一种延缓薯块根采后生理性变质的方法与流程

本发明属于植物学领域，更具体地，本发明涉及一种延缓薯类植物块根采后生理性变质的方法。

背景技术：

薯类植物主要指具有可供食用块根或地下茎的一类陆生作物，其产品器官是块根和块茎，生长在土壤中。

常见的薯类有木薯、甘薯、马铃薯、芋类、山药等。薯类有明显的营养优势。薯类食物能量低、水分高，含较多的碳水化合物。以100克马铃薯为例，能量仅为76千卡，约为同等重量大米的23％，水分含量是79.8％，为同等重量大米的5倍，是很好的低能量、高水分食物。薯类还供给一定量的碳水化合物(主要成分是淀粉，其含量为12.4-25.2％)，所以，薯类被公认为是兼有主食和蔬菜特性的天然健康食材。薯类基本不含脂肪，其脂肪含量仅为0.2％，是低脂肪食物。薯类蛋白质含量一般在1.1-2.2％之间，是不完全蛋白质，但赖氨酸的含量丰富，正好补充谷物所缺乏的赖氨酸。薯类含丰富的膳食纤维，为0.7-1.6％，是大米的1.7～4倍。膳食纤维可增加饱腹感，防止能量过剩，增加胃肠蠕动，通便防癌，预防心血管疾病、糖尿病和胆石症。薯类还含有多种维生素和矿物质。因此，薯类食品是较为健康的食品。

但是，收获后薯类植物的储藏根不耐贮藏，易变质。例如木薯收获后，必须在3天内加工，否则储藏根周边部位出现褐变或青褐变，并且呈现长的筋状，被称之为木薯特有的“采后生理性变质(post-harvestphysiologicaldeterioration，ppd)”。这种变质是由酚类等物质氧化所引起，会导致储藏根褐化及腐烂，影响其食用、加工及产品性能，给农民和淀粉及燃料乙醇加工企业造成严重的经济损失。据统计每年由于木薯采后生理性变质导致的损失都在收获量的5％以上，直接经济损失达2亿元以上。对于少量的储藏根，在收获后可通过立即封蜡、套袋或加工成干片来抑制生理性变质，但增加了原 材料成本，不适用于规模化木薯加工企业。采收前两周对木薯的茎杆进行修剪可在一定程度上延缓储藏根的采后生理性变质，但会导致储藏根的食用品质和淀粉质量大大降低，限制了该方法的应用。

至今还没有一种行之有效的方法可用于抑制薯类植物储藏根的采后生理性变质。因此，探索薯类植物采后生理性变质的内在生理生化变化，并研究其发生的原因、途径及其影响因素等，对有效抑制薯类植物采后生理性变质具有重要的理论和实践意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种延缓薯类植物块根采后生理性变质的方法。

在本发明的第一方面，提供一种延缓或抑制薯块根(储藏根)采后生理性变质的方法，所述的方法包括：以褪黑素处理薯块根。

在一个优选例中，使得薯块根在褪黑素溶液中浸泡，从而延缓或抑制薯块根采后生理性变质。

在另一个优选例中，所述的褪黑素溶液中，褪黑素的含量是：高于50mg/l。

在另一个优选例中，所述的褪黑素溶液中，褪黑素的含量是：50～3000mg/l；较佳地100～2000mg/l；更佳地200～1500mg/l；更佳地400～1200mg/l；如500、600、700、800、900或1000mg/l。

