防止或处理制造产品上的微生物生长的方法与流程

本申请要求南非临时专利申请2014/04023的优先权，其通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及将抗微生物肽吸附到固体表面或基质上，用于抑制表面微生物污染以及随后在表面上的生物膜形成。

背景技术：

病原体在固体表面上的拓殖和粘附是农业、食品工业、医学领域和各种其它工业中一直存在的问题，因为这可能导致产品、水果和蔬菜的腐败、慢性感染和/或抗生素抗性生物膜的形成。

在农业中，在美国，收获后损失约为24％(美国农业部，1965年，美国农业部手册，291)，在不发达热带国家约为50％(Courtsey and Booth，1972，Rev.Plant.Pathol.，51：751-765)。收获后腐败可以通过以下手段来防止：使用化学喷雾、浸泡或洗涤；熏蒸；或使用经处理的包装纸、盒衬纸或碎纸。化学处理通常使用硼砂、邻苯基苯酚钠、氯、抗生素、二苯胺或乙氧喹。二氧化硫、三氯化氮、氨或铵化合物或二氧化碳通常用于熏蒸。包装材料用联苯、邻苯基苯酚、碘、硫酸铜、矿物油和二苯胺处理。联苯用于包装纸或盒衬里，常与其他处理剂结合使用，例如硼砂(Godfrey和Ryall，1948，Texas Agr.Expt Sta.Bul.701-724；Harvey，1952，Phytopath.，42：514)。这减少了柑橘上青霉和绿霉以及蒂腐病的发生(Harvey和Sinclair，1953，Rept.Tech.Comm.Comrus Citrus Assoc.Union of Calif.，1-27)，然而这并不是杀死真菌感染，仅仅是抑制了柑橘病原体的营养生长和孢子形成。联苯还已经被发现刺激一些蔬菜和水果病原体的生长(Heiberg和Ramsey，1946，Pytopath，36：887-891)。已经表明，邻苯基苯酚浸渍的包装纸对一些柑橘真菌有效，并降低了番茄、葡萄和苹果的感染(Plank，Rattrey和van Wyk，1940，Jour.Pomol.And Hort.Sci.，18：135-144)。然而，在暴露于邻苯基苯酚浸渍的包装纸之后，观察到水果的损伤和灼伤。碘浸渍的包装纸也显示出具有抗青霉活性，且不损害柑橘，但是碘的挥发性使得抑制效应快速消失(Smith，1962，Botanical Review.23(3)：411-445)。还已知其它处理来预防真菌感染，但都具有一系列缺点，其中对水果和蔬菜的损害最为突出。因此，不会损害水果和蔬菜的安全有效的抗微生物处理在农业工业中具有巨大用途。

在医学领域和相关工业中，生物膜的处理主要针对成熟生物膜的去除。已经观察到对目前可用的处理的抗性，并且这种抗性可以是由于表多糖基质阻止了处理渗透到整个生物膜中，或者是由于生物膜和混合生物体生物膜的层之间的代谢差异，其中并非所有生物都受处理的影响。已经发现，除去生物膜的最有效的方法由包括对生物膜的处理和物理去除(例如清洗(scrubbing)或高压喷雾)的组合效力构成。然而，这并非在可以形成生物膜的所有区域中都可行。

通常由硅树脂或乳胶制成的导尿管是常常形成生物膜的医疗领域中的一个实例。导管生物膜的研究(Stickeler，1996，Biofouling，94：293-305)发现，在导管插入超过28天的情况下，大多数患者由于在导管自身中出现的生物膜而发展了感染。导管生物膜中常见的生物体是表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、大肠杆菌、奇异变形杆菌(Proteus marabilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumonia)。已经发现，生物体和导管材料的疏水性决定了在生物膜内出现的生物体的类型(Brisset，Vernet-Garnier，Carquin，Burde，Flament和Choisy，1996，Pathol.Bio.，44：397-404)。没有发现特定的导管材料具有防止生物体拓殖的手段(Tunney，Jones和Gorman，1999，Doyle RJ(编)，Methods in Enzymology.San Diego：Academic Press.558-566)。已经测试了控制措施(例如收集袋中的抗微生物剂、抗微生物软膏和润滑剂、抗生素的使用以及膀胱装置和灌洗)，但是都未显示出显著结果(Kaye和Hessen，1994，IN：Bisno和Waldovogel(编)，Infection associated with indwelling medical devices.Washington.American Society for Microbiology，291-307)。只有使生物体的附着延迟了4天的银浸渍导管显示出了改善。

伤口敷料是表面污染造成问题的医疗领域中的另一个例子，其通常导致本应该受敷料保护的伤口发生感染。已经开发了具有杀细菌、杀病毒或杀真菌活性的浸渍型伤口敷料，用于已经感染的伤口，即，不仅帮助伤口愈合，而且还对抗阻止伤口愈合的感染。例如，Betadine^TM伤口敷料用10％聚维酮-碘溶液浸渍，具有杀细菌和杀病毒活性，并且销售用于受污染或表面感染的伤口(Herruzo-Cabiera，Vizcaino-Alcaide，Mayer，Rey-Calero，1992，Burns，18：35-37)。然而，这种敷料的缺点是其在变干时变硬，这可能导致患者不适，并且还可能破坏伤口。银浸渍的敷料也用于对抗感染的伤口，例如Acticoat^TM(Westaim Biomedical Inc.，Fort.Saskatchewan，Alberta，Canada)和(Argentum Medical，L.L.C.，Lakermont，Georgia)。这两种敷料都使用纳米晶体银以受控的时间延长的方式将银释放到伤口区域，导致更换敷料的频率更低、进一步感染的风险更低、治疗成本更低，并防止持续的患者不适和组织损伤。然而，很少有关于银对伤口床的影响、其如何代谢或如何影响伤口的整体愈合过程的研究。

在食品工业中，单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)通常与生物污着(biofouling)相关，并且出现在肉类和乳制品加工车间中。虽然用于清洁加工车间内的管道的剪切力应当足以去除暴露出的生物膜，但是难以到达的地方(例如由老化引起的设备内的裂纹、垫圈、阀门和接头)更可能生成生物膜，而这些都很难去除。此外，已经发现环境表面(地板、墙壁等)容易广泛形成生物膜，并且可导致在已清洁的加工车间中重新引入利斯特氏菌。与此相关地，已经观察到李斯特菌对在食品加工环境中使用的消毒剂的抗性。这是非常令人担忧的，因为在美国利斯特氏菌导致了28％的摄入受污染食物所造成的死亡(Mead，Slutsker，Dietz，McCraig，Bresee，Shapiro，Griffin，Tauxe，1999，Emerg.Infect.Dis.5：607-625)。

