC，属于NAC转录 因子家族基因，同时，涉及TaNAC基因在提高植物抗干旱能力中的各种应用。 一种小麦抗旱基因及其应用
【背景技术】
[0002] 干旱是影响植物生长和发育的主要环境因子之一。据联合国粮农组织统计数据表 明，世界范围内因不同程度干旱条件导致植物减产约30%。在我国，干旱胁迫严重影响了我 国作物的推广和种植，限制了农业产出能力，制约着我国农业的发展，尤其是北方和西部地 区。近年来，通过克隆重要的抗逆基因，利用第三代植物基因工程，结合传统遗传育种，加快 新型具有抗逆品质物种的选育速度，已具有明显的现实应用价值，比如转Bt基因的水稻。 因此，有效筛选并克隆关键的抗逆基因，研究其功能，并将其导入受体物种中获得性状改良 的作物品种，已成为植物分子育种研究领域中的热点和重点。分离鉴定植物中的抗逆基因 对于作物品质改良及分子育种具有重要意义。
[0003] 为了适应逆境胁迫，植物进化出一系列生理生化机制。植物应答逆境胁迫主要涉 及到胁迫信号的感知和转导，从而激活一系列胁迫相关的基因的表达和合成多种蛋白，最 终导致各种生理和代谢的响应。这些蛋白主要包括：分子伴侣、渗透调节蛋白、离子通道蛋 白、转运蛋白、抗氧化蛋白、解毒蛋白。这些功能蛋白的表达广泛地受到转录因子的调控。 NAC(NAM，ATAF，⑶C)转录因子是一类植物特有的蛋白。NAC转录因子蛋白的结构包括：一个 高度保守的N端DNA结合区域、一个核定位信号区域、一个可变的C端区域。水稻中存在75 个NAC转录因子，拟南芥中存在105个NAC转录因子。NAC转录因子被报道能够调控植物茎 的顶端分生组织发育、花器官细胞延伸、侧根的形成、病菌刺激、对非生物逆境胁迫的应答。 有研究表明，水稻SNAC1能够受干旱胁迫诱导，过表达SNAC1能够显著增强植物对干旱和高 盐胁迫的耐受性。因此，克隆和鉴定小麦中的NAC转录因子基因对于作物抗逆性理论研究 和实际运用有着重要的科研及应用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明目的在于提供一种小麦抗旱基因 TaNAC，该基因属于典型的植物NAC转录 因子家族。
[0005] 本发明的另一个目的在于提供一种能够调节干旱适应能力的抗旱基因 TaNAC在 提高作物抗旱性中的应用。
[0006] 本发明利用数据库中的EST序列及RACE技术相组合，获得一种小麦抗旱基因 TaNAC全长为924bp的cDNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。该基因所编码的蛋 白一共有307个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0007] 应该明确的是，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其蛋 白生物活性的前提下，对其实施取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸，蛋白质序列比对 同源性在90%以上，所得到所述蛋白的突变体序列。因此，本发明还包括对SEQ ID No. 2所 示氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸，得到的高同源性且具有生物活 性的衍生蛋白。
[0008] 本发明包括编码上述所述蛋白的核苷酸序列。
[0009] 此外，应当理解，鉴于密码子兼并性及物种具有密码子偏好性的特点，本领域技术 人员，可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
[0010] 本发明的基因和蛋白质可以从小麦品种中国春中克隆或分离得到，或者通过序列 化学合成方法得到。
[0011] 可将本发明基因连接至表达载体启动子下游，构建能够表达该蛋白的重组表达载 体，进而可以通过遗传转化的方法，将所述表达载体导入各种宿主，得到转TaNAC基因的转 化体。
[0012] 本发明将小麦抗旱基因 TaNAC导入烟草，转基因植株的抗旱表型及抗旱生理指 标，均得到显著性提高，表明TaNAC基因可用于提高作物抗旱性。
[0013] 本发明技术路线如下：
[0014] 查询获得小麦EST -小麦材料处理一目的基因扩增一实验载体构建一转基因植 物抗逆表型及生理分析一研究结论
[0015] 图1烟草过表达载体PBI121-TaNAC构建示意图（通用载体图谱，无中文注释）。
[0016] 图2转TaNAC基因烟草株系表型分析（注：WT为野生型，VC为转空载体植株，L为 TaNAC过表达株系；A为六周幼苗，B为三周幼苗）。
[0017] 图3转TaNAC基因烟草株系生理学分析（注：WT为野生型；L为TaNAC过表达株 系；三周的烟草植株进行干旱处理20天后测定相对水含量、离子渗漏、丙二醛含量）
【具体实施方式】