在另一个优选例中，所述的薯包括但不限于：木薯、甘薯、马铃薯、山药、芋等。

在本发明的另一方面，提供一种褪黑素的用途，用于延缓或抑制薯块根(储藏根)采后生理性变质；或用于制备延缓或抑制薯块根(储藏根)采后生理性变质的组合物(如溶液)。

在一个优选例中，所述的褪黑素用于减缓块根中h2o2含量增加。

在另一个优选例中，所述的褪黑素用于减缓块根中丙二醛(mda)含量增加。

在另一个优选例中，所述的褪黑素用于提高块根中sod或cat活性，提高根中sod或cat的基因的表达水平。

在另一个优选例中，所述的褪黑素用于提高谷胱甘肽还原酶(gr)活性，或所述的褪黑素用于提高megpx、mepx3或megst的基因表达水平。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、木薯储藏根生理性变质(ppd)发生过程。不同浓度(分别为0、10、50、100、250、500和1000mg/l)褪黑素溶液处理后，在不同的时间点(24h，48h和72h)的ppd发生。

图2、木薯储藏根ppd发生过程(500mg/l褪黑素溶液处理)。实验节点为0h、12h、24h、36h和48h。

图3、以褪黑素溶液或对照溶液处理储藏根切片，在不同时间点上，用imagej处理软件统计储藏根坏死斑点比例。

图4、以褪黑素溶液或对照溶液处理储藏根切片，在不同时间点上，荧光染料探针定位ppd过程中ros发生部位和积累量。

图5、以褪黑素溶液或对照溶液处理储藏根切片，在不同时间点上，imagej处理软件统计储藏根荧光强度。

图6、以褪黑素溶液或对照溶液处理储藏根切片，在不同时间点上，测定ppd过程中木薯储藏根h2o2含量的变化。

图7、以褪黑素溶液或对照溶液处理储藏根切片，在不同时间点上，ppd过程中木薯储藏根mda含量的变化。

图8、以褪黑素溶液或对照溶液处理储藏根切片，在不同时间点上，ppd过程中木薯储藏根sod和cat转录水平及酶活变化。

图9、以褪黑素溶液或对照溶液处理储藏根切片，在不同时间点上，ppd过程中储藏根apx和gr酶活变化。

图10、以褪黑素溶液或对照溶液处理储藏根切片，在不同时间点上，ppd过程中储藏根ros相关基因转录水平变化。

图11、以褪黑素溶液或对照溶液处理储藏根切片，在不同时间点上，ppd过程中储藏根内源褪黑素含量的变化。

图12、ppd过程中储藏根褪黑素合成基因(metdc1、metdc2、met5h、mesnat、mehiomt1、mehiomt2、measmt1、measmt2、measmt3)在不同时间点的表达变化。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次揭示了褪黑素可以应用于处理薯类植物，从而有效地延缓或抑制薯类植物块根采后的生理性变质。

如本文所用，所述的“薯”表示薯类植物，又称为薯类作物或根茎类作物，是指具有可供食用块根或地下茎的一类陆生作物。主要包括木薯、甘薯、马铃薯、山药、芋类等。

褪黑素

褪黑素又称为褪黑激素、美拉酮宁、抑黑素、松果腺素，是一种胺类激素，它存在于从藻类到人类等众多生物中，含量水平随每天的时间变化。其化学名称为n-乙酰基-5-甲氧基色胺，化学式为c13n2h16o2，结构式为：

在本发明中，所述的“褪黑素”可以是纯净形式存在的式i所示的化合物，或纯度大于85％的式i所示的化合物，也可以是含有褪黑素或其衍生物的提取物。

所述的褪黑素可提取自任何含有褪黑素或其衍生物(如盐或酯)的生物中。作为本发明的优选方式，所述的褪黑素也可通过化学合成的方式获得，包括以5-甲氧基吲哚为原料，经草酰基化、胺化、还原、乙酰化四步反应制得褪黑素；或以吲哚和氯乙胺为主要原料，经羟基化、氨乙基化、甲基化、乙酰 化制得褪黑素；或采取fischer吲哚合成法制得褪黑素；或以5-甲氧基吲哚-3-甲醛为主要原料，经缩合、还原、乙酰化三步反应制得褪黑素；或以游离基吲哚合成法制得褪黑素。

