一种提高反刍动物肉奶cla含量的天然产物制剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种提高反刍动物肉奶CLA含量的天然产物制剂，该天然产物制剂既减少了瘤胃微生物甲烷生成量，又无需过瘤胃保护潜在提高反刍动物肉和奶中共轭亚油酸（CLA)含量。该天然产物制剂是由紫苏子果实粉碎后，经质量百分含量60-80%的乙醇溶液提取，通过氮吹和冷冻干燥得到的干粉。本发明通过乙醇提取紫苏子的脂肪酸等有效成分，通过氮吹和冷冻干燥法制备干粉。瘤胃体外发酵试验显示，该制剂在0.4g/L即每克干物质添加40mg添加量时，可有效减少瘤胃微生物甲烷生成量达63.3%，同时对挥发性脂肪酸、氨态氮和总细菌数无显著影响。本发明所述的天然产物即保证了乳和肉产量，又提高了乳肉中CLA浓度，所以是真正意义上的获到高CLA功能性<产品的有效途径。
【专利说明】一种提高反刍动物肉奶CLA含量的天然产物制剂
【技术领域】
[0001] 本发明涉及瘤胃调控领域，具体涉及一种减少瘤胃微生物甲烷生成量，并且无需 过瘤胃保护提高反刍动物肉和奶中共轭亚油酸（CLA)含量的天然产物制剂。
【背景技术】
[0002] 补充富含多不饱和脂肪酸的油，如亚油酸（C18:2,大豆和向日葵）和亚麻酸 (C18:3,亚麻籽），能减少瘤胃甲烷生产分别达4. 1 %和4. 8% (分别来自19个和20个观测 值，Martin等，2009)。但不饱和脂肪酸的添加显著抑制瘤胃消化，进而降低反刍动物生产 性能（Zhang 等，2008)。
[0003] 共轭亚油酸（CLA)是具有共轭双键的十八碳二烯酸的位置和几何异构体的混合 物。在CLA的不同异构体中，各自的生理功能和生物活性不同。c9，tllCLA单独或与其他异 构体共同在抗癌方面具有生物活性（Pariza等，1999)。同样，tlO, C12CLA是影响能量代谢 和降低机体脂肪沉积的活性形式。
[0004] CLA的抗癌作用是它受到众多研究者重视的主要原因，已在多种试验模型中得到 证实，这些模型包括：小鼠的胃癌、小鼠的皮肤癌和大鼠的乳腺癌及兔和仓鼠的动脉粥样硬 化（Cook 等，1993 ;Ip 等，1990,1996 ;Miller 等，1994 ;Belury 等，1996)。许多离体实验表 明，CLA还对许多人类的癌细胞的生长具有抑制作用（Shultz等，1992 ;Visonneau等，1996 ; Cunningham等，1997)。另外，在最近的流行病调查中得到证实，随着乳品消费量的增长，妇 女患乳腺癌的几率减少；调查人员发现该成果可能归功于牛乳脂中CLA的抗癌作用。
[0005] 研究人员试图通过添加脂肪提高牛奶CLA含量，如脂肪酸钙、全脂籽实和植物油。 由于富含亚油酸的植物油的凝固点过低，单独一种植物油很难合成脂肪酸钙，需要添加饱 和度高、凝固点高的棕榈油或牛羊油，这样脂肪酸钙中的亚油酸含量降低。由于受疯牛病影 响，已限制在奶牛饲料中应用牛油来源的脂肪酸钙，所以在欧共体国家已大规模减少脂肪 酸钙用量。在德国、丹麦，受消费趋势的影响，脂肪酸钙在奶牛场已停用。另外在小肠中脂 肪酸与钙重新结合，难以溶解，消化率低。全脂籽实在奶牛日粮配合方面灵活性太差，限制 了其在奶牛日粮中的配合比例，另从研究的角度来讲，是否存在脂肪与蛋白甚至其他物质 的互作效应也未可知。由于植物油对瘤胃细菌尤其是纤维分解菌的生长与活力有抑制作用 (Jenkins，1997)，进而影响瘤胃纤维的正常发酵，降低乙酸浓度，降低乳脂率，传统上反刍 动物日粮中一般不包含植物油。奶牛产奶高峰期日粮能量浓度低，而采食量是一定的，若过 度增加精料饲喂量容易出现酮病、蹄叶炎、酸中毒等营养代谢性疾病。目前市售过瘤胃保护 型CLA以期提高牛奶中CLA含量，不仅成本高而且工艺繁琐。
[0006] 紫苏子是一种常见的中草药，为唇形科植物紫苏的干燥成熟果实，功效降气消痰、 止咳平喘、润肠。早在《神农本草》中关于紫苏的记载，紫苏籽油被认为是调味精品和食疗 珍品，在古时是进贡皇帝的名贵营养食用油（张洪，2006)。