[0018] 为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但 本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
[0019] 实施例1小麦抗旱基因 TaNAC基因克隆及生物信息学分析
[0020] 小麦的表达序列标签（EST)可通过DFCI小麦数据库进行查找〇11^口：/7(3〇11^|13；[0· dfci. harvard, edu/cgi-bin/tgi/gimain. pi ? gudb = wheat)。从这一数据库中，我们发 现一个EST序列属于NAC家族。序列分析表明，该EST所编码的蛋白的5 ' -端是完整的，但 是3'-端缺失。利用RACE技术，我们获得了该EST序列的3'-端。通过序列拼接及PCR 扩增，我们获得了该基因的cDNA序列，将其命名为TaNAC，如SEQ ID No. 1所示。
[0021] 利用Blast、ORFFINDER、DNAMAN等数据库或者软件分析表明，我们所获得的TaNAC cDNA包含了完整的开放阅读框（0RF)。通过序列比对分析确定TaNAC基因所编码蛋白具有 NAC家族的NAM结构域。这些结果表明，我们所获得的TaNAC是一个新的小麦NAC转录因子 家族成员，为该基因的功能研究奠定了基础。
[0022] 实验步骤：
[0023] 1.引物设计：根据获得的EST片段用Primer Premier 5设计一条RACE引物
[0024] P1UP ：GGTGCACATGAGCAAGCTTCCAAGC
[0025] RACE 反应的接头引物为 P1D0WN :CTAATACGACTCACTATAGGGC
[0026] 2.反应体系：在0· 2mL离心管中依次加入cDNA模版1. 0 μ L，10 XBuffer 2. 5 μ L， dNTP 0· 5μ L，PlUP(10pM) 1· Ομ L，PlD0WN(10pM) 1· Ομ L，Taq 聚合酶（5ιι/μ L)0. 3μ L，ddH20 18. 7 μ L〇
[0027] 3·反应程序：94°C，5m ;94°C，45s ;55°C，45s ;72°C，lm ;72°C，10m ;35Cycle
[0028] 4.目的片段的回收：用TIANGEN的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收（参照说明 书）。
[0029] 5.回收产物与pMD18-T vector连接（参照TaKaRa说明书）：在0.2mL离心管中 依次加入 PMD18-T vector (50ng/μ L) 0· 5 μ L，回收产物（100ng/μ L) 3. 0 μ L，Solution I 5. 5μ L，ddH20 1. 0μ L。混匀后瞬时离心，将管壁上的液滴收集到管底，16°C连接12小时。
[0030] 6· E. coli DH5 α感受态细胞的制备：参照分子克隆实验指南（黄培堂2002)。
[0031] 7.连接产物转化Ε. coli DH5 α :参照分子克隆实验指南（黄培堂2002)。
[0032] 8.重组质粒DNA的小量提取：参照分子克隆实验指南（黄培堂2002)。
[0033] 9.重组质粒的PCR鉴定：PCR反应体系同实例1. 2,反应程序同实例1. 3。
[0034] 10.重组质粒双酶切鉴定及测序：在0. 2mL离心管中加入重组质粒（900ng/ yL)5. OyL, EcoR I(15u/yL)1.0yL, Hindlll (15u/μ L) 1. 0 μ L, lOXbuffer K 2. 0 μ L, ddH20 11. 0 μ L，混匀后，稍稍离心，37°C温浴3h，然后将酶切产物在1 %琼脂糖凝胶中电泳， 与PCR鉴定结果结合分析判断是否有相应的片段插入。测序由上海生工生物工程有限公司 完成。
[0035] 11. TaNAC cDNA 全长克隆
[0036] ⑴引物设计：
[0037] P2UP ： 5; -GTGTTCCTCTCTCATCGCATCA-3;
[0038] P2D0WN : 5，-ACTTGGAACCACTTCTAGGCAA-3，
[0039] (2)反应体系：在0· 2mL离心管中依次加入cDNA模版L 0 μ L，10 X Buffer 2· 5μ L，dNTP 0· 5μ L，P2UP(10pM) 1· 0μ L，P2D0WN(10pM) 1· 0μ L，Taq 聚合酶（5u/ μ L) 0· 3 μ L, ddH20 18. 7 μ L。
[0040] (3)反应程序：94°C，5m ;94°C，45s ;5(TC，45s ;72°C，90s ;72°C，10m ;35 循环。
[0041] (4)目的片段的回收、连接、转化、质粒提取、鉴定、测序：操作同实例1的步骤 4-10。
[0042] 实施例2植物表达载体的构建