在本发明中，还包括褪黑素的盐，这种盐可以是褪黑素与无机酸或有机酸反应生成的盐。

本发明还包括含有褪黑素的组合物，所述的组合物包括：50～3000mg/l；较佳地100～2000mg/l；更佳地200～1500mg/l；更佳地400～1200mg/l，如500、600、700、800、900或1000mg/l的褪黑素；以及与之相容的溶剂。较佳地，所述的溶剂是水性溶剂，例如水。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

用途及处理方法

为了论证褪黑素的上述用途，本发明人以不同终浓度的褪黑素溶液处理木薯块根切片，实验结果表明，与对照组相比，适当浓度的褪黑素处理可明显延缓早期生理性变质(ppd)的发生，可以使得木薯块根切片中坏死斑点比例显著性降低。

基于本发明人的上述新发现，本发明提供了褪黑素、或其盐的用途，用于延缓或抑制薯块根(储藏根)采后生理性变质；或用于制备延缓或抑制薯块根(储藏根)采后生理性变质的组合物(如溶液)。

基于本发明的上述新发现，本发明还提供了一种延缓或抑制薯块根(储藏根)采后生理性变质的方法，所述的方法包括：以褪黑素处理薯块根。

任何将薯块根与褪黑素有效接触的方法均可以实现本发明的技术方案，例如，可将褪黑素涂布于薯块根上；或者，使得薯块根在褪黑素溶液中浸泡，从而延缓或抑制薯块根采后生理性变质。

作为本发明的优选方式，所述的褪黑素溶液中，褪黑素的含量是：高于50mg/l。较佳地，所述的褪黑素溶液中，褪黑素的含量是：50～3000mg/l；较佳地100～2000mg/l；更佳地200～1500mg/l；更佳地400～1200mg/l，如 500、600、700、800、900或1000mg/l。

本发明的方法简单、有效，具有良好的应用价值。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、表型观察

褪黑素结构式如下：

本实施例中，以木薯主栽品种华南205为研究材料，收获生长4个月的木薯储藏根清洗干净，切成约3-4mm切片进行预实验。切片置于28℃不同浓度的褪黑素溶液中(浓度分别为0、10、50、100、250、500和1000mg/l。褪黑素溶液的配制：褪黑素以少量的无水乙醇(浓度小于0.5％(v/v))助溶，用灭菌水定溶至需要浓度，过滤灭菌。108rpm悬浮培养，在不同的时间点(24h，48h和72h)取样观察。

结果如图1，与对照(0mg/l)相比，较低浓度(100-500mg/l)的褪黑素处理就可以延缓采后生理性变质(ppd)的发生，高浓度褪黑素处理(>1000mg/l)则显著抑制ppd的发生。因此，选取500mg/l浓度的褪黑素溶液对木薯储藏根ppd过程进行分析。

为避免悬浮造成的厌氧环境及培养过程中微生物污染造成的影响，后续实验优化条件如下：储藏根切片于500mg/l褪黑素溶液和对照(0mg/l褪黑素溶液)中浸泡2h后置于恒温(28℃)、恒湿(70％)和16h/8h光周期培养箱中观察ppd过程。实验节点为0h、12h、24h、36h和48h。

实验结果表明，与对照组(0mg/l)相比，500mg/l褪黑素处理可明显延缓早期ppd的发生(36h)，如图2。

利用imagej处理软件统计储藏根坏死斑点比例，结果如图3，可见与对照组相比，褪黑素处理组的坏死斑点比例显著性降低。

实施例2、木薯储藏根荧光染料染色和h2o2含量测定

1、木薯储藏根荧光染料染色

ppd是一个氧爆发的过程，其发生与活性氧(ros)的大量积累紧密相关(xuj等，enhancedreactiveoxygenspeciesscavengingbyoverproductionofsuperoxidedismutaseandcatalasedelayspostharvestphysiologicaldeteriorationofcassavastorageroots.plantphysiol161,1517-28)。本实施例中，分别选择特异染色ros的dhr和线粒体的mitotracker-deepredfm两种荧光染料探针，测定储藏根在ppd发生过程中ros发生的部位及积累量。