生物污着的最大问题之一是，一旦生物体附着并定殖于表面，其能够形成难以完全去除的抗性生物膜，从而产生造成再感染或慢性生物污着的恒定来源。

因此，需要新的方法来预防或处理表面上的微生物感染和生物膜产生，特别是在农业、食品和医疗工业中，或者在遇到感染和/或生物污着情况的其他行业中。

技术实现要素：

根据本发明的第一实施方案，提供了一种预防或处理制造产品上的微生物生长的方法，所述方法包括以下步骤：向所述产品的表面施加包含作为活性剂的环十肽的组合物，所述环十肽是短杆菌酪肽(tyrocidine)、短杆菌色肽(tryptocidine)、短杆菌苯丙肽(phenycidine)或短杆菌肽S，或它们的衍生物或类似物，所述环十肽包含氨基酸序列环(Val-X₁-Leu-D-Phe-Pro-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆)(SEQ ID NO:1)，其中

X₁是Orn或Lys；

X₂是Val、Leu、Ile、Phe、Trp或Tyr；

X₃是Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Tyr、Orn或Lys的D-异构体；

X₄是Asn、Gln或Leu；

X₅是Gln，或Val、Leu或Ile的D-异构体；以及

X₆是Tyr、Phe、Trp、Pro或Hyp。

在一个实施方案中，所述环十肽可以是序列为环(Val-X₁-Leu-D-Phe-Pro-X₇-X₈-Asn-Gln-X₉)(SEQ ID NO:2)的短杆菌酪肽或其类似物或衍生物，其中：

X₁是Orn或Lys；

X₇是Trp或Phe；

X₈是D-Trp或D-Phe；以及

X₉是Tyr、Trp或Phe。

所述环十肽可以是短杆菌肽S或其衍生物或类似物，其氨基酸序列为环(Val-X₁-Leu-D-Phe-Pro-Val-X₁-Leu-D-Phe-Pro)(SEQ ID NO:3)。

所述环十肽还可以是短杆菌酪肽、短杆菌色肽、短杆菌苯丙肽或短杆菌肽S的衍生物或类似物，并且可以具有一个或多个以下氨基酸替换：

缬氨酸残基可以被亮氨酸或异亮氨酸残基替换；

亮氨酸残基可以被异亮氨酸或缬氨酸残基替换；

苯丙氨酸残基可以被色氨酸或酪氨酸残基替换；

脯氨酸残基可以被羟基脯氨酸残基替换；或者

鸟氨酸残基可以被赖氨酸或阳离子氨基酸替换；或者

其类似物或衍生物。

例如，所述环十肽的氨基酸序列可以选自SEQ ID NO:6-177中的任一个。

所述组合物可以含有氨基酸序列为SEQ ID NO:1的任何两种或更多种不同的环十肽的混合物。

所述产品可以由聚合物制成或衍生自聚合物，所述聚合物例如是天然、合成或半合成的聚合物或其组合。

合适的天然聚合物包括糖聚合物(即纸和纸制品、壳多糖、淀粉、棉等)、皮革、乳胶、玻璃、橡胶、丝或任何其它易受微生物污染的衍生固体或固化材料。

所述产品可以是医疗装置或其部分、伤口敷料或其部分、食品包装、容器、包装物、用于食品加工、运输或储存的表面或装置、过滤器、复合材料、纸、包装材料或容器等。

所要预防或处理的微生物生长可以是真菌和/或细菌生长。

所述组合物可以以液体形式、凝胶、气溶胶或雾形式施加至制造产品，或在制备该产品期间施加至制造产品，以使得所述环十肽能够吸附到该产品的表面上或表面中，或者吸附到用来制造该产品的聚合物上或聚合物中。

根据本发明的第二实施方案，提供了一种制造产品，在其上已根据上述方法施加了抗微生物组合物。

附图说明

图1：从用短杆菌酪肽(Trc)处理过的纤维素(CL)滤膜上解吸附的Trc提取物的UPLC-ESMS谱。已标示肽的身份(A)。将用于CL滤膜处理的Trc提取物中的肽与从CL滤膜上解吸附的Trc混合物中的不同的肽的贡献进行比较。与处理提取物(B)相比，用*表示的肽的贡献减少，用#表示的肽的贡献增加。

图2：用如下滤膜获得的扫描电子显微镜图像：(A)纤维素滤膜，放大1000倍，(B)Trc处理的纤维素滤膜，放大1000倍，(C)Trc处理的纤维素滤膜加上藤黄微球菌(M.luteus)，放大1000倍，(D)Trc处理的纤维素滤膜加上红细胞，放大1000倍。

图3：用Trc提取物或短杆菌肽S(GS)处理过的不同的滤膜(A)和纳米纤维(B)的保留的抗微生物活性的比较。(A)中用*标记的条带表示所处理的表面是PS(聚苯乙烯)和PP(聚丙烯)材质的96孔板(不是滤膜)中的孔的表面。在具有高细菌细胞计数(6.6×10⁴藤黄微球菌细胞/孔或5mm过滤膜盘片)的低营养环境中使用活力测定法测定抑制活性。条带表示6-9次测定的平均值和平均值标准误差(SEM)。

图4：用不同浓度的细菌对经Trc提取物处理的纤维素(CL)滤膜进行挑战试验，在对(A)单核细胞增生利斯特菌和(B)藤黄微球菌进行活力测试后确定其显示出杀菌效力。每个数据点表示9次测定的平均值和SEM。

图5：用溶血测定法测定的(A)pH变化和(B)温度变化对保留在50μg/mL纤维素滤膜上的短杆菌酪肽的量的影响。短杆菌肽S(GS)用作观察到100％溶血的阳性对照，50μg/mL未洗涤的纤维素滤膜用作初始吸附的短杆菌酪肽总量的参照点。每个数据点表示3次测定的平均值和SEM。

图6：用不同的溶剂对经Trc提取物处理的纤维素(CL)滤膜进行的洗涤对滤膜无菌性的影响，其用以藤黄微球菌作为细菌污染物的活力测试来测定。每个数据点表示至少24次测定的平均值和SEM。

