一株新型黄丝藻及其培养与应用的制作方法

本发明涉及一株新的黄丝藻及其培养与应用，具体地，本发明涉及一株高油脂含量的黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)，和将所述藻株用于大规模培养和用于生产生物燃油、饲料、食品、护肤品、二氧化碳减排、废气处理和/或废水处理中的应用。
背景技术：
：随着化石能源储量的锐减以及环境问题的日益突出，开发可再生清洁能源对于缓解能源危机、环境恶化具有多重意义。生物能源较之其他可再生能源，具有来源丰富、易于储藏运输、二次污染少等特点。然而，以玉米、大豆、甘蔗等为原料的传统生物能源因涉及粮食安全问题而备受争议，寻找一种新的生物资源以可持续地生产环境友好的生物燃料已成为当务之急。微藻是一类在自然界广泛分布、种类繁多的低等植物，因其具有个体小、光合效率高、生长迅速、环境适应性强、油脂含量高等特点，被认为是生产生物燃料最具潜力的生物资源。另外，微藻在生长过程中通过光合作用固定二氧化碳，同时高效吸收水体中的氮、磷等营养物质，因此其在废气、废水处理领域也具有一定潜力。美国国家可再生能源实验室于19世纪70年代探索了利用微藻生产生物燃料的可行性，筛得300余株生长迅速、油脂含量高的微藻。近年来，我国也陆续开展了一系列相关领域的研究，取得了显著成就。然而，虽然微藻种类繁多，但不同种类积累不同的代谢产物，大多数微藻在正常的生长条件下细胞的含油量一般在10-30％，远不能满足生物燃油(主要是生物柴油)生产的需求，并且微藻的大规模培养水平有限，这使得微藻生物柴油的价格居高不下，成为制约微藻生物柴油工业化生产的瓶颈。因此，从繁多的微藻中筛选出油脂含量高的微藻，筛选提高微藻油脂含量及品质的培养方法，是目前微藻研究的热点之一。黄丝藻是一类丝状黄藻，自然生长于池塘、溪流等水体中，目前关于黄丝藻的研究记载很少，一般认为其油脂产量低，生长速度慢(Mercer，E.I.，R.A.London，I.S.A.Kent，andA.J.TaylorSterols，sterolestersandfattyacidsofBotrydiumgranulatum，TribonemaaequaleandMonodussubterraneus.Phytochemistry.1974，13：845-852)。本发明的申请人在专利“一种制备黄丝藻生物油的方法及由其制备的黄丝藻生物油”(CN103960117A)中设计了生产高油脂含量黄丝藻的培养工艺和加工黄丝藻生产生物油的工艺，可使黄丝藻的生物质产率最高为65g/m2/天，油脂含量最高为62％(质量分数)，生物油 产率达到24.5-25.9g/m2/天。但该专利中所使用的藻株为普通的黄丝藻藻株或购买自国外藻种库的藻株，普通的黄丝藻藻株其生物质产率和生物油产率由于受所采用藻株的限制，产率难以再进一步的提高；而购买自国外藻种库的藻株，未来实现商业化应用需获得授权，难以实现产业自主性，而且经济成本极高，限制了其产业化应用。因此，目前亟需开发获得一种油脂含量高，适于进行工业化规模生产的新型黄丝藻藻株。技术实现要素：针对上述现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一株新的高油脂含量的黄丝藻及其培养方法。本发明的另一目的是提供该黄丝藻在生产生物燃油、棕榈油酸、饲料、食品、护肤品、心脑血管疾病的治疗药物、二氧化碳减排、废气处理和/或废水处理中的应用。为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：一株高油脂含量的黄丝藻，该藻株命名为黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)，已于2015年5月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101，保藏编号为CGMCCNo.10488。所述黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)基因组包括一个或多个选自由下列序列组成的组中的核酸序列：SEQIDNO.1(18S)，SEQIDNO.2(ITS1)，SEQIDNO.3(ITS2)。所述藻株的形态特征为：藻体为不分枝的丝状体，细胞呈圆柱形或腰鼓形，长10～15μm，宽3～5μm；细胞壁呈“H”形，细胞内含1～3个周生、盘状或带状的色素体，单核；细胞颜色为黄绿色或绿色。本发明还提供了黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)用于大规模培养的应用。