荧光染料探针定位ppd，方法如下：

木薯储藏根ros检测所选染色剂dihydrorhodamine123(dhr)和mitotracker-deepredfm购自分子探针公司(invitrogen，molecularprobes，usa)，dhr为ros特异染料，该染料本身无色，进入细胞后被ros氧化成为荧光产物，通过共聚焦显微镜可以观察到荧光；mitotracker-deepredfm为线粒体特异荧光染料[joojh等，roleofauxin-inducedreactiveoxygenspeciesinrootgravitropism[j].plantphysiology,2001,126(3):1055-1060；millerg等，unravelingδ1-pyrroline-5-carboxylate-prolinecycleinplantsbyuncoupledexpressionofprolineoxidationenzymes[j].thejournalofbiologicalchemistry,2009,284(39):26482-26492]。将木薯储藏根切成薄片，将5mm×5mm方块浸没于磷酸缓冲液(0.1mol/lph7.0)，分别加入终浓为50μmol/ldhr和250nmol/lmitotracker-deepredfm避光染色10min和20min。激光扫描共聚焦显微镜(fluoviewfv1000，olympus，japan)观察荧光信号，其中dhrex/em为488nm/515nm，mitotracker-deepredfmex/em为635nm/680nm。

荧光检测发现，储藏根切片维管束细胞在0h时仅可激发微弱的荧光信号，褪黑素处理的储藏根切片和对照(0mg/l)无明显差异。ppd发生24h后，对照组储藏根在木质部维管束细胞和薄壁细胞组织开始变质，激发强烈的荧光信号，然而褪黑素处理的储藏根切片并未激发强烈的荧光信号，与0h的 荧光信号无明显差异，说明褪黑素能够将木质部维管束细胞和薄壁细胞组织线粒体中ros积累量维持在正常水平，提示褪黑素参与细胞内ros的清除(图4和5)。ppd发生48h时，对照组与褪黑素处理的储藏根中都可检测到荧光信号，但褪黑素处理的储藏根中激发的荧光信号明显低于对照组的荧光信号。

2、木薯储藏根h2o2含量测定

为验证褪黑素在储藏根ppd发生过程中与ros的清除相关，对储藏根中h2o2含量进行了检测。

h2o2含量测定方法：

取1g叶片加入10ml0.1％预冷的tca溶液，冰浴上研磨，匀浆液12000g，15min。取1ml上清，添加1ml100mm磷酸盐缓冲液(pbs)(ph7.0)，2mlki(1mol/l)，摇匀，静置片刻，390nm测od值，根据标准曲线求得h2o2含量(velikovav等，oxidativestressandsomeantioxidantsysteminacidrain-treatedbeanplants：protectiveroleofexogenouspolyamines[j].plantscience,2000,151(1):59-66)。

结果发现，在ppd过程中，对照组储藏根中h2o2含量持续增加，而褪黑素处理的储藏根h2o2含量增加相对缓慢，如图6，提示褪黑素在ros清除过程中或ros逆转过程中发挥作用。

实施例3、mda含量测定

丙二醛(mda)是脂质过氧化所产生的可溶性副产物，其含量可作为膜脂过氧化程度的指标。mda还能与蛋白质等交联导致酶失活或膜系统受损，因此测定mda的积累可在一定程度上了解木薯ppd过程中膜脂过氧化的程度和细胞受损程度(vanderschurenh等，2014.large-scaleproteomicsofthecassavastoragerootandidentificationofatargetgenetoreducepostharvestdeterioration.plantcell26,1913-24)。

以褪黑素溶液或对照溶液处理储藏根切片，在不同时间点上，测定ppd过程中木薯储藏根mda含量的变化。

mda含量测定方法(dhindsars等，droughttoleranceintwomosses: correlatedwithenzymaticdefenceagainstlipidperoxidation[j].journalofexperimentalbotany,1981,32(1):79-91)：

