一种苏云金芽孢杆菌几丁质酶的突变酶制备及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提出了一种苏云金芽孢杆菌几丁质酶Chi9602的突变酶制备及其应用，步骤为：对几丁质酶Chi9602基因进行同源建模和分子对接，选取突变位点；采用重叠延伸PCR进行定点突变，获得突变酶基因chiw50a；突变酶基因回收后，经Bgl II和Pst I双酶切，连接到表达载体pTrcHis B上，构建质粒pMB581；将质粒转化到大肠杆菌宿主细胞中，经IPTG诱导表达、亲和层析纯化制备突变酶ChiW50A。该突变酶较原始酶的酶比活提高了62.3％达到了83.46U/mg，最适pH为7.0，且在pH 9.0仍然具有高酶比活(54.69U/mg)，可用于生物防治植物病虫害，具有明显的抗真菌和杀虫增效作用。
【专利说明】一种苏云金芽孢杆菌几丁质酶的突变酶制备及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种苏云金芽孢杆菌几丁质酶突变酶的制备 及其生防应用。该突变酶是一种来源于苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)的几 丁质酶Chi9602经过基因定点突变、重组载体构建、载体原核表达和纯化后制备的。
【背景技术】
[0002] 几丁质（chitin)广泛存在于甲壳类动物的外壳、昆虫的甲壳、线虫及其卵和 真菌的胞壁中。其蕴藏量在地球上的天然高分子中占第二位，估计每年自然界生物的 合成量可达1X10 11吨，仅次于纤维素（微生物几丁质酶研究进展，安徽农业科学[J] (2010)38(22) :11685-11688)。
[0003] 几丁质酶是可以降解几丁质的糖基水解酶，被广泛地发现于细菌、植物和动物 (From bacteria to human:A journey into the world of chitinases. Biotechnology Advances (2013) 31:1786 - 1795)。大多数的几丁质酶属于糖基水解酶18和19家族。其中 糖基水解酶18家族的几丁质酶具有典型的TIM-桶状（（β α ) 8桶）结构和"DXDXE"模序。 模序中的谷氨酸残基（Ε)能促使几丁质中的β (1-4)糖苷键断裂，并将其水解成单个Ν-乙 醜葡萄糖胺（Structure of the D142N mutant of the family 18 chitinase Chi B from Serratia marcescens and its complex with allosamidin. Biochimica et Biophysica Acta(2004) 1696:103 - 111)。
[0004] 几丁质酶可以通过水解真菌细胞壁的几丁质可有效的抑制真菌的生长。因此它 可以应用于防治真菌病害。几丁质是昆虫中肠围食膜的主要结构成分。它是昆虫抵御药 物的屏障，但是被几丁质酶破坏后，杀虫剂能更有效发挥作用（Chitinases in biological control.Birkhauser Verlag Basel/Switzerland(1999)pp. 171-184)。同时几丁质也是线 虫及其卵的组成成分。因此，几丁质酶在生物防治病害真菌和植物害虫具有重要的用途。
[0005] 作为一种重要的生物防治资源，苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis简称 BT)制剂，已成功用于多种害虫的生物防治，例如：杀棉铃虫和杀线虫等。并且在减少化学 杀虫剂的污染和在植物保护中起到了重要作用。由于几丁质酶在BT的分布有所差异。因 此研究BT几丁质酶可以扩大BT制剂的使用范围，且能进一步提高其杀虫活性（苏云金芽 孢杆菌几丁质酶的研究进展，微生物学通报[J] (2007)34(1): 143-147)。实际应用中，由于 昆虫中肠道存在碱性环境，所以拥有碱性几丁质酶活性的BT几丁质酶将具有更高效的杀 虫活性。
[0006] 许多关于细菌几丁质酶的研究表明，定点突变改变氨基酸残基能导致酶的性质的 改变。运用基因工程和蛋白质工程的方法对细菌几丁质酶进行定向进化，可以得到几丁质 酶比活提高的突变酶。该突变酶制剂比原始酶更加适合用于杀虫和抗真菌等多效生防应 用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于运用基因工程和蛋白质工程的方法对细菌几丁质酶进行定向 进化，提出一种苏云金芽孢杆菌几丁质酶突变酶，其氨基酸序列SEQ ID NO. 1如下：