【发明内容】
[0007] 本发明提供一种提高反刍动物肉奶CLA含量的天然产物制剂，该天然产物制剂既 减少了瘤胃微生物甲烷生成量，又无需过瘤胃保护潜在提高反刍动物肉和奶中共轭亚油酸 (CLA)含量。
[0008] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0009] -种提高反刍动物肉奶CLA含量的天然产物制剂，该天然产物制剂是由紫苏子果 实粉碎后，经质量百分含量60-80%的乙醇溶液提取，通过氮吹和冷冻干燥得到的干粉。紫 苏子果实含有大量的不饱和脂肪酸，主要为α-亚麻酸、油酸、亚油酸、软脂酸和硬脂酸。其 中a-亚麻酸对人体具有明显的保健功能和生理功效（徐章华，2002)。不饱和脂肪酸中 含有大量的不饱和键，可以与氢发生加合反应，减少甲烷菌对氢的利用，从而减少甲烷的生 成。为了高效获得紫苏子果实中的不饱和脂肪酸且不影响其化学性质，选择在常温下乙醇 提取，便于提取液浓缩制成干粉，醇溶液控制在60-80%，且以70%最好。介于紫苏子果实 含有上述功能性成份，紫苏子在减少瘤胃甲烷生成中具有一定的效果。紫苏子具有广源性 和协同性，其功能提取物制剂经科学配伍后有望进一步全面改善瘤胃功能。本发明人在实 验过程中意外的发现，其在具有减少瘤胃甲烷生成功能的同时竟然不影响瘤胃挥发性脂肪 酸（VFA)生成量，不影响细菌的数量，这是与其他常规富含不饱和脂肪酸的天然产物具有 显著区别之处。
[0010] 一种所述的天然产物制剂的制备工艺，该工艺包括如下步骤：用中药粉碎机将紫 苏子果实粉碎为粉末状，加入适量质量百分含量60-80 %的乙醇溶液混合均匀，经漩涡振 荡、旋转混合器混合、离心后，吸取上清液至冷冻瓶，氮吹仪吹干后，冷冻干燥得到天然产物 制剂干粉。
[0011] 作为优选，所述的制备工艺具体包括如下步骤：
[0012] (1)用中药粉碎机将紫苏子果实粉碎为粉末状，放入离心管中，加入适量70%乙 醇溶液；
[0013] (2)漩涡振荡一35rpm旋转混合器混合30min-漩涡振荡一旋转混合器混合 30min - 3000rpm 离心 5min ;
[0014] (3)吸取上清液至冷冻瓶，氮吹仪吹干；
[0015] (4)离心管中沉淀保留，继续添加适量70%乙醇溶液一漩涡振荡器一旋转混合器 30min -漩润振荡器一旋转混合器30min -漩润振荡器一旋转混合器30min - 3000rpm离 心 5min ;
[0016] (5)吸取上清液至已吹干的冷冻瓶，氮吹仪吹干，冷冻干燥机24_48h至干粉，待升 至室温称重，封瓶，_20°C保存。
[0017] 所述的天然产物制剂在减少瘤胃微生物甲烷生成、提高反刍动物肉奶CLA含量中 的应用，其特征在于：该天然产物制剂在每克饲料中的添加量为35-45mg。另一种表述是， 该天然产物制剂在瘤胃液中达到〇. 4g/L添加量时，可有效减少瘤胃微生物甲烷产量，不影 响瘤胃挥发性脂肪酸和氨态氮生成量，不影响瘤胃细菌总量。一些常规的用于降低瘤胃微 生物甲烷产量的天然产物制剂，如植物油，由于不饱和脂肪酸含量较高，会抑制反刍动物的 瘤胃消化，所以只能以损失增重和降低乳产量和乳脂率为代价来降低甲烷排放，而且这种 常规植物油的添加虽在一定程度上提高了乳中CLA浓度，但却降低了总的乳脂产量，所以 在生产中为了提高乳中CLA含量，必须对植物油等物质进行包被，否则无法实现真正意义 上的CLA功能乳的生产。而这些植物油一旦包被在瘤胃中又无法发挥其降甲烷的功效。而 本发明所述的天然产物制剂在无过瘤胃保护情况下，该天然产物制剂在每克饲料中的添加 量为35-45mg并不影响瘤胃挥发性脂肪酸生成量、氨态氮浓度，且该剂量添加时并不影响 细菌的数量。CLA是细菌对亚油酸氢化作用的一类中间代谢物，本发明所述的天然产物含有 高浓度的亚油酸，所以在细菌含量不受到影响的同时，细菌可将此天然产物中的亚油酸氢 化为CLA，进入血液循环到达乳腺，提高乳中的CLA浓度，同时由于本发明所述的天然产物 对挥发性脂肪酸生成量和氨态氮浓度无影响，说明该天然产物的添加不影响瘤胃的消化和 营养物质向机体的供应，所以乳和肉产量也不会发生变化。因此本发明所述的天然产物即 保证了乳和肉产量，又提高了乳肉中CLA浓度，所以是真正意义上的获到高CLA功能性产品 的有效途径。而且本发明所述的天然产物对瘤胃甲烷排放有很好的减排作用。所以本发明 的天然产物制剂是一种即可降低甲烷排放，又可提高乳肉CLA含量有效天然产物。