具体实施方式

本文描述了用于预防或处理制造的材料或产品上的微生物生长或用于灭活或杀死其上的微生物的方法。该方法包括向制造的材料或产品的表面施加包含作为活性剂的环十肽的组合物，所述环十肽是短杆菌酪肽、短杆菌色肽、短杆菌苯丙肽或短杆菌肽S或它们的衍生物或类似物，所述环十肽包含氨基酸序列环(缬氨酸-X₁-亮氨酸-D-苯丙氨酸-脯氨酸-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆)(SEQ ID NO:1)。

制造的产品可以是能够用于生产另一产品的材料或者可以是最终产品本身。制造的产品优选由聚合物制成或源自聚合物。合适的天然聚合物包括糖聚合物(例如纸、面巾纸、纸板、木材、来自改性纤维素的聚合物、壳多糖、壳聚糖、淀粉、棉等)、皮革、胶乳、玻璃、橡胶、丝(silk)或易受微生物污染的任何其他衍生固体或固化材料。合适的合成或半合成聚合物包括聚偏乙烯(即含有氟、碘、溴或氯)、聚乙烯、聚酯、聚苯乙烯、聚乙烯/聚丙烯及类似物、聚氨酯、聚丙烯酰胺、聚酰胺/酰亚胺及类似物(尼龙)、聚环氧化物(环氧树脂)、聚醚醚酮(PEEK)、聚醚酰亚胺、聚乳酸及类似物、聚丙烯酸甲酯及类似物(丙烯酸酯)、聚四氟乙烯及类似物(特氟隆)、聚糠醇、聚砜、聚碳酸酯、脲甲醛、来自改性纤维素(例如硝化纤维素、乙酸纤维素等)的聚合物、丙烯酸类、聚马来酰亚胺及类似物、三聚氰胺、硅酮或易受微生物污染的任何其它合成衍生的有机聚合物、固体或固化材料，包括由纳米纤维制成的聚合物材料。所述制造的材料还可以是由天然、合成和/或半合成的聚合物的混合物制成的产品。

产品可以具有至少一个固体或基质样表面。

制造的材料不是植物学植物或植物的未加工部分，例如果实。

制造的产品可以是医疗装置或其部分(例如导管)、伤口敷料或其部分、食品包装、容器、包装物、用于食品加工、运输或储存的表面或装置、过滤器、复合材料、纸、包装材料、墙壁、工作表面、地板或管道等。

当应用于材料或产品的表面时，所述环十肽将吸附到该表面或浸入其中，并且将防止或抑制微生物(例如来自真菌、细菌或其他微生物)附着到该表面。所述组合物还可用于灭活或杀死微生物，从而防止微生物病原体(“病菌”)的扩散。因此，设想该组合物可用于对材料、表面或产品进行消毒或灭菌。所述组合物还可用于抑制其所施加的产品的表面上的生物膜和/或生物污着的形成。

如本文所用，生物膜是薄的微生物层，其主要含有在各种表面(例如导管或水管)上形成并覆盖这些表面的具有生物杀伤剂抗性或抗生素抗性的微生物(例如细菌和/或真菌)。

生物污着是生物(例如细菌和原生动物，特别是通过水传播的)在结构表面上的逐渐积累，其导致结构的腐蚀，并且降低了运动部件的效率。所述结构通常是暴露于水或水性介质的结构。

消毒是对物品的清洁，特别是通过使用杀死微生物(“病菌”)(例如细菌和真菌)的物质来进行清洁。

灭菌是指消除或杀死所有形式的生命(包括存在于表面上、包含在流体中、药物中或化合物中(例如生物培养基中)的可传播媒介物)的任何过程的术语。

所述组合物可以含有两种或更多种不同的SEQ ID NO:1的环十肽。例如，组合物可以包含一种或多种短杆菌酪肽和/或短杆菌肽S或其衍生物的组合。

所述组合物将被配制成含有一定浓度的环十肽，其有效地防止或抑制微生物附着到施加该组合物的表面，或有效地灭活或杀死与该表面接触的微生物。

组合物可以以液体或半液体形式施加于制造材料的表面，使得环十肽可以吸附在材料或产品的表面上。例如，组合物可以是液体、凝胶、雾、气溶胶或任何其它合适的制剂。一旦施加，可以使组合物干燥。或者，一旦环十肽已能够吸附到产品的表面，可以进行洗涤步骤以除去尚未吸附到产品上的过量的肽。

所述组合物可以适当地配制以改善对制造材料的固相粘附、改善环十肽的活性或稳定性或限制其毒性。

因为肽是吸附到产品表面而不是共价结合到其上，因此它们能够在目标微生物存在时从表面释放，并且将结合到微生物，从而防止微生物粘附到产品上。因此，组合物将以缓慢释放的方式起作用，并且肽可以在持续的时间段内为产品的表面提供抗微生物活性。

短杆菌肽S、短杆菌酪肽、短杆菌色肽、短杆菌苯丙肽及其衍生物/类似物是对细菌和真菌污染都具有活性的广谱杀微生物剂。短杆菌酪肽的环十肽类似物也显示出低的植物毒性。本文所述的环十肽是热稳定的，在宽的pH范围内起作用，并且对矿物盐相对不敏感。此外，由于它们是环状的，它们不太可能像线状肽一样快速降解。因此，设想本发明的组合物将适合于在制品表面上提供长期的抗微生物保护。

短杆菌酪肽、短杆菌色肽、短杆菌苯丙肽和/或短杆菌肽S是分别由芽孢杆菌属物种(例如解硫胺素芽胞杆菌(Bacillus aneurinolyticus))和短芽孢杆菌属物种(短芽孢杆菌(Bacillus brevis))产生的β-片层环十肽家族。这些肽具有高序列同一性，高度保守，并且采用相似的骨架构象/分子拓扑学。短杆菌酪肽和短杆菌肽S的共同序列为Val-Orn-Leu-D-Phe-Pro(SEQ ID NO:4)，其中阳离子残基可以是鸟氨酸或赖氨酸。对于短杆菌酪肽，缬氨酸和亮氨酸残基也可以替代亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。完整的短杆菌肽S序列是环(Val-Orn-Leu-D-Phe-Pro)₂(SEQ ID NO:3)的高度保守序列的重复。完整的短杆菌酪肽序列也含有这种高度保守的序列，但是其后面不是其重复序列，而是可变五肽部分Phe-D-Phe-Asn-Gln-Tyr(SEQ ID NO:5)或其衍生物或类似物。该可变肽部分中的三个芳族残基中的任何一个或多个都可以被酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸替换，产生短杆菌酪肽、短杆菌苯丙肽和短杆菌色肽。

