适用于多基因型的豇豆高效再生体系的建立方法
【专利摘要】本发明公开了适用于多基因型的豇豆高效再生体系的建立方法，所述方法包括前处理、不定芽的诱导、继代培养、不定芽的伸长、生根培养、炼苗和移栽步骤。在前处理过程中，所用植物生长调节剂为浓度为1-4mg/L的6-BA或浓度为0.001-0.1mg/L的TDZ；在不定芽的诱导过程中，所用植物生长调节剂为6-BA和KT组合或KT和IBA组合，6-BA的浓度为0.8-1.2mg/L，KT的浓度为0.02-2mg/L，IBA的浓度为0.15-0.25mg/L；在不定芽的伸长过程中，所用植物生长调节剂为6-BA和IBA，6-BA的浓度为0.5mg/L，IBA的浓度为0.1-0.3mg/L。本发明不仅适应于多基因型豇豆的再生培养，而且具有诱导率高、不定芽诱导数目多、不定芽长、不定芽干重高以及实施条件不苛刻的优点，具有良好的推广前景。
【专利说明】适用于多基因型的豇豆高效再生体系的建立方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，特别涉及适用于多基因型的豇豆高效再生体系的建立 方法。
【背景技术】
[0002] 豇豆是重要的蔬菜作物，在我国栽培历史悠久，除西藏等高寒地区外均有种植，以 南方各省市栽培较多。豇豆营养价值很高，其籽粒富含蛋白质（占干物质总量25%)、维生素、 叶酸及钾、镁、铁等矿质元素，并且还含有人体所必需的赖氨酸与色氨酸。
[0003] 传统豇豆栽培种的产量很低，对虫害及真菌病害高度易感是导致其产量低的一个 主要因素。豇豆在田间生长期间及贮藏期间共有31种虫害和超过20种病害，仅虫害每年 就可导致20%_60%的损失。对于病虫害的防治，人们主要采取使用化学药剂、加强农业管理 措施和培育抗病虫害新品种等方式。但长期使用化学药剂，产生一系列的严重后果：病虫产 生耐药性，药剂的大量使用对环境造成严重危害，威胁人类安全，"毒豇豆"事件触目惊心。 农业防治耗费大量的人力物力却收效甚微。由于自然界缺乏有效的抗病虫种质资源及杂交 不亲和性等，通过常规育种方法选育抗性品种较为困难。
[0004] 近年来，随着生物技术的飞速发展，尤其是植物基因工程技术的日趋成熟，为植物 的品种改良提供了新的途径。自1983年第一个转基因植物问世以来，一些天然的抗虫基因 (如Bt基因、蛋白酶抑制剂及凝集素等）被成功地转入一些作物中。提高豇豆产量、增强抗 虫性最有效的途径就是通过基因工程将抗虫基因从其它材料中转入豇豆栽培品种，对其进 行遗传改良。在众多转基因技术中，农杆菌介导法以其费用低、拷贝数低、转育周期短以及 能转化较大片段等独特优点被广泛应用。而以农杆菌介导法获得转基因材料的前提是要建 立一个高效稳定的再生受体系统。因此，建立豇豆高效再生体系可以为豇豆遗传转化体系 的建立奠定基础。
[0005] 利用器官发生途径建立豇豆再生体系有多种，主要有子叶节、子叶、真叶、上胚轴、 下胚轴、茎尖、子叶节薄细胞层、茎尖分生组织和胚尖等。其中，对子叶节再生能力研究比较 多，如李晓梅利用子叶节作为外植体获得了较为理想的不定芽诱导率。然而，国内外对豇豆 组织培养与植株再生研究还存在许多问题。豇豆再生能力存在基因依赖性，不同基因型之 间再生能力存在显著差异，至今还没有建立一个适合不同基因型的豇豆再生体系。同时，主 芽的生长一般来说更好，不定芽的干重对于再生体系的优良也至关重要。然而，目前对如何 提商王牙的数量和提商不定牙的干重还鲜见报道。
[0006] 因此，一种适用于多种基因型、可提高主芽数量并提高不定芽干重的豇豆再生体 系的构建方法亟待开发。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种适用于多基因型的豇豆高效再 生体系的建立方法。构建方法包括以下步骤： 1) 前处理：将豇豆种子进行灭菌，然后放入含6-BA或TDZ的MSB5培养基进行培养，培 养时间为5天，培养温度为23-27°C，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天，6-BA的浓 度为 l-4mg/L，TDZ 的浓度为 0? 001-0. lmg/L ; 2) 不定芽的诱导：切取带一个子叶的子叶节，然后放入含6-BA和KT或含KT和IBA 的MSB5培养基进行培养，培养时间为7天，培养温度为23-27°C，光照强度为3000 lx，光照 时间为16 h/天，6-BA的浓度为0. 8-1. 2mg/L，KT的浓度为0. 02-0. lmg/L，IBA的浓度为 0.15-0. 