培养所述藻株的条件为：藻株的接种生物量为0.1～0.2g/L，通气量为0.05～0.5vvm，通入气体中二氧化碳的含量为1.5-5％，硝酸钠浓度为0～3g/L，磷酸氢二钾浓度为0～0.095g/L，温度为4～35℃，光照强度为10～1000μmolphotonsm-2s-1，培养时间为18-20天。在本发明的一些实施方式中，黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)可以在一定的培养装置和合适的外部环境控制下，进行快速的生长繁殖。所用术语“一定的培养装置”可以是密闭式光生物反应器(例如玻璃气泡柱反应器)、开放式跑道培养池或生物膜培养装置(如半干固态贴壁培养装置(CN201210051158.2))，其中上述装置可按照次序串联使用或单独使用。所用术语“合适外部环境”是指适宜黄丝藻生长的温度、光照、营养盐和二氧化碳等因素的综合。本发明还提供了黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)在生产生物柴油、棕榈油酸、饲料、食品、护肤品、心脑血管疾病的治疗药物、二氧化碳减排、废气处理和/或废水处理中的应用。所述黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)在生物柴油生产中的应用，以黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)为生物柴油原料，通过微藻的生长积累油脂；其脂肪酸组成中C16-C18脂肪酸含量为总脂肪酸的85％。C16-C18脂肪酸为生产生物柴油的理想来源，因此该藻株特别适于生物燃料尤其是生物柴油的生产。所述黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)在棕榈油酸生产中的应用，以黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)为原料，通过微藻的生长积累油脂；油脂中棕榈油酸(C16:1ω7)的含量不低于总脂肪酸含量的45％。所述黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)在饲料生产中的应用，由于黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)具有生长速度快、生物量高、富含油脂的特点，因此，可以将其应用于生产水产品饵料、动物饲料等方面。所述黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)在保健品、食品生产中的应用，其不饱和脂肪酸含量为总脂肪酸的65％。不饱和脂肪酸具有调节血脂、清理血脂、增强免疫力、保护视力的作用，因此该藻株特别适于保健品、食品等方面的开发应用。所述黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)在护肤品、心脑血管疾病治疗药物中的应用，由于黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)油脂中富含棕榈油酸(C16:1ω7)，因此，该藻株特别适于皮肤护理和心脑血管疾病等方面的开发应用。所述黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)在生长过程中可大量吸收二氧化碳产生生物质，同时，可在培养前3天吸收或吸附水体中0.75g/L的硝酸钠以及0.08g/L的磷酸氢二钾。由此可见，该藻株具有固定二氧化碳、净化富营养化水体的能力，适于二氧化碳减排、废气处理、废水处理等方面的开发应用。本发明进一步的提供了一种黄丝藻面膜，以黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)藻粉或其提取物为有效成分。具体的，该黄丝藻面膜的原料组成为：黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)藻粉或其提取物5-10份，蜂蜜4-6份，丁二醇0.5-1.5份，蒸馏水45-55份，酸奶1-3份。制备方法为：将粉碎的黄丝藻藻粉或其乙醇提取物、蜂蜜、丁二醇，加入蒸馏水加热至50℃至60℃，搅拌30分钟，待冷却至40℃，加入酸奶，维持温度在35℃至40℃，搅拌20分钟。待冷却后即制得黄丝藻面膜。本发明的有益效果：(1)本发明的藻株具有生长快、生物量高、油脂产率高、易于规模化培养且培养成本低的优点，适于产业化应用。