短杆菌肽S和短杆菌酪肽A(一种短杆菌酪肽)的一级化学结构如下所示

短杆菌素(一种短杆菌酪肽-短杆菌肽复合物，其中短杆菌肽是与短杆菌肽S无关的线形中性15聚体肽)是用于临床实践的第一种抗生素，但后来由于其溶血毒性而饱受批评(Dubos和Cattaneo，1939，J.Exp.Med.70：249；Hotchkiss和Dubos，1941，J.Biol.Chem.，141：155；Bradshaw，2003，Biodrugs，17：233-240)。研究表明，短杆菌酪肽具有抗粗糙链孢菌(Neurospora crassa)(Mach和Slayman，1966，BBA，124：351-336)和革兰氏阳性细菌(例如单核细胞增生利斯特菌)的活性(Spathelf和Rautenbach，2009，Bioorg.Med.Chem，17：5541-5548)，其中短杆菌酪肽预防单核细胞增生李斯特菌生物膜形成(个人通信，A.N-N.Leussa)。短杆菌素和短杆菌酪肽还对白色念珠菌(Candida albicans)(Kretschmar等，1996，Mysoses，39：45-50)和白色念珠菌生物膜有活性(Troskie等，2014，Antimicrob.Agents Chemother，58,3697-3707)。然而，申请人没有发现对短杆菌素制造者(例如，解硫胺素芽孢杆菌，通常称为短芽孢杆菌的Dubos株)或短杆菌酪肽在杀菌以及控制细胞对固体表面或基质的附着方面或在防止生物膜/生物污着方面的任何研究。这可能是由于感觉到这些肽有高毒性，但是看似这种感觉是没有根据的(Rautenbach等，2007，BBA Biomembr.，1768：1488-1497)。短杆菌素复合物也以商品名Tyrozets用于咽喉锭剂(1mg短杆菌素/锭剂)，表明其对于人类消费的相对安全性，但是该产品由于功效受质疑已经停止供应。该复合物还以商品名和在其他研究中用作凝胶，并且已经显示，其与载体(不含短杆菌素的凝胶)和未处理的伤口区域相比，对浅表伤口没有治疗效果(Wigger-Alberti等，2013，Skin Pharmacol Physiol，26：52-56)。

本发明的环十肽是已知的短杆菌酪肽、短杆菌色肽、短杆菌苯丙肽或短杆菌肽S或其衍生物或类似物，它们具有包含Val-X₁-Leu-D-Phe-Pro-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆(SEQ ID NO:1)的高度保守的氨基酸序列或其衍生物或类似物，其中X₁是鸟氨酸或赖氨酸。

短杆菌酪肽、短杆菌色肽、短杆菌苯丙肽或短杆菌肽S的合适类似物可以是包括任何一个或多个以下替换的那些：

缬氨酸残基被亮氨酸或异亮氨酸残基或疏水性氨基酸或类似物/衍生物替换；

亮氨酸残基被异亮氨酸或缬氨酸残基或疏水氨基酸或类似物/衍生物替换；

脯氨酸残基被羟脯氨酸残基或其类似物/衍生物替换；

苯丙氨酸残基被色氨酸或酪氨酸残基或其芳香族类似物/衍生物替换；

鸟氨酸残基被赖氨酸或阳离子氨基酸或其类似物/衍生物替换；

X₂是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸或疏水氨基酸或类似物/衍生物；

X₃是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的D-异构体或疏水氨基酸或其类似物/衍生物；或者是鸟氨酸、赖氨酸或阳离子氨基酸或其类似物/衍生物；

X₄是天冬酰胺、谷氨酰胺或亮氨酸或其类似物或衍生物；

X₅是谷氨酰胺或极性氨基酸或其类似物/衍生物；或者是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或疏水氨基酸的D-异构体或其类似物/衍生物；以及

X₆是酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸或脯氨酸残基。

更优选地，环十肽衍生物可以是选自以下组的一种或多种肽：

短杆菌酪肽类似物：

环(VKLfPWwNQY)(短杆菌酪肽C₁，TrcC¹)(SEQ ID NO:6)

环(VOLfPWwNQY)(短杆菌酪肽C，TrcC)(SEQ ID NO:7)

环(VKLfPWfNQY)(短杆菌酪肽B₁，TrcB₁)(SEQ ID NO:8)

环(VOLfPWfNQY)(短杆菌酪肽B，TrcB)(SEQ ID NO:9)

环(VKLfPFwNQY)(短杆菌酪肽B₁’，TrcB₁’)(SEQ ID NO:10)

环(VOLfPFwNQY)(短杆菌酪肽B’，TrcB’)(SEQ ID NO:11)

环(VKLfPFfNQY)(短杆菌酪肽A₁，TrcA₁)(SEQ ID NO:12)

环(VOLfPFfNQY)(短杆菌酪肽A，TrcA)(SEQ ID NO:13)

环(VKLfPYwNQY)(SEQ ID NO:14)

环(VOLfPYwNQY)(SEQ ID NO:15)

环(VKLfPYfNQY)(SEQ ID NO:16)

环(VOLfPYfNQY)(SEQ ID NO:17)

环(VKLfPFyNQY)(SEQ ID NO:18)

环(VOLfPFyNQY)(SEQ ID NO:19)

环(VKLfPWyNQY)(SEQ ID NO:20)

环(VOLfPWyNQY)(SEQ ID NO:21)

环(LKLfPWwNQY)(SEQ ID NO:22)

环(LOLfPWwNQY)(SEQ ID NO:23)

环(LKLfPWfNQY)(SEQ ID NO:24)

环(LOLfPWfNQY)(SEQ ID NO:25)

环(LKLfPFwNQY)(SEQ ID NO:26)

环(LOLfPFwNQY)(SEQ ID NO:27)

环(LKLfPFfNQY)(SEQ ID NO:28)

环(LOLfPFfNQY)(SEQ ID NO:29)

环(LKLfPYwNQY)(SEQ ID NO:30)

环(LOLfPYwNQY)(SEQ ID NO:31)

环(LKLfPYfNQY)(SEQ ID NO:32)

环(LOLfPYfNQY)(SEQ ID NO:33)

环(LKLfPFyNQY)(SEQ ID NO:34)

环(LOLfPFyNQY)(SEQ ID NO:35)

环(LKLfPWyNQY)(SEQ ID NO:36)

环(LOLfPWyNQY)(SEQ ID NO:37)

环(IKLfPWwNQY)(SEQ ID NO:38)