称取剪碎材料1g，加入2ml10％tca和少量石英砂，迅速研磨至匀浆，再加8mltca进一步研磨，4,000g匀浆离心10min，上清液为样品提取液；吸取离心的上清液2ml(对照加2mlddh2o)，加入2ml0.6％tba溶液，混匀后于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液测定532nm，600nm和450nm波长下的吸光值；计算公式如下：

c(μmol/l)＝6.45×(od532-od600)-0.56×od450。

结果发现，ppd过程中对照组储藏根的mda含量快速增加，12h达到峰值，随后逐渐降低，而褪黑素处理的储藏根mda含量则逐渐增加，但均低于对照组储藏根中mda的含量，如图7，提示褪黑素通过保护膜系统降低ppd造成的伤害。

实施例4、ppd过程中储藏根sod和cat基因转录水平及酶活检测

本发明人之前的研究表明过表达木薯mecu/znsod和mecat1基因可以延缓木薯ppd的发生，这两个酶可清除体内h2o2以降低对植物体的伤害(xuj等，enhancedreactiveoxygenspeciesscavengingbyoverproductionofsuperoxidedismutaseandcatalasedelayspostharvestphysiologicaldeteriorationofcassavastorageroots.plantphysiol161,1517-28)。

因此，本发明对ppd过程中过氧化物酶(sod)和过氧化氢酶(cat)的酶活性及其转录水平进行分析。

取1g的样品加入5ml酶提取缓冲液(50mmol/l磷酸缓冲液，1％pvp，1mmol/ledta)研磨，4℃，10,000rpm离心20min，取上清，将酶液转移至ep管中(约3-4ml)，置冰上待用。

1、sod酶活测定方法

显色反应：取透明度、质地相同玻璃试管5支，3支为测定、2支为对照，按表1加入试剂。

表1

按照表1混匀后，给1支对照管罩上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光，与其他各管同时置于5000lx日光灯下反应10min(要求各管照光情况一致，反应温度控制在25～35℃之间，视酶活性高低适当调整反应时间)。当对照管变蓝，而样品管仍为黄色时，结束反应，测定各管的吸光度。

sod活性＝(od0-ods)×vt/od0×0.5×fw×v1；

其中，od0：照光对照光管的光吸收值；ods：样品管的光吸收值；vt：样液总体积(ml)；v1：测定时样品用量(ml)；fw：样品鲜重(g)。

2、cat酶活测定

2ml反应体系＝1.6ml酶提取缓冲液+0.2ml0.1mol/l酶液+0.2ml0.1mol/l的h2o2。加完h2o2立即计时，试管上下颠倒混匀，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测5min。以1min内od240减少0.1的酶量为1个酶活单位(u)。

3、转录水平分析

1μg总rna在反转录酶revertraace(货号trt-101，toyobo，上海)作用下于20μl反应体系中合成cdna，并用于real-timepcr检测。pcr反应在bio-radcfx96荧光定量pcr仪上进行，20μl体系中包括2×sybrmastermix(货号qpk-201，toyobo，上海)10μl，cdna50ng，forwardprimer和reverseprimer各400nmoll^-1。反应条件为：95℃变性1min；95℃变性15sec，60℃退火延伸30sec，40-50个循环数；actin基因作为内参。每个样品三个重复，根据相对ct值计算所检测基因的相对表达量，单个样本中各基因的相对表达量计算公式为：δct＝ct(targetgene)-ct(actin)；特定基因在两个样本 中的相对表达量计算公式为：δδct＝δct(sample1)-δct(sample2)。