研究表明：以BG-11培养基室内培养18天后生物量干重可达到6.1g/L，此时，其油脂含量为干重的59.9％，油脂产量为3656mg/L，油脂产率为203.1mg/(L·d)。以生物膜培养方式进行培养时，12天后单位面积的生物量产量可达390～1125g/m2，生物量产率为32.5～93.8g/(m2·d)，此时，其油脂含量为干重的51.8％，最高油脂产量为582.8g/m2，最高油脂产率为48.6g/(m2·d)。以BG-11培养基户外3000L开放池培养20天后生物量干重可达到2.5～4g/L，单位面积的生物量产率可达15～25g/(m2·d)。其脂肪酸组成中C16～C18脂肪酸含量为总脂肪酸的85％以上，不饱和脂肪酸含量为总脂肪酸的65％以上。(2)本发明的藻株以溶气气浮(DAF)进行采收时，在不添加任何絮凝剂的情况下，其采收效率可达到99％以上。由此可见，该藻株具有易于采收、采收成本低、避免絮凝添加剂、不影响下游产品加工的优点，适于产业化应用。附图说明图1为黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)的显微镜检图；图2为黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)的18S序列进化树；图3为黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)在不同硝酸钠浓度下的生长曲线；图4为黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)在不同磷酸氢二钾浓度下的生长曲线；图5为黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)在不同硝酸钠浓度下吸收硝酸根的状况；图6为黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)在不同磷酸氢二钾浓度下吸收磷酸根的状况；图7为黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)在户外3000L开放池培养的生长曲线；图8为黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)在不同硝酸钠浓度下的油脂积累状况；图9为黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)在不同磷酸氢二钾浓度下的油脂积累状况。具体实施方式结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。实施例1：藻株Tribonemasp.PD2的分离、纯化、鉴定1材料1.1分离源青岛平度市郊区河水。1.2培养基BG-11培养基：NaNO31.5g/L，MgSO4·7H2O75mg/L，CaCl2·2H2O36mg/L，柠檬酸6mg/L，Na2EDTA1mg/L，柠檬酸铁铵6mg/L，Na2CO320mg/L，K2HPO4·3H2O47.5mg/L，H3BO32.86mg/L，ZnSO4·7H2O0.222mg/L，CuSO4·7H2O0.079mg/L，MnCl2·4H2O1.81mg/L，Na2MoO40.39mg/L，Co(NO3)4·6H2O0.0494mg/L。2方法于春季在青岛平度市郊区河水中取表层水样20ml。向所取水样中添加BG-11培养基180ml，置于玻璃气泡柱中通气培养5天，温度20℃，光照强度100μmolphotonsm-2s-1。将培养物以双层纱布过滤，并用无菌水冲洗多次。取纱布上截留物，用BG-11稀释，取50μl均匀铺于BG-11培养基的固体琼脂板上，在温度20℃，光照强度100μmolphotonsm-2s-1的条件下培养7天。将所培养的固体平板置于显微镜下观察，并标记丝状体所形成的单藻落。在超净工作台中，用接种针将所标记的单藻落挑至新的BG-11培养基固体琼脂板上，加50μl无菌水均匀涂布，之后置于上述温度和光照条件下培养7天。重复上述分离步骤，直至获得完全纯化的单藻落。其中的一株单藻落命名为PD2。将所获得的完全纯化的单藻落PD2置于BG-11液体培养基中，在温度20℃，光照强度100μmolphotonsm-2s-1的条件下培养10天，于显微镜下观察，PD2为不分枝的丝状体，细胞呈圆柱形或腰鼓形，长10～15μm，宽3～5μm，细胞壁呈“H”形，细胞内含1～3个周生、盘状或带状的色素体，单核，细胞颜色为黄绿色或绿色(如图1所示)。经18SrDNA和ITS序列的测定分析，鉴定PD2为黄丝藻属(Tribonemasp.)