[0008] Mamrsqkftllllslllf lplf ltnfitpnlaladspkqsqkivgyfpsagvygrnyqvadidasklthl nyafadic wngkhgnpsthpdnpnkqtwnckesgvplqnkevpngtlvlgepwadvtksypgsgttwedcdkyarc gnfgel krlkakyphlktiisvggwtwsnrfsdmaadektrkvfaestvaflraygfdgvdldweypgvetipggs yrpedkqn ftlllqdvrnalnkagaedgkqylltiasgasqryadhtelkkisqildwisimtydfhggweatsnh naalykdpndpa antnfyvdgainvytnegvpvdklvlgvpfygrgwkscgkenngqyqpckpgsdgklaskgtwd dystgdtgvyd ygdlaanyvnkngfvrywndtakvpylynattgtfisyddnesmkyktdyiktkglsgamfwelsg dcrtspkyscs gpklldtlvkellggpinqkdtepptnvknivvtnknsnsvqlnwtastdnvgvteyeitageek wstttnsitiknlkp nteykfsiiakdaagnksqptaltvktdeanttppdgngtatfsvtsnwgsgynfsiiikn ngtnpiknwklefdysgnlt qvwdskissktnnhyvitnagwngeippggsitiggagtgnpaellnavisen
[0009] 其特征在于理论分子量为74. 45 kDa，属于糖基水解酶第18家族，由几丁质酶催 化域 CCD(__Asp452)、类纤连蛋白III型域 Fn3D(eln5Q4_Asn558)和几丁质酶结合域 CBD(Thrf82_Asn646)三 部分构成。保守序列为"DGVDLDWE"。N末端结构域中含有一个由34个氨基酸残基组成的 信号肽序列 SP(Metl-Ala34) °
[0010] 本发明同时提供了一种苏云金芽孢杆菌几丁质酶突变酶的基因序列SEQ ID N0. 2 如下：
[0011] atggctatgaggtctcaaaaattcacactgctattactatccctactacttttcttacctctttttctc acaaattttattactc caaatctcgcattagcagattcaccaaagcaaagtcaaaaaattgttgggtactttcctt cggcgggcgtttacggacgtaatt atcaagttgctgacattgatgcatcaaaacttactcaccttaactatgcttt cgcggatatttgttggaatggaaaacatggaaa cccttctactcatcctgataatccaaataaacaaacgtggaac tgtaaagaatctggtgtaccattgcaaaataaagaggttcc taatggtactctcgtactcggggaaccatgggctg atgttaccaaatcgtatcctggctcagggacaacttgggaagattgc gataaatatgcccgttgcggaaatttcgg ggaactaaaacgattaaaagctaaatatcctcacttaaaaacaattatttccgttg gtggctggacttggtctaac cgcttttctgatatggccgctgatgaaaaaacaagaaaagtatttgctgaatctacagtagcttt tcttcgcgcat atgggtttgatggcgtagatttagactgggaatatccgggcgttgaaacgattcctggtggtagttatcgtcct ga agacaaacaaaatttcactctccttcttcaagacgtccgaaatgctttgaataaagcaggtgctgaagatggcaaac aata tttactaacaatcgcttcaggtgcaagccaacgctacgctgatcatacagaactaaagaaaatttctcaaat actcgattggat tagtattatgacatatgatttccacggcggatgggaagctacttctaatcataatgcagctcta tataaggatccaaatgatcca