卡特兰初代诱导培养基及外植体预处理方法
【专利摘要】本发明公开了一种卡特兰初代诱导培养基及外植体预处理方法。本发明所述的卡特兰初代诱导培养基，其以改良MS培养基为基础培养基，并添加有柠檬酸、水杨酸、硝酸镧、6-BA、NAA、琼脂粉、蔗糖和硅胶，能够有效减少卡特兰外植体褐化。
【专利说明】卡特兰初代诱导培养基及外植体预处理方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及兰花组织培养【技术领域】，特别是涉及一种卡特兰初代诱导培养基及外 植体预处理方法。
【背景技术】
[0002] 卡特兰，又名嘉德丽亚兰（Cattleya Hybrida)，因其花朵硕大，色泽艳丽，富有美 感，品种众多，有的品种还具有芳香气味，而被誉为"洋兰之王"，具有极高的欣赏价值和经 济价值。
[0003] 卡特兰的繁殖可以通过种子繁殖、分株繁殖和组织培养。由于卡特兰种子在自然 条件下极难萌发，分株法繁殖率低，难以达到大规模生产的目的，而组织培养法是目前卡特 兰大规模生产的主要方法。然而，卡特兰的外植体在组织培养过程中极易褐化坏死，是原球 茎诱导成功的一大障碍，也是制约卡特兰组培快速繁殖的关键。
[0004] 针对卡特兰外植体褐化问题，现有的卡特兰初代诱导培养基通常在1/4MS培养基 的基础上，添加2. 5?3mg/L的6-BA、0. 15?0. 2mg/L的NAA、6?7g/L的琼脂粉、25? 30g/L的蔗糖，以及0. 1 %?0. 2 %的活性炭。活性炭对酚类物质有吸附作用，能减少酚类物 质被氧化为醌类物质，减少褐化现象，然而，活性炭的吸附作用是没有选择性的，在吸附酚 类物质的同时，亦会吸附培养基中的其它营养成分，对外植体的诱导分化产生负面影响。
【发明内容】
[0005] 基于此，有必要针对卡特兰组织培养过程中外植体褐化的问题，提供一种能有效 减少卡特兰外植体褐化的卡特兰初代诱导培养基。
[0006] 此外，有必要针对卡特兰组织培养过程中外植体褐化的问题，提供一种能有效减 少卡特兰外植体褐化的卡特兰外植体预处理方法。
[0007] -种卡特兰初代诱导培养基，其以改良MS培养基为基础培养基，并添加有柠檬 酸、水杨酸、硝酸镧、6-苄氨基腺嘌呤出-BA)、萘乙酸（NAA)、琼脂粉、蔗糖和硅胶。
[0008] 在其中一个实施例中，所述改良MS培养基中，二水氯化钙（CaCl2 ·2Η20)的浓度为 230mg/L，维生素 Bl的浓度为lmg/L，其余成分及其浓度与标准MS培养基相同。
[0009] 在其中一个实施例中，柠檬酸的浓度为30?80mg/L，水杨酸的浓度为50? 150mg/L，硝酸镧的浓度为3?7mg/L，6_BA的浓度为2. 5?3mg/L，NAA的浓度为0· 15? 0. 2mg/L，琼脂粉的浓度为6?7g/L，蔗糖浓度为25?30g/L，硅胶的浓度为1?5g/L。
[0010] 在其中一个实施例中，柠檬酸的浓度为50mg/L，水杨酸的浓度为100mg/L，硝酸镧 的浓度为5mg/L，6-BA的浓度为3mg/L，NAA的浓度为0. 2mg/L，琼脂粉的浓度为6g/L，蔗糖 浓度为30g/L，硅胶的浓度为3g/L。
[0011] 在其中一个实施例中，所述的硅胶为固体，呈颗粒状、管状或棒状，其均匀镶嵌于 经凝固后的卡特兰初代诱导培养基中。
[0012] 在其中一个实施例中，所述卡特兰初代诱导培养基的pH值为5. 5。