[0018] 作为优选，该天然产物制剂在使用时用DMS0稀释至35-45mg/mL。在小剂量使用 时，为保证添加量的准确，该天然产物制剂可用DMS0稀释，实际生产上用可以直接加干粉。
[0019] 本发明通过乙醇提取紫苏子的脂肪酸等有效成分，通过氮吹和冷冻干燥法制备干 粉。瘤胃体外发酵试验显示，该制剂在〇. 4g/L即每克干物质添加40mg添加量时，可有效减 少瘤胃微生物甲烷生成量达63. 3%，同时对挥发性脂肪酸、氨态氮和总细菌数无显著影响。
【具体实施方式】
[0020] 下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发 明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落 入本发明保护范围。
[0021] 在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均 可从市场购得或是本行业常用的。
[0022] 旋转混合器，華利逹WH-962。
[0023] 实施例1 :
[0024] (1)用中药粉碎机将紫苏子果实粉碎为粉末状，称取0. 25g于15mL离心管中，加入 5mL70%乙醇溶液；
[0025] (2)漩涡振荡一35rpm旋转混合器混合30min -漩涡振荡一旋转混合器混合 30min (两次共计 lh) - 3000rpm 离心 5min ;
[0026] (3)吸取上清液至冷冻瓶，氮吹仪吹干；
[0027] (4)离心管中沉淀保留，继续添加5mL70%乙醇一漩涡振荡器一旋转混合器 30min -漩涡振荡器一旋转混合器30min -漩涡振荡器一旋转混合器30min (三次共计 1. 5h) - 3000rpm 离心 5min ;
[0028] (5)吸取上清液至已吹干的冷冻瓶，氮吹仪吹干，冷冻干燥机24_48h至干粉，待升 至室温称重，封瓶，_20°C保存。
[0029] 实施例2 :
[0030] (1)用中药粉碎机将紫苏子果实粉碎为粉末状，称取0. 25g于15mL离心管中，加入 5mL60%乙醇溶液；
[0031] (2)漩涡振荡一35rpm旋转混合器混合30min-漩涡振荡一旋转混合器混合 30min (两次共计 lh) - 3000rpm 离心 5min ;
[0032] (3)吸取上清液至冷冻瓶，氮吹仪吹干；
[0033] (4)离心管中沉淀保留，继续添加5mL60%乙醇一漩涡振荡器一旋转混合器 30min -漩涡振荡器一旋转混合器30min -漩涡振荡器一旋转混合器30min (三次共计 1. 5h) - 3000rpm 离心 5min ;
[0034] (5)吸取上清液至已吹干的冷冻瓶，氮吹仪吹干，冷冻干燥机24_48h至干粉，待升 至室温称重，封瓶，_20°C保存。
[0035] 实施例3 :
[0036] (1)用中药粉碎机将紫苏子果实粉碎为粉末状，称取0. 25g于15mL离心管中，加入 5mL80%乙醇溶液；
[0037] (2)漩涡振荡一35rpm旋转混合器混合30min -漩涡振荡一旋转混合器混合 30min (两次共计 lh) - 3000rpm 离心 5min ;
[0038] (3)吸取上清液至冷冻瓶，氮吹仪吹干；
[0039] (4)离心管中沉淀保留，继续添加5mL80%乙醇一漩涡振荡器一旋转混合器 30min -漩涡振荡器一旋转混合器30min -漩涡振荡器一旋转混合器30min (三次共计 1. 5h) - 3000rpm 离心 5min ;