gcagcaaatacgaatttttacgtagatggtgctataaatgtttatacaaatgaag gtgttccagtcgataaactagtattaggcg tacccttttacggacgtggctggaaaagttgtggcaaagaaaataa cggacaatatcaaccttgcaaaccaggtagtgatgg gaaacttgcttctaaaggtacttgggatgattactctacc ggtgacacaggtgtctatgattacggtgatttagcagccaattac gttaataaaaatggttttgtacgctactgga atgacacagctaaagtaccttacttatataatgcaactacaggcacatttattag ctacgatgacaatgaatctat gaaatacaaaacagactatataaagacgaaaggtttaagtggagcaatgttttgggaactaa gcggagattgccgt acaagtccaaaatatagttgcagtggtccaaaattacttgatacgctagtaaaagaattacttggtgga cctatta atcaaaaagatactgagccaccaacgaatgttaaaaacattgtagttacgaataaaaattcaaactcagttcaatta a actggactgcatctactgataacgtaggagttacggaatatgaaattactgctggagaagagaaatggagtacaa caacaa atagcattacaattaaaaacttaaaacctaatacggaatacaaattttcaataattgccaaagatgctgc tggaaataaatcaca acctaccgctcttactgtcaaaacggatgaagctaatacgacacctcctgatggaaatggt actgctacattttcagtcacttc gaattggggcagcggttataacttctcgattataatcaaaaataatggaacga accctattaaaaattggaaattagaatttgat tatagcggcaatttaacacaagtttgggattctaaaattagtag taaaacaaataatcattatgtaattacgaacgcaggatgg aatggtgaaattcctcctggtggatctattacaatt ggcggtgcaggaacaggtaatcctgccgaacttttaaatgccgtcatt agcgaaaactag
[0012] 本发明是这样实现的，制备苏云金芽孢杆菌几丁质酶（Chi9602)的突变酶的制备 步骤为：
[0013] (1)对几丁质酶Chi9602基因进行同源建模和分子对接，选取50位色氨酸作为突 变位点。
[0014] (2)采用重叠延伸PCR进行定点突变，突变反应分为两步。第一步，扩增突变位点 两端的基因序列，得到相互之间有重叠片段的两组PCR产物；第二步，将两组PCR产物作为 模板进行下一轮PCR扩增，得到需要的目的片段。所述的目的片段不包含N端信号肽序列。 设计四条引物如下所示：
[0015] 引物 P1 :5' -CAGAGATCTGATTCACCAAAGCAAAGT-3'
[0016] Bgl II
[0017] 引物 P2 :5' -CAGCTGCAGCTAGTTTTCGCTAATGACG-3'
[0018] Pst I
[0019] 引物 P3 :5' -TGGGTACTTTCCTTCGGCGGGCGTTTACGGACGTAA-3'
[0020] 引物 P4 :5, -GCCGAAGGAAAGTACCCAACAATTTTTTGACTTTGC-3'
[0021] 以 Bacillus thuringiensis subsp. tenebronis 9602 菌株的总 DNA 为 PCR模板， 使用引物P1和P2完成第一轮PCR反应。将扩增得到的chi9602片段用Bgl II和Pst I 进行双酶切后，连接到同样用Bgl II和Pst I双酶切回收后的表达载体pTrcHis B上。将 此质粒命名为PMB332。
[0022] 以含有chi9602片段的pMB332为模板，采用重叠延伸PCR技术第一轮PCR反应。 完成第50位氨基酸的定点突变，获得几丁质酶突变酶基因 W50A。所述的重叠延伸PCR技 术如图1所示。所获得突变序列回收后，使用Bglll和PstI进行双酶切后，连接到同样用 Bgl II和Pst I双酶切回收后的表达载体pTrcHis B上。将此质粒命名为pMB581。