25mg/L ； 3) 继代培养：将步骤2)所得物的不定芽的腋芽切下，弃掉，然后将剩余物接种于含 6-BA和KT或含KT和IBA的MSBJ§养基进行培养，培养时间为7天，培养温度为23-27°C， 光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天； 4) 不定芽的伸长：将步骤3)所得物放入含6-BA和IBA的MSB5培养基进行培养，培养 时间为14天，培养温度为23-27°C，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天，6-BA的浓度 为 0? 5mg/L，IBA 的浓度为 0? 1-0. 3mg/L ; 5) 生根培养：将步骤4)所得物的不定芽切下，接种在含生根培养基的培养瓶上培养， 培养时间为14天，培养温度为保持在23-27°C，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天， 所述生根培养基为MS培养基添加30g/L蔗糖和7g/L琼脂，pH=5. 8 ; 6) 炼苗：选取经步骤5)培养后的根长为4-5 cm的健壮小苗，将培养瓶的盖子先拧松 放置2天，再半开2天，然后再全开2 d，半开和全开盖子期间需要不断补充水分； 7) 移栽：将炼苗完成后的植株拔起，用水洗净根部培养基，移栽到装有泥炭土、珍珠岩、 草木灰和腐叶土基质的营养钵中，在23-27°C下，套上保鲜袋置于人工气候箱中保湿培养2 d，1-2周后再移到室外进行培养。
[0008] 所述的灭菌过程为：在超净工作台上，对豇豆种子先用75%的酒精浸泡消毒lmin， 再用0. 1%升汞浸泡消毒5min，最后用无菌水冲洗5次。
[0009] 在切取带一个子叶的子叶节时，节点距上胚轴0. 5 mm,距下胚轴5 mm。
[0010] 所述营养钵中泥炭土、珍珠岩、草木灰和腐叶土基质的质量比为1:1:1:1。
[0011] 优选的，步骤1)中的MSB5培养基含有6-BA，6-BA的浓度为3mg/L。当在步骤1) 中的6-BA的浓度为3mg/L时，不定芽的诱导率为100% ;当6-BA浓度小于3. 0 mg/L时，不 定芽诱导数随6-BA的浓度升高而增加，而当6-BA浓度大于3. Omg/L时，不定芽诱导数会出 现小幅下降，选择6-BA浓度为3. Omg/L可获得最好的诱导效果。
[0012] 优选的，步骤2)中的MSB5培养基含有6-BA和KT，6-BA的浓度为I. Omg/L，KT的 浓度为〇? 〇6mg/L。当6-BA为L 0 mg/L，KT浓度小于0? 06 mg/L时，不定芽数量以及不定 芽主芽数量随KT浓度升高而增加，当6-BA的浓度为I. Omg/L，KT的浓度为0. 06mg/L时，不 定芽数量以及不定芽主芽数量达到最多。
[0013] 优选的，步骤4)中的MSB5培养基中，6-BA的浓度为0. 5mg/L，IBA的浓度为0. 2mg/ L。当6-BA的浓度为0. 5mg/L，IBA的浓度小于0. 2mg/L时，不定芽长度、主芽长度、不定芽鲜 重和不定芽干重随IBA的浓度升高而相应增长和增加。当6-BA的浓度为0. 5mg/L，IBA的 浓度为〇. 2mg/L时，不定芽长度和主芽长度达到最长，不定芽鲜重和不定芽干重达到最高。 [0014] 本发明具有如下有益效果： 1、适用于多个基因型，有较大推广前景； 2、 不定芽诱导率高达95%以上，不定芽诱导数多，最高可达12.91个； 3、 不定芽鲜重和不定芽干重高，生长良好的不定芽有利于之后遗传转化体系的建立； 4、 实施步骤简单，实施条件不苛刻。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1经过前处理后的无菌苗； 图2带一个子叶的子叶节； 图3诱导培养后的不定芽； 图4切掉腋芽的外植体； 图5伸长培养后的不定芽； 图6生根培养后的不定根； 图7炼苗结束后的再生苗； 图8移栽苗。
【具体实施方式】
[0016] 下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用 于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练 人员根据上述
【发明内容】
所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0017] 实施例1 选取大小均匀、饱满的豇豆种子，在超净工作台上先用75%的酒精浸泡消毒lmin，再用 〇. 1%升汞浸泡消毒5min，再用无菌水冲洗5次，然后置于培养皿内的无菌滤纸上，用消毒 后的镊子将种子接种在培养基上，每瓶接种10粒种子。将豇豆种子放入含6-BA或TDZ的 MSB5培养基进行培养，培养时间为5天，培养温度为25°C，光照强度为3000 lx，光照时间为 16 h/天。再于含6-BA和KT或含KT和IBA的MSB5培养基进行培养，培养时间为7天， 培养温度为23-27°C，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天，设6组实验组，第一实验 组中，采用6-BA与KT组合，6-BA的浓度为0. 