[0040] (5)吸取上清液至已吹干的冷冻瓶，氮吹仪吹干，冷冻干燥机24-48h至干粉，待升 至室温称重，封瓶，_20°C保存。
[0041] 下面结合瘤胃体外发酵试验详细说明该制剂减少甲烷生成的幅度：
[0042] (1)紫苏子果实提取物的制备和稀释
[0043] 采用实施例1制得的紫苏子果实提取物干粉，用DMS0稀释干粉至40mg/mL，得到紫 苏子果实提取物DMS0溶液。
[0044] (2)提取物瘤胃体外发酵试验
[0045] 采用压力读取式体外产气法开展减少甲烷生成效果试验。试验分两组进行，分别 为对照组、紫苏子果实提取物组（简称：紫苏子组），每组三个重复。试验底物为干物质重 量比为30 :70的玉米和羊草。称取干物质0. 5g的混合底物，置入120mL产气瓶中，再将产 气瓶置于厌氧培养箱中。晨饲前，从3头瘘管奶牛瘤胃的3个不同位点共抽取大约2L左 右的瘤胃液，经4层纱布过滤后，与9倍体积的厌氧人工唾液混合后，得到人工瘤胃液。取 50mL人工瘤胃液于每个产气瓶，紫苏子组添加500 μ L、浓度为40mg/mL的紫苏子果实提取 物DMS0溶液，终浓度为0. 4g/L，即每克干物质添加40mg紫苏子果实提取物。对照组添加 DMS0500 μ L，每个处理组3个重复，随机置于39±0. 5°C的恒温箱中培养。24h后，用气相色 谱仪测量甲烷产量和挥发性脂肪酸。取lml发酵液，用酶标仪比色法测定铵态氮浓度。取 2ml发酵液，C-Tab法提取基因组DNA，进一步使用Real-time PCR绝对定量总细菌、原虫、 真菌和甲烷菌。
[0046] 紫苏子组相对对照组甲烷产量降低了 63. 3%，挥发性脂肪酸和氨态氮浓度两个处 理组没有差异，数据见表1。紫苏子组原虫、真菌和甲烷菌的拷贝数显著低于对照组，而总细 菌数则没有差异，数据见表2。
[0047] 表1紫苏子果实提取物对瘤胃体外发酵甲烷生成量、挥发性脂肪酸和铵态氮的影 响
[0048]
【权利要求】
1. 一种提高反刍动物肉奶CLA含量的天然产物制剂，其特征在于：该天然产物制剂是 由紫苏子果实粉碎后，经质量百分含量60-80%的乙醇溶液提取，通过氮吹和冷冻干燥得到 的干粉。
2. -种权利要求1所述的天然产物制剂的制备工艺，其特征在于该工艺包括如下步 骤：用中药粉碎机将紫苏子果实粉碎为粉末状，加入适量质量百分含量60-80%的乙醇溶液 混合均匀，经漩涡振荡、旋转混合器混合、离心后，吸取上清液至冷冻瓶，氮吹仪吹干后，冷 冻干燥得到天然产物制剂干粉。
3. 根据权利要求2所述的制备工艺，其特征在于该工艺具体包括如下步骤： (1) 用中药粉碎机将紫苏子果实粉碎为粉末状，放入离心管中，加入适量70%乙醇溶 液； (2) 漩润振荡一35rpm旋转混合器混合30min -漩润振荡一35rpm旋转混合器混合 30min - 3000rpm 离心 5min ; (3) 吸取上清液至冷冻瓶，氮吹仪吹干； (4) 离心管中沉淀保留，继续添加适量70%乙醇溶液一漩涡振荡器一旋转混合器 30min -漩润振荡器一旋转混合器30min -漩润振荡器一旋转混合器30min - 3000rpm离 心 5min ; (5) 吸取上清液至已吹干的冷冻瓶，氮吹仪吹干，冷冻干燥机24 - 48h至干粉，待升至 室温称重，封瓶，_20°C保存。
4. 一种权利要求1所述的天然产物制剂在减少瘤胃微生物甲烷生成、提高反刍动物 肉奶CLA含量中的应用，其特征在于：该天然产物制剂在每克饲料中的添加量为35-45mg。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：该天然产物制剂在使用时用DMSO稀释至 35_45mg/mL〇
【文档编号】A23K1/16GK104206797SQ201410335180
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年7月15日 优先权日:2014年7月15日
【发明者】王佳堃, 刘美, 刘建新 申请人:浙江大学