[0023] (3)对质粒序列进行测序后，与chi9602基因进行比较。pMB581质粒为含有突变 酶基因的原核表达重组载体，其突变酶命名为ChiW50A，其氨基酸序列SEQ ID NO. 1所示。
[0024] (4)用包含上述突变酶基因的重组载体转化宿主细胞，制备重组菌株，其中重组载 体中原核表达载体为PTrcHis B，宿主细胞为大肠杆菌Escherichia coli T0P10。
[0025] (5)培养重组菌株，诱导突变酶ChiW50A表达。
[0026] (6)将表达后的突变酶ChiW50A回收并采用亲和层析纯化制备突变酶ChiW50A。
[0027] 经测试，本发明的突变酶ChiW50A的生物活性明显高于几丁质酶Chi9602,见附图 3。该突变酶ChiW50A较原始酶Chi9602比活提高了 62. 3%。
[0028] 将本发明的突变酶ChiW50A用于植物的生物防治病虫害上，具有明显的增效作 用。
[0029] 采用对峙法测定突变酶ChiW50A对水稻纹枯病菌生长的抑制实验，结果说明其对 水稻纹枯病菌生长具有明显的抑制作用，见附图4。
[0030] 将含有突变酶ChiW50A的YBT-1520孢晶混合物用于杀棉铃虫具有增效作用，见实 施表1。
[0031] 将含有突变酶ChiW50A的YBT-020孢晶混合物用于杀线虫具有增效作用。见附图 5 〇
[0032] 本发明具有明显的效果。本发明突变酶ChiW50A比原始酶Chi9602的生物活性有 很大的提高，用在生物防治病虫害上，具有很好的增效作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0033] 图1重叠延伸PCR示意图。
[0034] 图2几丁质酶基因 Chi9602的定点突变、原核表达载体的构建和表达转化。
[0035] (a) pTrcHi sB ; (b) PCR 产物琼脂糖电泳；（c)重组质粒 pMB581 ;
[0036] (d) pMB581 双酶切验证；（e)大肠杆菌 T0P10 ; (f) SDS-PAGE (泳道 Ml:核酸 Maker 1 ;泳道M2:核酸Maker 2 ;泳道M3:蛋白Maker 3 ;泳道1:PCR产物；泳道2:Bgl II单酶切； 泳道3:Pst I单酶切；泳道4:Bgl II/Pst I双酶切；泳道5:MB581;泳道6:MB581+IPTG;泳 道7:Ni柱纯化的突变酶ChiW50A)
[0037] 图3几丁质酶Chi9602和突变酶ChiW50A酶学性质。
[0038] (a)不同温度对纯化的几丁质酶Chi9602和突变酶ChiW50A酶比活的影响。
[0039] (b)不同pH对纯化的几丁质酶Chi9602和突变酶ChiW50A酶比活的影响。
[0040] 图4纯化的突变酶ChiW50A抑制水稻纹枯病菌生长。
[0041] (a) PBS 对照；（b) 2. 5 μ g 的突变酶 ChiW50A ;
[0042] (c) 5· 0 μ g 突变酶 ChiW50A ; (d) 7· 5 μ g 突变酶 ChiW50A。
[0043] 图5YBT-020胞晶混合物和制备的突变酶W50A复配杀L4期秀丽隐杆线虫N2增效 作用。
【具体实施方式】
[0044] 下面结合具体实例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围不限于以 下实例。
[0045] 本实例中Bacillus thuringiensis subsp. tenebronis 9602菌株、原核表达载体 pTrcHis B和大肠杆菌Escherichia coli T0P10来自于华中农业大学农业微生物重点实验 室。限制性内切酶和连接酶来自于Invitrogen公司。几丁质来源于Sigma公司，其他均为 国产分析级试剂。
[0046] 本实例中LB培养基配方如下：10. Og/L蛋白胨，5g/L酵母浸粉，10g/L氯化钠 ，pH 7. 2-7. 4。配制固体LB培养基时向上述配方中加入2%的琼脂粉。
[0047] PDA培养基配方如下：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L。自然pH。
