一种滁菊株系离体再生的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种滁菊株系离体再生的方法。
【背景技术】
[0002]源菊(DendranthemamorifoliumCV.‘chuju’)，是菊科菊属多年生草本植物，主要产于安徽滁州，因此又被叫做安徽滁菊。以花入药，属安徽省四大著名道地药材，名列全国四大药菊之首，属药、茶兼用佳品，具有极高的药用、保健价值。
[0003]现代药理检测分析表明，滁菊富含黄酮、挥发油和8种人体必需氨基酸;此外，滁菊中富含锌和砸等10种微量元素，其中“砸”的含量显著高于其它菊花品种。由于锌和砸为人体必不可少的两种微量元素，参与机体的多种代谢过程，在清除人体自由基，保护心血管，预防动脉粥样硬化，调节血糖及保护肝脏等方面具有重要作用。由于滁菊富含上述有效成分，长期饮用滁菊可以清热解毒、舒筋活血、护肝明目、增强人体免疫力；同时对高血压，冠心病，动脉硬化疗效显著。
[0004]研究还发现滁菊对SRAS病毒、癌症(尤其是肝癌)等具有良好的预防作用，对糖尿病也具有明显的治疗作用。近年来，随着滁菊药用和保健价值的不断深入研究及国家标准《原产地域产品滁菊》的实施，市场对滁菊的需求量越来越大，使得滁菊的产业化栽培发展面临着前所未有的机遇。但缺乏高效的优质种苗繁育技术，成为制约其产业化开发的瓶颈。
[0005]在生产上，滁菊的繁殖主要采用分株、压条和嫁接等传统的无性繁殖手段。繁殖过程分别存在繁殖数量有限，管理不便及繁殖过程繁琐等问题；同时由于多年的田间栽培，使滁菊面临着品种退化、产量降低、品质变劣和病虫害严重等问题。采用常规育种方法对滁菊进行品种改良，远不能适用菊农对品种产量和品质的要求。而采用组培快繁技术，可在短期内获得大量的、遗传背景一致的优良种苗，以满足规模化种植对滁菊优质种苗的需求。另外，在此基础上对滁菊优良品种进行相应的遗传改良研究也迫在眉睫。
[0006]目前有关滁菊组培再生的研究较少，主要以利用叶片为外植体，通过间接诱导愈伤组织的对滁菊进行快繁或通过茎尖繁殖培养脱毒滁菊，普遍存在繁殖系数低的问题。因此，针对当前滁菊繁育过程中所存在的诸多问题，急需开发一种滁菊株系离体再生的方法，以满足对滁菊优良株系的快速繁殖和品种改良的需求。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于运用植物组织培养技术，提供一种滁菊株系离体再生的方法。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案:一种滁菊株系离体再生的方法，包括以下步骤:
[0008](I)取田滁菊株系的新生未木质化的带腋芽茎段为外植体，对其表面进行消毒处理；
[0009](2)将茎段接种于不定芽诱导培养基中，进行I?2周光照培养，待茎段腋芽萌发，并在腋芽周边诱导出不定芽丛；
[0010](3)培养2?3周后，将带有不定芽丛的茎段转接于增殖培养基中进行不定芽的增殖和伸长培养；
[0011](4)待芽长至2?3cm，转至生根培养基中进行生根；
[0012](5)光照培养3?4周，待幼苗长至3?4cm并带有2?4片真叶时，进行炼苗并移栽，获得滁菊再生植株。
[0013]优选地，所述步骤(I)的茎段为取材于田间筛选出的滁菊优良株系新生的未木质化枝条。
[0014]优选地，所述步骤(I)的中所述的带腋芽茎段为外植体经初步消毒后，于无菌操作台内进行表面消毒。
[0015]优选地，所述初步消毒是指茎段去叶后分装于500ml烧杯中，于流水下冲洗10?20min，期间添加I?2ml洗涤液冲洗，并不断摇晃。
[0016]优选地，所述茎段表面消毒是指茎段剪切成4?6cm大小，于无菌操作台中，经无菌水冲洗2?3遍;再用75%酒精进行表面消毒10?30s，无菌水冲洗3?5遍;之后再经0.1%的HgCl2消毒I?3min，最后用无菌水冲洗6?8遍，消毒期间不停地摇动。
[0017]优选地，所述步骤(2)中，用于接种的茎段是指茎段在接种前切去两端消毒损伤部位，然后切成0.3?0.6cm大小的切段备用，每个切段带至少带有一个腋芽。
[0018]优选地，所述步骤(2)中，茎段接种方式为竖直放置于不定芽诱导培养基中。
[0019]优选地，所述步骤(2)中，所述诱导培养基包括:MS+0.2?2.0mg/L 6_BA+30g/L蔗糖+7.0g/L 琼脂，pH=5.8。
[0020]优选地，所述步骤(3)中，所述增殖培养基包括:MS+0.I?0.75mg/L 6-BA+0.0?