物种(如图2所示)。该藻株已于2015年5月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10488。实施例2：藻株Tribonemasp.PD2的玻璃气泡柱培养在实验室条件下，将预先用BG-11培养基培养的黄丝藻Tribonemasp.PD2藻液接种于直径5cm、容积800ml的玻璃气泡柱中进行培养，接种生物量为0.1～0.2g/L，通气量为0.05～0.5vvm(二氧化碳含量为1.5％)，硝酸钠浓度为0～3g/L，磷酸氢二钾浓度为0～0.095g/L，温度为20℃，光照强度为100μmolphotonsm-2s-1。培养时间为18天，其间，每3天测定一次生物量，每6天测定一次油脂含量，每3天测定一次藻液中硝酸钠以及磷酸氢二钾的含量。将第18天收获的藻体提取油脂后分析其脂肪酸组成。生物量的测定：取一定体积的藻液，用0.45μm且已事先称重的滤膜抽滤，并用蒸馏水多次冲洗，之后将滤膜置于105℃烘箱中烘至恒重，称量，测定藻液生物量。经测定，藻株Tribonemasp.PD2的生物量为0.8～6.2g/L(如图3、4所示)。硝酸钠含量的测定：使用分光光度法测定，测定所用波长为220nm。经测定，藻株Tribonemasp.PD2在培养前3天即可吸收或吸附水体中0.75g/L的硝酸钠(如图5所示)。磷酸氢二钾含量的测定：使用钼酸铵分光光度法(GB11893-89)测定。经测定，藻株Tribonemasp.PD2在培养前3天即可吸收或吸附水体中0.08g/L的磷酸氢二钾(如图6所示)。实施例3：藻株Tribonemasp.PD2的户外开放池培养在户外条件下，将预先用BG-11培养基培养的黄丝藻Tribonemasp.PD2藻液接种于6m×4m×0.2m的开放池中，藻液深度为10～15cm，初始接种生物量为0.1～0.2g/L，通气量为0.05～0.5vvm(内含5％的锅炉烟道废气)，硝酸钠浓度为1.5g/L，磷酸氢二钾浓度为0.047g/L，温度为15～35℃，昼间光照强度为50～1000μmolphotonsm-2s-1。培养时间为20天，其间，每2天测定一次生物量。生物量的测定：取一定体积的藻液，用0.45μm且已事先称重的滤膜抽滤，并用蒸馏水多次冲洗，之后将滤膜置于105℃烘箱中烘至恒重，称量，测定藻液生物量。经测定，藻株Tribonemasp.PD2在户外开放池培养的生物量为2.5～4g/L(如图7所示)，单位面积的生物量产率可达15～25g/(m2·d)。实施例4：藻株Tribonemasp.PD2的溶气气浮法(DAF)采收以溶气气浮法(DAF)将实施例3中所述的培养完成的Tribonemasp.PD2藻液进行采收。采收过程的各工艺参数分别为：藻液流量为1500L/h，溶气压力为0.4MPa，溶气水回流比为10％。由于该藻株的丝状体特性，使其易于受到微气泡的黏附，从而在不添加任何絮凝剂的情况下即可达到极高的采收效率。经测定，使用溶气气浮法(DAF)采收Tribonemasp.PD2时可获得99％的采收率。实施例5：藻株Tribonemasp.PD2的低温弱光保藏将藻株Tribonemasp.PD2接种于盛有BG-11培养基的50ml三角瓶中，置于4℃光照培养箱中，光照强度为10μmolphotonsm-2s-1，在不进行转接继代培养的情况下，可持续存活1年以上。表明藻株Tribonemasp.PD2具有适应低温弱光的特性，且便于保藏。实施例6：黄丝藻Tribonemasp.PD2总油脂和脂肪酸含量和组成分析油脂含量的测定：取一定体积的藻液，用0.45μm的滤膜抽滤并用蒸馏水多次冲洗，将藻体转移至离心管中冷冻干燥24小时获得干藻体。取所述干藻体50～100mg，加适量石英砂于研钵中研磨，以1:2(v:v)的氯仿-甲醇溶液超声提取30分钟，离心后取上清液。残渣重复提取三次。向合并后的上清液中添加适量氯仿和氯化钠水溶液，使氯仿、甲醇、氯化钠水溶液的体积比为10:10:9，离心后取下层氯仿层，在60℃条件下用氮吹仪将氯仿吹干，称重，测定 油脂含量。经测定，藻株Tribonemasp.PD2的油脂含量为藻干重的24％～62％(如图8、9所示)。脂肪酸组成的分析：取少量上述所得油脂，以2.5ml2％硫酸的甲醇溶液溶解，在85℃条件下甲酯化2.5小时。以1ml正己烷萃取脂肪酸甲酯，采用气相色谱法对脂肪酸组成进行分析(Varian450GC，美国)。具体检测条件为：使用安捷伦HP-5气相色谱毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)，进样量2μl，进样器温度280℃，分流比10:1，检测器温度280℃。