[0048] PM液体培养基配方如下：葡萄糖10g，胰蛋白胨10g，酵母粉2g，KH2P04lg， K2HP04lg, MgS04 · 7H20 0. 02g, FeS04 · 7H20 0. 02g, ZnS04 · 7H20 0. 02g, MnS04 · 7H20 0. 02g, 用蒸馈水定容至1L。氯化钠3. 0g,蛋白胨2. 5g,琼脂粉17g,用蒸馈水定容至975mL,高压灭 菌，待其温度降到55°C时，加入lmL lMCaCl2，lmL 1M MgS04，lmL Smg.mL-1胆固醇（用无水 乙醇溶解），25mL 1M磷酸钾缓冲液（KH2P04108 . 3g，K2HP0435. 6g，用蒸馏水定容至1L。
[0049] 缓冲液 I :0· 5M NaH2P0419ml、0. 5M Na2P0481ml、NaCl 29. 3g，加水定容至 1L。
[0050] 缓冲液 II :0· 5M NaH2P0419ml、0. 5M Na2HP0481ml、NaCl 29. 3g 和咪唑 34g，定容至 lL〇
[0051] PBS缓冲液：8g氯化钠，0. 2g氯化钾，1. 44g磷酸氢二钠，0. 24g磷酸二氢钾，蒸馏 水定容至1L。
[0052] 苏云金芽孢杆菌YBT-1520胞晶混合物的制备方法：YBT-1520接种于PM液体培养 基28°C 200rpm摇床培养3天，8000rpm离心收集，冷冻干燥制成YBT-1520胞晶混合物。
[0053] 苏云金芽孢杆菌YBT-020胞晶混合物的制备方法：YBT-020接种于PM液体培养基 28°C 200rpm摇床培养3天，8000rpm离心收集，冷冻干燥制成YBT-020胞晶混合物。
[0054] 上述的苏云金芽孢杆菌YBT-1520是华中农业大学农业微生物重点实验室分离对 棉铃虫、小菜蛾等鳞翅目昆虫具有高毒的菌株。
[0055] 上述的苏云金芽孢杆菌YBT-020是华中农业大学农业微生物重点实验室分离对 线虫具有高毒的菌株。
[0056] 本实例中未作详细说明的分子实验方法，参照《分子实验指南》第三版，或者参照 试剂盒说明书进行。
[0057] 实施例1制备定点突变方法如下：
[0058] 用获取的 Bacillus thuringiensis subsp. tenebronis 9602 菌株几 丁质酶 Chi9602基因进行同源建模和分子对接，并将突变位点设计为50位色氨酸替换为丙氨酸。 涉及引物如下所示：
[0059] 引物 P1 :5' -CAGAGATCTGATTCACCAAAGCAAAGT-3'
[0060] Bgl II
[0061] 引物 P2 :5' -CAGCTGCAGCTAGTTTTCGCTAATGACG-3'
[0062] Pst I
[0063] 引物 P3 :5, -TGGGTACTTTCCTTCGGCGGGCGTTTACGGACGTAA-3'
[0064] 引物 P4 :5, -GCCGAAGGAAAGTACCCAACAATTTTTTGACTTTGC-3'
[0065] 以 Bacillus thuringiensis subsp. tenebronis 9602 菌株的总 DNA 为模板，使用 引物P1和P2,完成PCR反应。此PCR反应具体条件如下：
[0066] lOxPCRbuITcr 5 μΙ_ 25 mM Mg2- 5 μ? 上下游引物（1〇μΜ) ^ 1 μ? 10 mM dNTPs 2'uL 质粒 0.5 μι Γα^?ΝΑ 1 μ? 去离子水 加至50 pL
[0067] 循环体系如下：
[0068] 9￡?，5 min； 94 C； 1 min； 55 C, 40 see： 72'C, 90 see； ^72'C , 10 min 30个循环
[0069] 将扩增得到的chi9602片段用Bgl II和Pst I进行双酶切后，连接到同样用Bgl II和Pst I双酶切回收后的表达载体pTreHis B上。将此质粒命名为PMB332。
[0070] 以含有chi9602片段的pMB332为模板，采用重叠延伸PCR技术完成第50位氨基 酸的定点突变，获得几丁质酶突变酶基因。几丁质酶突变酶基因序列如SEQ ID N0. 2所示。 所述的重叠延伸PCR技术如图1所示。所获得突变序列回收后，使用Bgl II和Pst I进行 双酶切后，连接到用Bgl II和Pst I双酶切回收后的表达载体pTreHis B上。将此质粒命 名为PMB581。并对序列进行测序后，与chi9602基因进行比较。pMB581质粒为含有突变酶 基因的原核表达载体，其表达的突变酶命名为ChiW50A，氨基酸序列SEQ ID NO. 1所示。
[0071] 将含有突变酶ChiW50A基因的原核表达载体PMB581使用转化至宿主细胞大肠杆 菌 Escherichia coli T0P10 中。获得重组菌株 MB581