[0043] 以PBI121载体为基础，将TaNAC的cDNA片段插入到35S启动子的下游，由35S启 动子启动表达（见图1)。电泳检测、酶切、连接等反应以及测序分析表明，我们已成功构建 了 PBI12Ι-TaNAC植物表达载体，为随后的转基因研究奠定了基础。
[0044] 实验步骤：
[0045] 1.目的基因的PCR扩增：根据TaNAC的cDNA序列用Primer Premier5设ii 对 引物，进行PCR扩增。
[0046] P3UP :5' -GCTCTAGAATGTCGATGAGCTTCCTG-3，
[0047] P3D0WN : 5, -CGGGATCCCTAGAAGTGGTTCCAAGTAGA-3,
[0048] 扩增程序和反应体系同实例1. 11。
[0049] 2.目的片段的回收：同实例1.4。
[0050] 3.目的片段的酶切：在0. 2mL离心管中加入回收的目的片段20 μ L，Xba I (10u/ yL)2yL，BamH I(10u/yL)2yL，10Xbuffer Κ+0· 1% BSA 5+5yL，水 16yL。
[0051] 4.目的片段的再次回收：同实例1.4。
[0052] 5. PBI121载体的获得：将保存在大肠杆菌中的PBI121质粒提取出来，提取方法同 实例1. 8。参照实例2. 3方法对质粒进行酶切，酶切后的质粒用琼脂糖凝胶回收试剂盒回 收，方法同实例1. 4。
[0053] 6.目的片段和PBI121载体的连接：PBI121载体4yL，目的片段4yL，T4 DNA连接 酶（35〇11/^1^)1111^，1'4131^作1'1111^。混匀后瞬时离心，将管壁上的液滴收集到管底，161： 连接12小时。
[0054] 7.感受态的制备、转化、重组质粒的筛选和鉴定、测序
[0055] 其操作过程同实例1的6-10。
[0056] 实施例3TaNAC转基因烟草株系的获得
[0057] 采用根癌农杆菌介导的遗传转化法将PBI121_TaNAC表达载体转化至烟草中，经 卡那霉素培养筛选得到?；代抗性烟草植株，经PCR检测目的基因确认阳性植株。收获?；代 抗性烟草植株的种子，栽培获得1\代。筛选?\阳性植株并收获种子，栽培获得1~ 2代。继续 对Τ2代植株检测，确定目的基因未发生遗传分离丢失，最终获得含有TaNAC稳定遗传的阳 性纯合转基因烟草株系。
[0058] 实验步骤：
[0059] 1. LBA4404农杆菌感受态细胞的制备：
[0060] (1)挑农杆菌LBA4404单菌落接种于5ml含50mg/L Str的YEB液体培养基中，28°C 暗培养200rpm摇菌过夜；
[0061] ⑵取2ml菌液接种于50ml含50mg/L Str的YEB液体培养基中继续震荡培养，至 〇D_值为0. 4左右；
[0062] (3)将培养好的菌液置于冰上冰浴30min，在4°C下5000rpm离心5min，到掉上层 培养基；
[0063] (4)向收集的菌体沉淀中加入10ml预冷的20mM CaCl2，充分重悬菌体；
[0064] (5) 4°C下5000rpm离心5min，倒掉上清，尽量将液体去除干净；
[0065] (6)将1ml预冷的20mM CaCl2重悬菌体，以每100 μ L分装一管，迅速置于液氮中 冷冻后_70°C保存。
[0066] 2. PBI121_TaNAC/PBI121 表达载体转化农杆菌：
[0067] (1)取一管制备好的农杆菌感受态细胞，置于冰上融化；
[0068] (2)加入待转化质粒1 μ L，轻轻混勻，冰浴30min ;
[0069] (3)在液氮中冷冻lmin，然后迅速置于37°C水浴锅中水浴5min ;
[0070] (4)取500yL不含抗生素的YEB液体培养基加入到离心管中，在28°C，200rpm条 件下暗培养3-5h ;
[0071] (5)8000rpm离心lmin，取出部分上层培养基，留下50-100μ L上清重新悬浮菌 体；
[0072] (6)将菌液涂布在含50mg/L Kan，50mg/L Str的ΥΕΒ固体培养基上，28°C倒置暗培 养2-3d，将有单菌落长出。
[0073] 3.阳性克隆的鉴定：通过抽提转化菌落的质粒，PCR扩增目的基因鉴定阳性克隆。 引物同实例2. 1，扩增程序和反应体系同实例1. 11。
[0074] 4.烟草的遗传转化及再生：通过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草。
[0075] 5.阳性植株的PCR检测：提取转化植株的DNA利用目的基因引物进行PCR扩增筛 选阳性植株。
[0076] P4UP ：GCTACTGTGTCGGGATACTGGAA
[0077] P4D0WN ：TGTTGCTGGCACTGTTATTACTGA
[0078] 实施例4转TaNAC基因烟草株系的抗旱表型分析