8mg/L，KT的浓度为0. 02mg/L，第二实验组中， 采用6-BA与KT组合，6-BA的浓度为I. Omg/L，KT的浓度为0. 06mg/L ;第三实验组中，采用 6-BA与KT组合，6-BA的浓度为I. 2mg/L，KT的浓度为0. lmg/L ;第四实验组中，采用KT和 IBA组合，KT的浓度为0? 02mg/L，IBA的浓度为0? 15mg/L ;第五实验组中，采用KT和IBA 组合，KT的浓度为0. 06mg/L，IBA的浓度为0. 20mg/L ;第六实验组中，采用KT和IBA组合， KT的浓度为0. lmg/L，IBA的浓度为0. 25mg/L ;实验结果取六组实验组数据平均值。
[0018] 6-BA和TDZ前处理对不定芽诱导的影响见表1。
[0019] 表 1
【权利要求】
1. 适用于多基因型的豇豆高效再生体系的建立方法，其特征在于：包括如下步骤： 1) 前处理：将豇豆种子进行灭菌，然后放入含6-BA或TDZ的MSB5培养基进行培养，培 养时间为5天，培养温度为23-27°C，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天，6-BA的浓 度为 l-4mg/L，TDZ 的浓度为 0? 001-0. lmg/L ; 2) 不定芽的诱导：切取带一个子叶的子叶节，然后放入含6-BA和KT或含KT和IBA 的MSB5培养基进行培养，培养时间为7天，培养温度为23-27°C，光照强度为3000 lx，光照 时间为16 h/天，6-BA的浓度为0. 8-1. 2mg/L，KT的浓度为0. 02-0. lmg/L，IBA的浓度为 0.15-0. 25mg/L ； 3) 继代培养：将步骤2)所得物的不定芽的腋芽切下，弃掉，然后将剩余物接种于含 6-BA和KT或含KT和IBA的MSBJ§养基进行培养，培养时间为7天，培养温度为23-27°C， 光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天； 4) 不定芽的伸长：将步骤3)所得物放入含6-BA和IBA的MSB5培养基进行培养，培养 时间为14天，培养温度为23-27°C，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天，6-BA的浓度 为 0? 5mg/L，IBA 的浓度为 0? 1-0. 3mg/L ; 5) 生根培养：将步骤4)所得物的不定芽切下，接种在含生根培养基的培养瓶上培养， 培养时间为14天，培养温度为保持在23-27°C，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/天， 所述生根培养基为MS培养基添加30g/L蔗糖和7g/L琼脂，pH=5. 8 ; 6) 炼苗：选取经步骤5)培养后的根长为4-5 cm的健壮小苗，将培养瓶的盖子先拧松 放置2天，再半开2天，然后再全开2 d，半开和全开盖子期间需要不断补充水分； 7) 移栽：将炼苗完成后的植株拔起，用水洗净根部培养基，移栽到装有泥炭土、珍珠岩、 草木灰和腐叶土基质的营养钵中，在23-27°C下，套上保鲜袋置于人工气候箱中保湿培养2 d，1-2周后再移到室外进行培养。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)所述的灭菌过程为：在超净工作 台上，对豇豆种子先用75%的酒精浸泡消毒lmin,再用0. 1%升萊浸泡消毒5min,最后用无 菌水冲洗5次。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中，在切取带一个子叶的子叶节 时，节点距上胚轴0. 5 mm,距下胚轴5 mm。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤7)所述营养钵中泥炭土、珍珠岩、草 木灰和腐叶土基质的质量比为1:1:1:1。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中的MSB5培养基含有6-BA，6-BA 的浓度为3mg/L ;步骤2)中的MSB5培养基含有6-BA和KT，6-BA的浓度为1. Omg/L，KT的浓 度为0? 06mg/L ;步骤4)中的MSB5培养基中，6-BA的浓度为0? 5mg/L，IBA的浓度为0? 2mg/ L〇
【文档编号】A01H4/00GK104381130SQ201410555006
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月20日 优先权日:2014年10月20日
【发明者】唐懿, 李焕秀, 孙国超, 汪志辉, 夏惠, 赖云松, 王迅, 吕秀兰, 涂利华, 黄志
申请人:四川农业大学