[0072] 挑取重组菌单菌落接种于5ml LB培养基中（含氨苄抗生素），37°C，155rpm/min 摇床培养过夜。按1 %的接种量转接入200ml LB培养基中（含氨苄抗生素），37°C，155rpm/ min摇床培养1. 5h左右至菌液稀薄，加入200 μ 1 IPTG，37°C，155rpm/min诱导培养6h。
[0073] 几丁质酶突变酶ChiW50A的亲和层析纯化：4°C，6000rpm/min离心5min收集菌 体，用20ml PBS(pH7.4)悬浮菌体，分装到50ml的离心管中。压力破碎细胞后12000rpm/ min离心20min，上清液备用。取2ml Ni柱用缓冲液I润洗三次，加入细胞破碎离心上清 液，4°C结合30min。结合液加入过滤柱中，用含咪唑10mM的缓冲液II洗脱杂蛋白。用含浓 度咪唑250mM/L的缓冲液II洗脱目的蛋白。
[0074] 苏云金芽孢杆菌几丁质酶Chi9602基因成功通过重叠延伸PCR进行定点突变、原 核表达载体的构建以及表达及纯化。获得与理论分子量大小相符的74. 5kDa表达产物，即 突变酶ChiW50A。结果见附图2。
[0075] 几丁质酶Chi9602和突变酶ChiW50A的酶性质分析。
[0076] 几丁质酶酶比活测定：1. 5mL离心管中加入500μ L的几丁质酶溶液，再加入 200 μ L2. 5 %的胶体几丁质溶液，PBS (ρΗ7. 4)补足至lmL，空白对照用500 μ LPBS (ρΗ7. 4)代 替纯化的几丁质酶溶液。37°C水浴反应lh，冷却后，12000rpm/min离心5min，取上lmL清加 入lmL DNS，沸水浴lOmin，冷却后测定535nm处的吸光值。一个单位的酶活定义为37°C下 lh产生1 μ mol NAG的酶量。
[0077] 几丁质酶稳定性测试：分别在不同的反应体系条件下，（pH为3、4、5、6、7、8和9 ; 温度为 25°C、30°C、35°C、37°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、70°C和 80°C )测定几丁质酶酶 比活。
[0078] 同样对突变酶ChiW50A进行测试，测试结果见附图3。从图中看出几丁质酶 Chi9602突变酶ChiW50A最适反应温度为37°C。几丁质酶Chi9602突变酶ChiW50A最适反 应口!1为7.0。该突变酶〇1丨15(^较原始酶〇1丨9602比活提高了62.3%。在？!19.0时，仍 然具有高的酶比活（54. 69U/mg)。将在昆虫肠道碱性环境中具有良好降解几丁质的作用。 [0079] 所述的2. 5%胶体几丁质溶液的配制方法如下：2克几丁质（粉末）用预冷的浓 盐酸45mL溶解，在磁力搅拌器上搅拌好，此时成黄色。搅拌2h后，放入冰箱4摄氏度，静置 24h。将盐酸混合液加入到300mL的50%的酒精（预冷好的），搅拌2h，此时为不透明的乳 白色溶液，4000转离心20分钟，看到乳白色沉淀，用蒸馏水反复洗pH至6. 5左右，或在离心 管中加水，搅拌，离心。最后加入40mL蒸馏水115°C，15min高压灭菌后保存。
[0080] 所述的DNS溶液的配制：称取6. 3g 3, 5-二硝基水杨酸，溶于262ml 2mol/L的 NaOH溶液，再将此溶液与500ml含有182g酒石酸钾钠的热水混合，加入5g重蒸酚和5g亚 硫酸钠，充分搅拌，待冷却后定容至1L。
[0081] 采用对峙法测定突变酶ChiW50A对水稻纹枯病菌生长的抑制实验如下：
[0082] 取直径为5mm的水稻纹枯病菌菌块接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA)平板中 央，28°C培养2天后，在距离菌丝边缘2cm处放置灭过菌的滤纸片，将制备的突变酶ChiW50A 和PBS对照分别滴在四周的滤纸片上，其中（a) PBS对照；(b) 2. 5 μ g的突变酶ChiW50A ; (c) 5. 0 μ g突变酶ChiW50A ; (d) 7. 5 μ g突变酶ChiW50A。28°C继续培养1天后，观察突变酶 ChiW50A对水稻纹枯病菌菌丝生长的抑制情况。见附图4。从图中看出几丁质酶Chi9602 突变酶ChiW50A对水稻纹枯病菌在PDA平板上生长有明显的抑制作用。
[0083] 突变酶ChiW50A与YBT-1520胞晶混合物复配杀棉铃虫二龄幼虫生测实验
[0084] 如下：