[0079] 转TaNAC基因烟草株系抗干旱表型分析：分别在MS培养基上萌发野生型、转空载 体（PBI121)和转目的基因（PBI121-TaNAC)烟草种子，萌发一周后移栽至沙土培养基质中。 在正常光照和给水量条件下，培养二周或者五周。分别对三周和六周的烟草幼苗停止水分 供给23或30天，观察转基因植株和野生型的表型。结果表明，干旱处理23天后，六周的转 基因植株叶片萎焉程度明显低于对照植株（见图2A)。而且，干旱处理30天后，三周的转基 因植株表现出比对照植株更好的生长状态（见图2B)。这些结果表明，转基因植株比对照植 株具有更强的抗干旱胁迫的能力。
[0080] 实施例5TaNAC转基因烟草株系的抗旱相关生理指标测定
[0081] 三周的野生型和转基因烟草植株进行控水处理20天后测定相对水含量、离子渗 漏、丙二醛含量。结果表明，控水处理20天后，与野生型相比较，转基因植株表现出较高的 相对水含量、较少的离子渗漏、较低的丙二醛含量（见图3)。这些结果从生理学的角度进一 步证实了转基因植株比野生型植株具有更强的抵抗干旱胁迫的能力。
[0001] 序列表 SEQUENCE LISTING SEQIDNo.l ATGTCGATGAGCTTCCTGAGCATGGTGGAGACGGAGCTGCCGCCGGGGTTCCGGT TCCACCCGAGAGACGACGAGCTCATCTGCGACTACCTCGCGCCCAAGGTCACCGG CAAGGTCGGCTTCTCCGGCCGCCGCCCGCCCATGGTCGACGTCGACCTCAACAAG GTCGAGCCATGGGACCTCCCTGTGACTGCATCGGTGGGCGGCAAGGAATGGTATTT CTATAGCCTAAAGGATCGGAAATACGCGACGGGGCAGCGCACGAACCGAGCTACT GTGTCGGGATACTGGAAGGCGACCGGGAAGGATAGGGTGGTGGCACGACGAGGC GCCCTAGTGGGGATGAGGAAGACATTGGTGTTCTACCAAGGGAGGGCCCCTAAAG GGAGGAAGACTGAGTGGGTGATGCATGAATACAGGTTGGAGGGTGCACATGAGCA AGCTTCCAAGCAGGAGGACTGGGTCCTGTGCAGAGTCATCTGCAAGAAGAAATCA GGAGTTGGTGCCACCCCCAGGCCAAGGAACCTCACCAACATTGTCCATGGCACAT CCACAGACACCTCCTCACCGCCACTGCCACCTCTCATGGACACCACCCTAGCACA GCTCCAGGCCACCATGAACACCTCCTCAGCCGCCGCCGCCGCCGCAGCACTTGAG CAAGTGCCCTGCTTCTCCAGCTTCAGTAATAACAGTGCCAGCAACAGCAGCTACCT CCCCATGGTGACAGGCAACAGTAATGGCATGAGCTACCTGGACCATGGCCTGCCTG ACTTTGGGAGCTACCTAGACCCCGCCATGAACTGTGACAAGAAGGTCCTTAAGGC AGTGCTGAGCCAGCTGAGCTCCATGGGTGGTGAGGTGGTGCCGAGCATGTCTCCT CAGATGGCTGCTGCAGTGAGCTCTACTTGGAACCACTTCTAG SEQ ID No.2 MSMSFLSMVETELPPGFRFHPRDDELICDYLAPKVTGKVGFSGRRPPMVDVDLNKVE PWDLPVTASVGGKEWYFYSLKDRKYATGQRTNRATVSGYWKATGKDRVVARRGA LVGMRKTLVFYQGRAPKGRKTEWVMHEYRLEGAHEQASKQEDWYLCRVICKKKS GVGATPRPRNLTOIVHGTSTDTSSPPLPPLMDTTLAQLQATMNTSSAAAAAAALEQV PCFSSFSNNSASNSSYLPMVTGNSNGMSYLDHGLPDFGSYLDPAMNCDKKVLKAVLS QLSSMGGEVVPSMSPQMAAAYSSTWNHF
【权利要求】
1. 一种小麦NAC转录因子氨基酸序列的特征为： (1) 由SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或 (2) 与序列SEQ ID No. 2限定的氨基酸序列同源性在99-100%编码相同功能蛋白质的 氨基酸序列。
2. 编码权利要求1所述蛋白的基因 TaNAC，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
【文档编号】A01H5/00GK104109192SQ201410225032
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年5月27日 优先权日:2014年5月27日
【发明者】胡伟, 颜彦 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所