[0013] 一种卡特兰外植体预处理方法，包括以下步骤：取健康、生长良好的卡特兰侧芽作 为外植体，于2?5°C低温处理12?24小时，经灭菌处理后将侧芽接种于本发明所述的卡 特兰初代诱导培养基中，然后置于人工气候箱中，在温度为15?20°C、湿度为80?90%、 光照强度为1800?20001u X、光暗周期为12h光照/12h黑暗的条件下进行培养，诱导出原 球茎。
[0014] 在其中一个实施例中，所述的灭菌处理包括以下步骤：在超净工作台中，取出低温 处理后的侧芽，除去侧芽外的苞片，侧芽留一片叶子，用70%的酒精擦洗几秒，用无菌水冲 洗干净后，置于质量浓度为〇. 1 %的氯化汞溶液中灭菌5?10分钟，再用无菌水冲洗干净。
[0015] 本发明的卡特兰初代诱导培养基中，采用改良的MS培养基，通过降低钙离子的浓 度，能够减轻外植体褐化，并通过提高维生素 Bl的含量，竞争性抑制外植体内单酚酶和二 酚酶的活性，减少酚类物质氧化成醌类物质，从而减缓褐化现象的出现；此外，培养基中添 加的柠檬酸具有抗氧化作用，能有效减缓外植体的氧化酶促反应，水杨酸则能够提高植物 组织自身的抗氧化能力，增加叶绿素含量，两者同时作用，能显著降低外植体褐化程度，使 褐化率从17. 03%下降到3. 88% ;硝酸镧中的稀土元素"镧"，能够加快外植体诱导出原球 茎，促使萌动时间从42天缩短为28天，同时亦能有效抑制褐化现象，提高外植体的成活率， 提高卡特兰组织培养的生产效率；6-BA和NAA为广谱性植物生长调节剂，能够促进卡特兰 外植体的萌发；硅胶具有特异性吸附作用，能够吸附植物组织的酚类、醌类物质，减少酶促 反应的底物，抑制褐化现象的发生，但对培养基中的营养成分没有吸收作用，不会影响组织 生长；以琼脂作为固体培养平台，为植材提供养分、水分与透气的效用，并以蔗糖作为碳源， 在成活率以及萌发率不受影响的前提下，降低了培养基的制备成本。
[0016] 本发明的卡特兰初代诱导培养基中，柠檬酸的浓度优选为30?80mg/L，水杨酸的 浓度优选为50?150mg/L，若朽 1檬酸、水杨酸的用量过低，抗氧化作用差，若朽1檬酸、水杨酸 的用量过高，则会抑制植株生长，降低萌发率；硝酸镧的浓度优选为3?7mg/L，若其用量过 低，促进萌发的效果不理想，若其用量过高，则会抑制植株生长，增加萌发所需时间。
[0017] 本发明的卡特兰初代诱导培养基中，采用固体硅胶，均匀镶嵌于经固化后的培养 基中，使之与培养基充分接触；培养结束后，固体硅胶可从培养基中分离回收，通过乙醇洗 涤所吸附的物质后，可以循环使用，能够降低培养基的成本，提高产品的市场竞争力。
[0018] 本发明的卡特兰初代诱导培养基，将pH值控制在5. 5,呈弱酸性环境，能够抑制褐 变过程的发生，从而降低褐变率。
[0019] 本发明的卡特兰初代诱导培养基，通过生化（柠檬酸、水杨酸、硝酸镧等）和物理 (硅胶、低温处理、暗培养等）的双重作用，能有效抑制卡特兰外植体褐化现象的发生，提高 外植体的成活率，以及缩短外植体的萌发时间。
[0020] 本发明的卡特兰外植体预处理方法，通过对外植体在2?5°C下进行低温处理 12?24小时，能够有效减少外植体分泌酚类、醌类物质，从而减少酶促反应底物，抑制褐化 现象的发生；接种于培养基后置于人工气候箱中，在温度为15?20°C、湿度为80?90%、 光照强度为1800?20001u X、光暗周期为12h光照/12h黑暗的条件下进行培养，若温度过 高、光照过强或光照时间过长，会提高多酚氧化酶（PPO)的活性，促进多酚类物质的氧化， 而加速外植体褐变，同时，亦会使植物生陈代谢加快，使CO 2浓度提高，环境中的CO2向细胞 内扩散，细胞内CO广增多，与细胞膜上的CO广结合，使有效CO广减少，导致细胞内膜系统瓦 解，酚类物质与PPO相互接触，加剧褐变。