[0085] 称取2g YBT-1520胞晶混合物，加入制备突变酶ChiW50A，用10mM的PBS悬浮，使 突变酶ChiW50A终浓度为35 μ g/mL，样品总体积为20mL。对照加入BSA，其浓度为35 μ g/ mL;空白只含有YBT-1520,样品体积为20mL。送样测定。见附表1。结果显示：突变酶 ChiW50A与YBT-1520孢晶混合物以2000:1复配时，YBT-1520杀棉铃虫二龄幼虫的效价提 高了 1145个单位，达到了 4211个单位。
[0086] 表 1
[0087]
【权利要求】
1. 一种苏云金芽孢杆菌几丁质酶Chi9602的突变酶W50A，其特征在于：所述的突变酶 的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述突变酶理论分子量为74. 45kDa，属于糖基水解酶第 18家族，由几丁质酶催化域CCD (Lys42-Asp452)、 类纤连蛋白III型域Fn3D (Gln504-Asn558) 和几丁质酶结 合域CBD (Thr582_Asn646) 三部分构成；保守序列为"DGVDLDWE"，N末端结构域中含有一个由34个 氨基酸残基组成的信号肽序列 SP(Metl-Ala34) °
2. -种苏云金芽孢杆菌几丁质酶Chi9602的突变酶W50A，其特征在于：所述的编码基 因序列chiw50a如SEQ ID NO. 2所示；所述的突变酶基因长度为2031bp。
3. -种苏云金芽孢杆菌几丁质酶Chi9602的突变酶W50A的制备方法，其特征在于采用 以下步骤： (1) 对几丁质酶Chi9602基因序列进行同源建模和分子对接，选取50位色氨酸作为突 变位点； (2) 采用重叠延伸PCR进行定点突变，突变反应分为两步。第一步，扩增突变位点两端 的基因序列，得到相互之间有重叠片段的两组PCR产物；第二步，将两组PCR产物作为模板 进行下一轮PCR扩增，得到需要的目的片段，所述的目的片段不包含N端信号肽序列；设计 四条引物如下所示： 引物 P1 :5' -CAGAGATCTGATTCACCAAAGCAAAGT-3' Bgl II 引物 P2 :5' -CAGCTGCAGCTAGTTTTCGCTAATGACG-3' Pst I 引物 P3 :5' -TGGGTACTTTCCTTCGGCGGGCGTTTACGGACGTAA-3' 引物 P4 :5' -GCCGAAGGAAAGTACCCAACAATTTTTTGACTTTGC-3' 以 Bacillus thuringiensis subsp.tenebronis 9602 菌株的总 DNA 为 PCR模板，使用 引物P1和P2完成第一轮PCR反应，将扩增得到的chi9602片段用Bgl II和Pst I进行双 酶切后，连接到同样用Bgl II和Pst I双酶切回收后的表达载体pTrcHis B上。将此质粒 命名为PMB332 ; 以含有chi9602片段的pMB332为模板，采用重叠延伸PCR技术第一轮PCR反应，完成第 50位氨基酸的定点突变，获得几丁质酶突变酶基因 W50A ;所获得突变序列回收后，使用Bgl II和Pst I进行双酶切，连接到同样用Bgl II和Pst I双酶切回收后的表达载体pTrcHis B上，将此质粒命名为pMB581 ; (3) 对质粒序列进行测序后，与chi9602基因进行比较，pMB581质粒为含有突变酶基因 的原核表达重组载体，其突变酶命名为ChiW50A，其氨基酸序列SEQ ID NO. 1所示； (4) 用包含上述突变酶基因的重组载体转化宿主细胞，制备重组菌株，其中重组载体中 原核表达载体为pTrcHis B，宿主细胞为大肠杆菌Escherichia coli T0P10; (5) 培养重组菌株，诱导突变酶ChiW50A表达； (6) 将表达后的突变酶ChiW50A回收并采用亲和层析纯化制备突变酶ChiW50A。
4. 一种苏云金芽孢杆菌几丁质酶Chi9602的突变酶W50A的用途，应用于植物的生物防 治病虫害，其特征在于：（1)对于水稻纹枯病菌具有明显抑制作用；（2)与苏云金芽孢杆菌 YBT-1520孢晶混合物复配杀棉铃虫具有增效作用；（3)与苏云金芽孢杆菌YBT-020孢晶混 合物复配杀线虫具有明显增效作用。
【文档编号】A01P5/00GK104232607SQ201410441598
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月1日 优先权日:2014年9月1日
【发明者】倪红, 孙孝文, 李林, 曾思泉 申请人:湖北大学