所用引物：

meactinf：tgatgagtctggtccatcca(seqidno:1)，

r：cctcctacgacccaatctca(seqidno:2)；

mecu/znsodf：atgttcatgcccttggagac(seqidno:3)，

r：gatcaccagcatgacgaatg(seqidno:4)；

mecat1f：tgggaaacaacttccctgtc(seqidno:5)，

r：acatcatcgaagaaccaggc(seqidno:6)。

结果表明，在ppd过程中，对照组与褪黑素处理的储藏根sod酶活性均逐渐增加而cat酶活性均逐渐降低，但褪黑素处理的储藏根sod和cat活性均高于对照组(图8a和b)。通过基因表达分析发现尽管这两个基因的表达模式不同但褪黑素处理的储藏根中目的基因的表达水平均高于对照组(图8c和d)。

结果提示，褪黑素通过调控ros清除相关基因的表达而延缓ppd的发生。

实施例5、ppd过程中储藏根与ros相关其它基因转录水平及酶活检测

前人研究结果表明，其它与抗氧化相关的酶，如谷胱甘肽还原酶(gr)参与调控ppd过程，而抗坏血酸过氧化物酶(apx)的作用不明显(vanderschurenh等，2014.large-scaleproteomicsofthecassavastoragerootandidentificationofatargetgenetoreducepostharvestdeterioration.plantcell26,1913-24)。

为进一步研究gr与apx是否在ppd过程中直接发挥作用，以及褪黑素与其它ros清除相关酶之间的关系，本发明人对gr和apx的酶活性及其基因转录水平进行了检测。

1、gr酶活测定

蛋白提取过程同sod提取方法，谷甘肽还原酶(gr，ec1.6.4.2)活性参照craceandlogan的方法测定(参见gracescandloganba.acclimationoffoliarantioxidantsystemstogrowthirradianceinthreebroad-leavedevergreenspecies[j].plantphysiology,1996,112(4):1631-1640)，即测定340nm处吸光 度3min内的下降。1ml反应体系包括50mm磷酸缓冲液(ph7.8)，2mmna2edta，0.15mmnadph，0.5mmgssg和100μl酶提取液，加入nadph启动反应。将每克样品1min内氧化1mmol/lnadph所需的酶量定义为一个酶活单位，计算酶活时所使用的摩尔系数为6.2mmoll^-1cm^-1。

2、apx酶活测定

蛋白提取过程同sod提取方法，但酶提取缓冲液中加1mmol/lasa。1ml反应体系加入0.9ml酶提取缓冲液，0.1ml上清，10μl0.01mol/l的h2o2。加入h2o2后读取第10s和第40s的290nm吸光度^[55]。asa氧化量按消光系数2.8mmcm^-1计算，酶活性可用μmolasa/(gfw·h)表示。参见nakanoy,asadak.hydrogenperoxideisscavengedbyascorbate-specificperoxidaseinspinachchloroplasts[j].plantandcellphysiology,1981,22(5):867-880。

消光系数的定义：ε＝δod/cl→c＝δod/εl

根据定义酶活性为：δodv/εltfw

式中：δod为吸光度的变化；c为被测物质的摩尔浓度；l为比色杯光径(cm)；ε为消光系数；fw为鲜重(g)；t为时间(s)。

3、基因转录水平检测

基因转录水平检测所用的引物如下：

meapx2f：cattgataaggccaggagga(seqidno:7)，

r：ttgttagcagcatgaccctg(seqidno:8)；

megpxf：tcaagtcctcacttgggtcc(seqidno:9)，

r：tgagagaaacctccttccca(seqidno:10)；

mepx3ftcacttggccttacccaaac(seqidno:11)，

r：caatggcaattcttgggtct(seqidno:12)；

medharf：gatgggacagaacaggcatt(seqidno:13)，

r：gtgactcaggaaccgaccat(seqidno:14)；

megstf：cagagagggcaccagaactc(seqidno:15)，

r：aagaagaccaacgccaaatg(seqidno:16)；

megrf：tttgggggtgatattgagga(seqidno:17)；

r：atgaggaccaacaaccttgc(seqidno:18)。

所用的内参同前。

与先前的结果一致，在ppd过程中apx的酶活性无明显变化(图9a)，然而在ppd发生的早期meapx表达水平较高而在后期表达水平降低(图10a)。medhar基因的表达水平在早期也没有发生明显的变化(图10d)。在ppd过程中对照组与褪黑素处理的储藏根中gr酶活性均逐渐增加，但褪黑素处理的储藏根gr活性高于对照组(图9b)，megr(编码gr)转录表达水平也有相似的结果(图10f)。