环(IOLfPWwNQY)(SEQ ID NO:39)

环(IKLfPWfNQY)(SEQ ID NO:40)

环(IOLfPWfNQY)(SEQ ID NO:41)

环(IKLfPFwNQY)(SEQ ID NO:42)

环(IOLfPFwNQY)(SEQ ID NO:43)

环(IKLfPFfNQY)(SEQ ID NO:44)

环(IOLfPFfNQY)(SEQ ID NO:45)

环(IKLfPYwNQY)(SEQ ID NO:46)

环(IOLfPYwNQY)(SEQ ID NO:47)

环(IKLfPYfNQY)(SEQ ID NO:48)

环(IOLfPYfNQY)(SEQ ID NO:49)

环(IKLfPFyNQY)(SEQ ID NO:50)

环(IOLfPFyNQY)(SEQ ID NO:51)

环(IKLfPWyNQY)(SEQ ID NO:52)

环(IOLfPWyNQY)(SEQ ID NO:53)

环(VKLfPLwNQY)(SEQ ID NO:54)

环(VOLfPLwNQY)(SEQ ID NO:55)

环(VKLfPLfNQY)(SEQ ID NO:56)

环(VOLfPLfNQY)(SEQ ID NO:57)

环(VKLfPLyNQY)(SEQ ID NO:58)

环(VOLfPLyNQY)(SEQ ID NO:59)

短杆菌色肽类似物：

环(VKLfPWwNQW)(短杆菌色肽C₁，TpcC₁)(SEQ ID NO:60)

环(VOLfPWwNQW)(短杆菌色肽C，TpcC)(SEQ ID NO:61)

环(VKLfPWfNQW)(短杆菌色肽B₁，TpcB₁)(SEQ ID NO:62)

环(VOLfPWfNQW)(短杆菌色肽B，TpcB)(SEQ ID NO:63)

环(VKLfPFwNQW)(短杆菌色肽B₁’，TpcB₁’)(SEQ ID NO:64)

环(VOLfPFwNQW)(短杆菌色肽B’，TpcB’)(SEQ ID NO:65)

环(VKLfPFfNQW)(短杆菌色肽A₁，TpcA₁)(SEQ ID NO:66)

环(VOLfPFfNQW)(短杆菌色肽A，TpcA)(SEQ ID NO:67)

环(VKLfPYwNQW)(SEQ ID NO:68)

环(VOLfPYwNQW)(SEQ ID NO:69)

环(VKLfPYfNQW)(SEQ ID NO:70)

环(VOLfPYfNQW)(SEQ ID NO:71)

环(VKLfPFyNQW)(SEQ ID NO:72)

环(VOLfPFyNQW)(SEQ ID NO:73)

环(VKLfPWyNQW)(SEQ ID NO:74)

环(VOLfPWyNQW)(SEQ ID NO:75)

环(LKLfPWwNQW)(SEQ ID NO:76)

环(LOLfPWwNQW)(SEQ ID NO:77)

环(LKLfPWfNQW)(SEQ ID NO:78)

环(LOLfPWfNQW)(SEQ ID NO:79)

环(LKLfPFwNQW)(SEQ ID NO:80)

环(LOLfPFwNQW)(SEQ ID NO:81)

环(LKLfPFfNQW)(SEQ ID NO:82)

环(LOLfPFfNQW)(SEQ ID NO:83)

环(LKLfPYwNQW)(SEQ ID NO:84)

环(LOLfPYwNQW)(SEQ ID NO:85)

环(LKLfPYfNQW)(SEQ ID NO:86)

环(LOLfPYfNQW)(SEQ ID NO:87)

环(LKLfPFyNQW)(SEQ ID NO:88)

环(LOLfPFyNQW)(SEQ ID NO:89)

环(LKLfPWyNQW)(SEQ ID NO:90)

环(LOLfPWyNQW)(SEQ ID NO:91)

环(IKLfPWwNQW)(SEQ ID NO:92)

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短杆菌苯丙肽类似物：

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短杆菌肽S类似物：

环(VOLfPVOLfP)(短杆菌肽S)(SEQ ID NO:168)

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环(LOLfPLOLfP)(SEQ ID NO:175)

环(LKLfPLOLfP)(SEQ ID NO:176)

环(LKLfPLKLfP)(SEQ ID NO:177)

在上述序列中，标准大写缩写表示L-氨基酸，除了鸟氨酸的O，小写缩写表示D-残基，“环”表示氨基至羧基末端通过酰胺键的环化。

本文提及的“环十肽”是指上述序列及其类似物或衍生物。

环十肽可以通过遗传修饰合适的微生物而由其天然细菌生产者产生，或通过使用有机/半合成系统产生。通过细菌/微生物生产或使用有机/半合成系统，衍生物或类似物中的氨基酸残基可以在核心环十肽序列(环(缬氨酸-鸟氨酸-亮氨酸-D-苯丙氨酸-脯氨酸-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆)(SEQ ID NO:1))中单独替换或组合替换。

环十肽可以以化学或酶促手段修饰，以改善基质粘附和/或溶解性和/或生物活性，和/或限制毒性。修饰方法包括共价偶联、氧化、羟基化、酰化、酰胺化的激活，有机部分、羟基、羧基、羰基、氨基、甲基或糖/糖的偶联，侧链修饰和生物合成修饰。

环十肽、其混合物或其修饰物可以被配制成在固体基质上使用的合适组合物。组合物可以适当地配制以改善基质粘附、溶解性、活性、稳定性，和/或限制毒性。制剂可以包含生物盐、脂质或脂质衍生物、多糖或多糖衍生物、糖或糖衍生物、生物友好或批准的GRAS添加剂。

表面活性剂可以用作润湿、增溶和渗透剂。合适的表面活性剂包括肽衍生的表面活性剂(例如表面活性素(surfactin)和伊枯草菌素)、非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和两性表面活性剂，例如胆酸、烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基芳基磺酸盐、烷基芳基醚及其聚氧乙烯衍生物、聚乙二醇醚、多元醇酯和糖醇衍生物。

制剂的其它组分可包括另外的表面活性试剂、溶剂、助溶剂、染料、UV(紫外线)保护剂、抗氧化剂、粘着剂、铺展剂、消泡剂、防腐剂、湿润剂、缓冲剂、润湿剂、分散剂、固定剂、崩解剂、酸增溶剂或有助于处理和施加的其它组分。优选选择这些载体、稀释剂、辅助剂等以优化在所选择的固体基质上的抗微生物作用。