以峰面积值计算各脂肪酸组分的相对含量。经测定，藻株Tribonemasp.PD2的脂肪酸组成以C16为主，其中，棕榈油酸(C16:1ω7)的含量占总脂肪酸含量的53.2％，C16～C18脂肪酸含量为总脂肪酸的85％，不饱和脂肪酸(UFA)含量为总脂肪酸的65％(如表1所示)。表1黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)的脂肪酸组成中文名含量(％)C12:0月桂酸0.1C14:0肉豆蔻酸6.2C14:1肉豆蔻烯酸0.3C15:0十五碳酸0.7C16:0棕榈酸26.6C16:1ω7棕榈油酸53.2C16:2ω6十六碳二烯酸1.1C18:0硬脂酸1C18:1ω9油酸2.2C18:2ω6亚油酸1.2C20:3ω6亚麻酸0.6C20:4ω6花生四烯酸4.6C20:5ω3二十碳五烯酸2.1实施例7：生产富含棕榈油酸的黄丝藻生物油将黄丝藻Tribonemasp.PD2按照实施例3大规模培养，并按照实施例4采收后获得大量黄丝藻生物质。将所获得的生物质经粉碎后加入500L的反应釜中，并添加1～4倍于生物质质量的乙醇与100～250ml的硫酸。以氮气将反应釜加压至0.3MPa，加热至90℃，在搅拌速度为120rpm的条件下连续提取8小时。提取结束后将反应釜内上清液抽出，加入80L的减压蒸馏浓缩器内，加热至80℃进行蒸馏浓缩。最终所获得浓缩液经过滤除杂之后即为黄丝藻生物油。在实施例3所述的培养装置和培养条件下，可以将同形黄丝藻(Tribonemaaequale)、普通黄丝藻(Tribonemavulgare)、小型黄丝藻(Tribonemaminus)、拟丝黄丝藻(Tribonema ulotrichoides)、囊状黄丝藻(Tribonemautriculosum)和黄丝藻PD2(Tribonemasp.PD2)中一种或多种混合培养，收获黄丝藻生物质经粉碎、提取等工艺序贯处理后得到黄丝藻生物油。实施例8：利用黄丝藻生物油制备脂肪酸甲酯将实施例7中所获得的黄丝藻生物油加入500L反应釜中，以10倍体积的含2％硫酸的甲醇溶液溶解，加热至85℃，在搅拌速度为120rpm的条件下甲酯化3小时。反应结束后，以1/3倍总体积的正己烷萃取脂肪酸甲酯，萃取液在70℃条件下经减压蒸馏浓缩后获得脂肪酸甲酯。实施例9：利用黄丝藻生物油制备脂肪酸乙酯将实施例7中所获得的黄丝藻生物油加入500L反应釜中，以10倍体积的含2％硫酸的乙醇溶液溶解，加热至85℃，在搅拌速度为120rpm的条件下乙酯化3小时。反应结束后，以1/3倍总体积的正己烷萃取脂肪酸乙酯，萃取液在70℃条件下经减压蒸馏浓缩后获得脂肪酸乙酯。实施例10：利用黄丝藻作为饲料养殖肉鸡将黄丝藻Tribonemasp.PD2生物质粉碎后按质量比1:1与玉米粉混合作为饲料喂养1日龄商品肉鸡(平均体重42g/羽)，以完全玉米粉饲料作为对照。喂养试验进行30天，所有试验肉鸡均进行自由采食和饮水，每15天随机取30羽肉鸡个体测量其体重，喂养试验结束后计算平均日生长量与成活率。结果表明，以黄丝藻藻粉与玉米粉混合饲料喂养肉鸡时，30天后的平均体重为1412g，平均日生长量为45.7g/天，成活率为96％；以完全玉米粉喂养肉鸡时，30天后的平均体重为1348g，平均日生长量为43.5g/天，成活率为96％。由此可见，黄丝藻藻粉适于作为肉鸡的饲料，其与玉米粉的混合饲料的喂养效果略优于完全玉米粉饲料。实施例11：黄丝藻生物油在添加于各类食用油中的应用将实施例7中所得黄丝藻生物油按不同比例分别添加于大豆油、花生油和橄榄油中，并按实施例6中所述方法分析其脂肪酸组成。由于常用食用油如大豆油、花生油以及橄榄油中棕榈油酸的含量很低，仅有0.2～3.5％，适量添加黄丝藻生物油可有效提高其棕榈油酸的含量。结果表明，当按照1:9的比例混合黄丝藻生物油和食用油后，棕榈油酸(C16:1ω7)的含量可提高至5.5～8.7％，当按照1:4的比例混合黄丝藻生物油和食用油后，棕榈油酸(C16:1ω7)的含量可提高至10.8～13.4％。由此可见，仅需添加少量黄丝藻生物油，即可显著提高食用油中棕榈油酸(C16:1ω7)的含量。实施例12：黄丝藻藻粉用于面膜的制作取粉碎的黄丝藻藻粉10g或其乙醇提取物5g，蜂蜜5g，丁二醇1g，加入50g蒸馏水加 热至50℃至60℃，搅拌30分钟，待冷却至40℃，加入酸奶2g，维持温度在35℃至40℃，搅拌20分钟。待冷却后即制得黄丝藻面膜。将上述所制得的黄丝藻面膜均匀涂于皮肤表面，并辅以轻柔按摩，15至20分钟后将面膜洗去。经试用，黄丝藻面膜具有良好的补水及美白效果。当前第1页1 2 3