本发明人进一步分析了megpx、mepx3和megst等其它ros清除途径中基因的表达模式(图10b、c和e)。结果表明，ppd过程中褪黑素处理的储藏根中这些基因的表达水平整体趋势上均高于对照组，提示褪黑素通过调控相关抗氧化酶活性以维持ros的平衡，从而延缓ppd的发生。

实施例6、褪黑素合成基因转录水平、含量检测

上述研究结果表明，褪黑素可能通过维持体内ros的平衡以延缓ppd的发生，但不确定ppd是否可诱导褪黑素的产生以维持体内ros的动态平衡。

因此，本发明人对ppd过程中木薯储藏根内源褪黑素的含量进行了定量分析。

1、褪黑素含量检测

60℃烘干的木薯块根样品碾成细粉，精密称取100mg干重的，三个重复。加入甲醇1.0ml，称重；超声波(80hz，45℃)提取30min后，再称重；用甲醇补足重量。13000r/min离心取上清液0.5ml，用滤膜对上清进行过滤(0.2μm×25mm,millipore)。利用melatonin(mt)elisakit(melatoninelisa，ibl-hamburg,germany)测定褪黑素含量。

结果表明，木薯储藏根中褪黑素含量较低，但在ppd过程中内源褪黑素含量在12h和36h出现两个峰值，提示褪黑素在ppd过程中具有直接的调控作用，如图11。

2、褪黑素合成相关基因转录水平检测

早期研究表明，水稻褪黑素合成途径中相关的基因在多种胁迫条件下可 被诱导表达(parks,leed-e等，2013.melatonin-richtransgenicriceplantsexhibitresistancetoherbicide-inducedoxidativestress.journalofpinealresearch54,258-63)。本发明人检测了木薯储藏根ppd过程中褪黑素合成基因表达情况。

所用引物如下：

metdc1f：agcactgcagcttttgttgg(seqidno:19)，

r：ttgaagcaggtgaagcaagc(seqidno:20)；

metdc2f：agtgttgccggatttttggg(seqidno:21)，

r：ttcaagctctgttgcagcag(seqidno:22)；

mesnatf：aagaagctgattggcatggc(seqidno:23)，

r：caataagagccttgccaagacc(seqidno:24)；

met5hf：tcggcggaatttgtgattgc(seqidno:25)，

r：attctcaggagcagcaccac(seqidno:26)；

measmt1f：aatgcgcagttgagcttcac(seqidno:27)，

r：tgtggtgggattttgatggg(seqidno:28)；

measmt2f：ccgacaaaagtgaactctctgc(seqidno:29)，

r：ttggctgaagcaaagaagcc(seqidno:30)；

measmt3f：tgtttggagagccactttgg(seqidno:31)，

r：acttgacaaccactgccttg(seqidno:32)；

mehiomt1f：accgccgaaactcaaatgac(seqidno:33)，

r：atttcaagcaggtcgagctc(seqidno:34)；

mehiomt2f：agatgggttgtttgcgatgc(seqidno:35)，

r：tgagcaccttcacccttttc(seqidno:36)；

所用的内参同前。

结果发现，四个褪黑素合成相关基因metdc、met5h、mesnat和measmt在ppd发生初期(12h)下调表达，但是在长期过程中明显上调表达(图12a-d，g-i)，mehiom基因在整个ppd过程中均被上调表达(图12e-f)。

褪黑素含量及转录表达水平检测结果表明，ppd会诱导褪黑素的合成，褪黑素在ppd过程中可能作为一个信号对ros相关基因的表达进行调控，以清除体内h2o2，从而延缓木薯储藏根ppd的发生。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。