其它辅助剂可包括例如粘合剂和分散剂，例如酪蛋白、多糖(例如粉末淀粉、阿拉伯树胶、纤维素衍生物、海藻酸、壳多糖)、木质素衍生物和合成的水溶性聚合物(例如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸)、盐(例如柠檬酸盐、盐酸盐、硫酸盐、乙酸盐、铵盐、碳酸氢盐、磷酸盐)和稳定剂，例如PAP(酸式磷酸异丙酯)、BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)、BHA(2,3-叔丁基-4-甲氧基苯酚)、植物油、矿物油、磷脂、蜡、脂肪酸和脂肪酸酯。

所述组合物还可以包含一种或多种其它抗微生物/抗生素或抗真菌化合物，包括来自动物、微生物或植物来源的天然肽、脂肽或抗生素，或化学产生的杀真菌剂或抗生素。例如，组合物可以包含短杆菌酪肽-短杆菌肽(称为短杆菌素)复合物。

现在将通过以下非限制性实施例更详细地描述本发明。

实施例

方法和材料

含有环十肽的固体基质的制备

在含有2％乙醇的高纯度水(通过MilliQ^TM系统产生的HP水)中的50μg/mL短杆菌酪肽(Trc)或短杆菌肽S(GS)的溶液中，将不同的聚合物基质(聚合物滤膜、纳米纺丝膜/薄膜和96孔板)温育1小时，然后用HP水漂洗2分钟。此后，将滤膜(板或纳米纤维片)在55±5℃烘箱中干燥过夜，并准备进行抗细菌和溶血测定。在温育之前和之后，在230nm下对含肽温育溶液进行吸光度测量，并使用方程式(A₂₃₀+0.0053)/0.015＝[Trc]μg/mL或(A₂₃₀-0.019)/0.0032＝[GS]μg/mL计算结合到基质上的肽的量。所用的聚合物基质包括来自混合型硝化纤维素/乙酸纤维素(HAWP孔径0.45μm；GSWP，孔径0.22μm)、聚偏二氟乙烯(GVHP，孔径0.22μm；HVLP，孔径0.45μm)、聚碳酸酯(PC，孔径0.45μm)、乙酸纤维素(CA，孔径0.45μm)和纤维素滤膜(CL)的滤膜(表1示出了一些实例)。HAWP、GSWP、HVLP和GSWP滤膜由Waters-Millipore(Milford，USA)提供。PC滤膜由Nuclepore Corp(Plesanton，CA，USA)提供。CA乙酸酯和HDC圆盘由Sartorius(Gottingen，德国)提供。CL滤膜(MN 615/No 1)获自Macherey-Nagel(Düren，Germany)。测试的其它基质包括高密度纤维素(包装材料)、具有1-10％壳多糖的聚甲基丙烯酸甲酯(PMM)和具有1-10％壳多糖的纤维素的纳米纺丝膜/薄膜(由M Lutz，Polymer Chemistry，University of Stellenbosch提供)，和由聚丙烯(PP)或低蛋白结合聚苯乙烯(PS)组成的Nunc^TM 96孔微量板(由AEC Amersham(Johannesburg，South Africa)提供)。

表1本研究中使用的选定滤膜作为用于环十肽处理的示例性材料的特性和常规用途

肽处理的滤膜的物理和化学分析

为了证实滤膜上存在肽，将茚三酮(0.2％，在95％乙醇中)喷在滤膜上，在50-60℃下显色。为了进一步评估CL滤膜上短杆菌酪肽的存在，通过在50％(v/v)乙腈中温育5天来使肽解吸附，之后除去溶液，以1200×g离心10分钟，收集上清液并冷冻干燥。通过称重确定肽的量，并且使用与电喷雾质谱连接的超高效液相色谱法(UPLC-ESMS)确定肽的存在和肽的身份，其中使用与具有电喷雾电离源的Waters Q-TOF Ultima质谱仪连接的Acquity UPLC。所使用的UPLC-ESMS方法由Vosloo等描述(2013)，Microbiology 159,2200-2211，DOI：10.1099/mic.0.068734-0。

测定未处理和经GS和Trc处理的滤膜的润湿性，以确定肽对滤膜的疏水性的影响。将含有蓝色食用色素的水(50μL)吸取到未处理和经处理的滤膜上，并监测滤膜的液滴尺寸和完成吸收的时间。

进行扫描电子显微镜检(SEM)，以评估经处理的和未处理的滤膜的表面结构上因用短杆菌酪肽提取物处理滤膜而引起的可能变化。通过将它们置于真空下并在具有五氧化二磷的干燥器中，将滤膜完全干燥，以除去可能干扰SEM信号的任何水分。然后将样品安装在覆盖在双面碳隔离带中的短棒上，随后用薄金层涂覆，以使样品的表面具有导电性。使用1430VP SEM获得SEM图像。表面分析期间的条件是：束条件为7kV和1.5nA，光斑尺寸为145-155nm，工作距离为13mm。

抗细菌生长测定

在Luria Bertani板(分析级纯水中的LB：1％(w/v)NaCl(Merck)、1％(w/v)胰蛋白胨(Merck)、0.5％(w/v)酵母提取物(Merck)、1.5％(w/v)琼脂(BioLab))上培养来自冷冻储备的藤黄微球菌NCTC 8340，并在37℃下温育48小时。将在20mL无菌LB培养基中的菌落接种物在37℃温育，直到达到A₆₂₀＝0.6。将经肽处理的基质和未处理的对照基质转移到LB琼脂板(高营养环境)。将藤黄微球菌培养物稀释至A₆₂₀为0.2，进一步稀释(2000-10000倍)，并转移至LB平板上的经处理的和未处理的滤膜上。将平板在37℃下温育48小时，然后检查基质的集落形成单位(CFU)的数量。

细胞活力测定

将经处理和未处理的基质(滤膜(filter)、膜(membrane)和薄膜(film))冲压成5mm的盘片，将一式三份的盘片转移到黑色98孔微量培养板中。用LB培养基将对数中期藤黄微球菌培养物稀释至A₆₂₀为0.20(1.3x10⁷CFU/mL)。在每个孔中，在5mm盘片的顶部上添加5μL稀释的培养物(±6.6x10²CFU)。将板在37℃下温育1小时，然后向每个孔中加入90μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)和10μL试剂。将板再次在37℃下温育2小时。在低营养环境中温育1小时后，在530nm的激发波长和590nm的发射波长下测定荧光。使用来自Thermo Scientific的Varioskan^TMMultimode读取器(由来自Thermo Electron的SkanIt Software 2.4.1控制)获取荧光读数。在25℃下进行测量之前，将每个板振荡5秒。