【具体实施方式】
[0021] 实施例一：本发明所述的卡特兰初代诱导培养基的制备
[0022] 按照表1所示的配方，分别称取改良MS培养基中的各成分，置于三角瓶中，加入适 量纯化水，搅拌溶解，定容至1L，制得改良MS培养基，备用。
[0023] 表1改良MS培养基的成分及其用量
【权利要求】
1. 一种卡特兰初代诱导培养基，其特征在于：以改良MS培养基为基础培养基，并添加 有柠檬酸、水杨酸、硝酸镧、6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、琼脂粉、蔗糖和硅胶。
2. 根据权利要求1所述的卡特兰初代诱导培养基，其特征在于：所述改良MS培养基 中，二水氯化钙的浓度为230mg/L，维生素 B1的浓度为lmg/L，其余成分及其浓度与标准MS 培养基相同。
3. 根据权利要求1所述的卡特兰初代诱导培养基，其特征在于：柠檬酸的浓度为30? 80mg/L，水杨酸的浓度为50?150mg/L，硝酸镧的浓度为3?7mg/L，6-节氨基腺噪呤的浓 度为2. 5?3mg/L，萘乙酸的浓度为0. 15?0. 2mg/L，琼脂粉的浓度为6?7g/L，蔗糖浓度 为25?30g/L，硅胶的浓度为1?5g/L。
4. 根据权利要求3所述的卡特兰初代诱导培养基，其特征在于：柠檬酸的浓度为50mg/ L，水杨酸的浓度为100mg/L，硝酸镧的浓度为5mg/L，6-苄氨基腺嘌呤的浓度为3mg/L，萘乙 酸的浓度为〇. 2mg/L，琼脂粉的浓度为6g/L，蔗糖浓度为30g/L，硅胶的浓度为3g/L。
5. 根据权利要求1至4的其中之一所述的卡特兰初代诱导培养基，其特征在于：所述 的硅胶为固体，呈颗粒状、管状或棒状，其均匀镶嵌于经凝固后的卡特兰初代诱导培养基 中。
6. 根据权利要求1至4的其中之一所述的卡特兰初代诱导培养基，其特征在于：所述 卡特兰初代诱导培养基的pH值为5. 5。
7. -种卡特兰外植体预处理方法，包括以下步骤：取健康、生长良好的卡特兰侧芽作 为外植体，于2?5°C低温处理12?24小时，经灭菌处理后将侧芽接种于本发明所述的卡 特兰初代诱导培养基中，然后置于人工气候箱中，在温度为15?20°C、湿度为80?90%、 光照强度为1800?20001u X、光暗周期为12h光照/12h黑暗的条件下进行培养，诱导出原 球茎。
8. 根据权利要求7所述的卡特兰外植体预处理方法，其特征在于，所述的灭菌处理包 括以下步骤：在超净工作台中，取出低温处理后的侧芽，除去侧芽外的苞片，侧芽留一片叶 子，用70 %的酒精擦洗几秒，用无菌水冲洗干净后，置于质量浓度为0. 1 %的氯化汞溶液中 灭菌5?10分钟，再用无菌水冲洗干净。
【文档编号】A01H4/00GK104285790SQ201410508438
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月28日 优先权日:2014年9月28日
【发明者】陈永得 申请人:遵义县宇宙星空观光旅游休闲农业有限公司