使用以下等式计算细胞活力：

溶血测试

将来自匿名供体的新鲜血液(得自西开普输血服务公司，南非)转移到无菌的管中，用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS：4.0％(w/v)NaCl、0.1％(w/v)KC、0.72％(w/v)Na₂HPO₄、0.1％(w/v)KH₂PO₄、pH 7.2，5×浓缩储备溶液)充填，并在1200×g离心3分钟。除去上清液并重复该过程。再次除去上清液，并将剩余的血细胞用于测定。将透明的96孔微量培养板用于该测试。将每个基质(经处理的和未处理的)的三个盘片置于孔中，并且4个孔接受10μL的短杆菌肽S作为阳性溶血对照(1.0mg/mL)。将血液(100μL，2％血细胞比容)吸取到每个孔中，之后将板密封并在37℃下温育2小时。温育后，将板在300×g下离心6分钟。将PBS(90μL)加入一个新的板的每个孔中，将10μL的来自经培养的板的每个孔的上清液转移到该PBS中。在595nm处测量吸光度。通过采用用于剂量响应测定的方程(Rautenbach，Gerstner，Vlok，Kulenkamff和Westerhoff，2005，Anal.Biochem.350：81-90)计算溶血百分比：

以20μg/mL开始的短杆菌酪肽倍增稀释(剂量响应)标准曲线用于确定导致溶解的Trc的量。使用以下公式从剂量响应曲线的线性部分确定溶解：(％溶血-2.38)/5.74＝[Trc]μg/mL。GS溶血证明低于10μg/mL是不敏感的。

稳定性测试

用多个洗涤步骤对CL滤膜(经过或未经过50μg/mL短杆菌酪肽处理的100mm直径的CL)进行挑战试验。将CL滤膜置于100mL HP水中并洗涤1分钟，然后将其转移至新鲜的HP水中并再次洗涤。该过程重复12次。

当置于100mL 100％乙腈(ACN)或者含有2％NaCl、1％三乙胺(TEA)、1％三氟乙酸(TFA)或50％ACN的HP水中时，对CL滤膜进行溶剂挑战试验，并洗涤1分钟。

用加热至25℃、40℃、60℃、80℃和100℃的100mL HP水对CL滤膜进行1分钟的温度挑战试验。

通过将滤膜暴露于一定pH值范围来测定经Trc处理的CL滤膜(100mm)的pH稳定性。用HCl调节洗涤溶剂(100mL HP水)的pH至pH 1、pH 3和pH 5，用HCl/NaOH得到pH 7，用NaOH调节得到pH 9、pH 11和pH 13。

对经肽处理和未处理的滤膜都进行洗涤处理。处理后，洗涤滤膜(用100mL HP水洗涤一次)，并在低温烘箱(55±5℃)中干燥过夜(16±1小时)。用如前文所述的溶血测试和CFU抗微生物生长测试或活力测试来研究保留活性的变化。

经肽处理的聚合物和纸滤膜的特性

选择固体基质以覆盖多种极性、滤膜特性和常规应用(表1)。通过温育溶液和溶血测试中吸光度的变化来测定肽吸附量。Trc的吸附量经计算在1-4μg/cm²之间(表2)。溶血测试通常给出比A₂₃₀测定更低的值，可能是因为它较不敏感或因为肽以不引起溶血活性的方式结合。基于吸光度方法，确定了GVHP(5.3±1.1μg/cm²)、HVLP(2.8±0.6μg/cm²)和聚碳酸酯(1.2±2.2μg/cm²)的保留GS量。不可能确定由于其它滤膜释放吸收性组分而导致的GS。溶血测试是不敏感的，因为GS仅在>10μg/mL下开始溶解红细胞。

表2：用于对吸附到经Trc提取物处理的不同滤膜上的肽进行定量的方法中获得的结果的总结

^a温育溶液中的Trc浓度(μg/mL)

^b通过在50％(v/v)乙腈中温育纤维素滤膜5天来实现解吸附

nd＝未检测到；–＝未确定；na＝不适用

进行Trc提取物的解吸附以确认在滤膜上吸附的肽的存在和身份。这在50％ACN(v/v)中进行，因为肽容易溶解在该溶剂中，因此有助于肽的解吸附。对来自经处理的纤维素滤膜的肽的解吸附提取物进行的UPLC-MS分析证实了存在主要的短杆菌酪肽和短杆菌色肽(图1A)，它们都存在于用于处理固体表面的原始肽提取物中(图1B)。没有观察到具有修饰的肽，例如羟基化、氧化、脱氨和糖基化(通过与降解的/水解的纤维素的美拉德反应)。

润湿性是亲水/疏水特性的指示，其可能因肽的吸附而改变，并且这种性质改变将是吸附到各种滤膜的肽的取向的指示。测定了未处理的和经处理的滤膜的润湿性(表3)，并且基于水滴完全吸收到滤膜中所花费的时间对未处理的滤膜进行疏水性评级。观察到纤维素滤膜非常亲水(在小于10秒内吸收水滴)，然后是HAWP、GSWP、CA、HVLP，之后是GVHP。观察到HDC和PC是疏水性的，因为水滴在30分钟内未被吸收。经Trc提取物和GS处理的PC、HDC和CL滤膜在疏水/亲水性质方面没有显示出可见的变化，而HDC在GS处理后仅显示出亲水性的轻微增加。Trc处理使得CA变得亲水得多，而GS也导致亲水性增加，表明极性氨基酸暴露于表面。Trc使HAWP滤膜更疏水，而短杆菌肽S使得滤膜更亲水。Trc和GS处理增加了其余滤膜的疏水性，表明与这些肽中的极性氨基酸残基的相互作用以及疏水性残基暴露于表面。

表3：用于本研究中的作为用环十肽处理的示例性材料的选定滤膜的润湿特性

在疏水/亲水特性方面观察到的变化程度将取决于肽有多少部分是某种取向。基于Trc类的两亲性质，可以推定，疏水性的增加意味着该肽以其亲水性序列(Asn-Gln-Tyr-Val-Orn/Lys)结合至表面，而留下疏水性序列(Leu-Phe-Pro-Phe-Phe)暴露于水，反之亦然。对于GS，亲水性缔合最可能通过阳离子性Orn残基发生，而疏水性缔合可能通过其余残基发生。

对滤膜的显微SEM分析显示，在经Trc处理和未处理的滤膜(GSWP、CA和CL)之间没有视觉差异，除了在经Trc处理的滤膜中纤维有轻微膨胀(结果未显示)。在所有情况下，滤膜孔结构和结构完整性似乎没有改变。将经Trc处理的CL滤膜(图2B)与暴露于靶细胞的经CL处理的滤膜(图2C和2D)进行比较，可以观察到这些滤膜表面上碎片形成的增加，但没有观察到完整的细胞，这表示细胞已裂解。这表明经处理的滤膜的活性是由于滤膜可能能够俘获靶细胞，而所结合的Trc可与靶细胞相互作用并裂解靶细胞。由于滤膜的亲水性质，短杆菌酪肽最可能通过肽中的亲水性残基吸附到滤膜上，并使该肽的疏水性残基暴露以与靶细胞相互作用并引起观察到的裂解。或者，可以是以下情况：当靶细胞与Trc涂层表面结合时，从滤膜结构中释放出了聚集的Trc类，特别是二聚Trc，已提出二聚Trc为活性结构(Munyuki等(2013)Biochemistry，44,7798-7806)。

经肽处理的聚合物和纸滤膜的抗微生物活性

使用一系列不同的基质对革兰氏阳性模型生物体藤黄微球菌进行抗菌测试，以研究吸附到固体表面的短杆菌酪肽的活性。使用48小时生长测试，其中在高营养环境中使用低细胞数以支持快速生长的细胞，除了CA滤膜之外的所有经Trc处理的滤膜都受到保护以免受藤黄微球菌的明显定殖(表4)。GS处理仅保护CL、HDC和HVLP免受藤黄微球菌的明显定殖(表4)，表明当细胞活跃生长时，对滤膜的Trc处理可能比GS处理更有效。

表4：使用CFU生长测试在高营养环境中获得的经Trc和GS处理的滤膜对生长中的藤黄微球菌的抗菌活性

使用低营养环境、高细胞计数和用于评估细菌代谢的Alamar Blue活力测试，评估经Trc提取物或GS处理的不同滤膜、表面和纳米纤维对于藤黄微球菌的更直接的短期杀灭(灭菌)。对于Trc提取物和GS处理，均再次观察到对HDC和CL滤膜的良好保护(图3A)。GS再次在HVLP滤膜中显示出良好的保护并且在除了PC之外的所有其他滤膜中显示出改善的活性。Trc处理提供了与GS类似的保护，除了对HVLP，在此情况下GS更加优越。然而，没有证明Trc在直接灭菌中有效，特别是对于更疏水的滤膜(例如PC)和其导致滤膜的疏水性增加的滤膜(HAWP、GSWP、HVLP和GSWP)(表4和3)。这可能是由于5μL培养物在滤膜上的扩展有限，限制了细菌与Trc涂覆的滤膜的其余部分的接触，因此该测试可能低估了总体滤膜活性。对于CA则相反，其中Trc显著增加亲水性，并导致增加的灭菌，如活力测试所检测的(表3和4)。当用Trc提取物处理时，对于含有CL的纳米纤维薄膜观察到了与CL滤膜类似的灭菌作用(图3B)。含有聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMM)的经Trc处理的纳米纤维也具有良好的灭菌活性，虽然这略小于具有CL的纳米纤维。在具有CL或PMM的纳米纤维中包含壳多糖不具有主要影响，但高壳多糖含量确实导致一些活性损失(图3B)。

发现对CL的Trc处理在每cm²至多10⁵个革兰氏阳性细菌细胞的挑战试验中提供了灭菌作用，所述细菌包括食物病原体单核细胞增生利斯特菌(图4)。然而，未证实经GS或Trc处理的CL滤膜对革兰氏阴性生物体的明显活性。滤膜保留了针对大多数环境真菌的中等抗真菌活性，如在高湿环境中使用经Trc处理的CL滤膜作为基质的单独的种子萌发研究所表明的(结果未显示)。

对吸附到CL和HDC滤膜以及含有CL的纳米纤维上的肽观察到的抗菌活性良好地预示了这些基质的应用，因为已经注意到生物体倾向于附着到CL表面以引发生物膜形成。它还开启了在用于可腐败产品的CL类保护性包装中使用短杆菌酪肽的可能性。针对其它合成聚合物基质的保留活性是这些环十肽作为固态灭菌剂在医药和工业中具有大量应用的潜力的良好指示。

经肽处理的基质的稳定性

根据Trc最佳地吸附于CL滤膜其并且在这些滤膜上长期保持活性(在18个月后保持超过80％的最初活性)的结果，选择CL滤膜用于进一步的稳定性测试。

使用多次洗涤、pH变化、不同溶剂和温育溶液的温度变化来测试CL滤膜上Trc活性的稳定性。发现基于滤膜的溶血活性，在12次洗涤之间没有统计学差异。关于对藤黄微球菌的抗菌活性，在洗涤1、4和6-12中的滤膜中，在每个洗涤步骤中所用的三个滤膜盘片中，仅观察到一个样品具有细菌菌落(在100mm滤膜盘上≤10CFU)。

用Trc处理的CL滤膜的保留活性证明是非常强的，在pH 1-11下几乎完全保留了两种指标溶血活性和抗菌活性(图5A)。pH的变化显示，与其它pH处理的滤膜相比，仅pH 13处理的滤膜的溶血活性有统计学显著的降低(图5A)。对藤黄微球菌的抗菌活性显示：在pH 9、11、13中每一点经历挑战试验的三个滤膜盘片中，仅有一个样品具有细菌菌落(在100mm滤膜盘片上≤10CFU)。在pH 11和pH 13观察到滤膜完整性的轻微劣化。通过对Trc处理的滤膜的高温洗涤挑战试验，没有观察到溶血活性或抗菌活性的统计学显著差异(图5B)。CL滤膜的杀菌活性对盐、稀酸和有机溶剂洗涤也保持稳定(图6)。确实影响活性的唯一溶剂是50％乙腈和强碱性1％TEA，其导致约40％的活性损失。

稳定性试验表明，短杆菌酪肽保持吸附于纤维素滤膜并保持活性，不论pH和温度如何变化，还是在用水、盐、稀酸和有机溶剂进行多次洗涤步骤后。

本发明的组合物提供了工业消毒剂的天然替代物，具有强劲的固态抗微生物特性，且没有与其相关的有害副作用。