0.5mg/L NAA+30g/L鹿糖+7.0g/L琼脂，pH=5.8。
[0021 ] 优选地，所述步骤(3)中，所述生根培养基包括:1/2MS+0.0?1.0mg/L IBA+20g/L鹿糖+7.0g/L 琼脂，pH=5.8。
[0022]本发明所提供的一种滁菊株系离体再生的方法，具体涉及以滁菊野外优良株系当年生枝条的未木质化茎段为外植体，通过直接诱导丛生芽再生对滁菊优良株系进行高效快速繁殖。
[0023]本发明具有以下突出优点:
[0024]其一，茎段为取材于野外多年生滁菊优良株系的新生未木质化的枝条，一方面能保持母本植株的种质特性;另一方面取材方便、材料丰富;可以实现对野外滁菊优良单株的快繁，实现品种培育；
[0025]其二，再生过程中外植体消毒程序简单，消毒时间短，对外植体的毒害较小；
[0026]其三，丛生芽再生效率高，诱导率最高达到100 % ；
[0027]其四，再生速度快，繁殖系数高，且能实现对获得的无菌苗茎段进行进一步的扩大繁殖，为优良滁菊株系的快速繁殖和遗传改良提供了重要的技术支持。
[0028]因此，本发明所提供的滁菊株系离体再生的方法，不仅为滁菊优良株系的快速繁殖和规模化生产提供了技术支撑，同时也为后期滁菊的品种改良奠定了基础。
【附图说明】
[0029]图1滁菊茎段腋芽的萌发
[0030]图2茎段腋芽处不定芽丛的诱导
[0031]图3不定芽芽的增殖和伸长
[0032]图4不定芽生根
[0033]图5滁菊再生植株的炼苗、驯化
【具体实施方式】
[0034]下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。
[0035]实施例1
[0036]—种滁菊株系离体再生的方法，具体操作如下:
[0037]1、从大田选取生长良好的多年生滁菊优良株系，剪取新生的20d苗龄的未木质化的枝条；
[0038]2、去叶后，分装于500ml烧杯中添加Iml洗涤剂，于流水冲洗1min;然后剪切成4cm大小的茎段，于无菌操作台中，用无菌水冲洗3遍后用75%酒精消毒20s，无菌水冲洗5遍，之后用0.1%的升汞消毒lmin，最后用无菌水冲洗6遍，消毒期间不停的摇动。消毒后将茎段两端坏死部位切除，再将茎段切成0.3cm左右的切段备用；
[0039]3、将茎段切段竖直接种于不定芽诱导培养基中进行腋芽的萌发和不定芽的诱导，经过第I周的光照培养后茎段腋芽萌发，再光照培养I周后腋芽周边诱导出不定芽丛，腋芽萌发率为100%，不定芽的诱导率为85.7% ;不定芽诱导培养基为MS+0.2mg/L 6_BA+30g/L鹿糖+7.0g/L琼脂，pH=5.8 ；
[0040]4、继续培养2周后，将不定芽丛转接于不定芽增殖培养基中进行不定芽的增殖和伸长培养，光照培养3周后获得大量伸长的不定芽丛，平均每个外植体产生5.8个不定芽;不定芽增殖培养基为:MS+0.lmg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH=5.8。
[0041]5、将高度为2?3cm的不定芽转至生根培养基中培养2周，获得伴有细长根系的完整再生植株，滁菊无菌苗生根率高达100 %，生根培养基为:l/2MS+20g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH=5.8；
[0042]6、光照培养3?4周，待幼苗长至3?4cm并带有2?4个真叶时，进行炼苗和移栽，获得健壮的滁菊再生植株。
[0043]实施例2
[0044]—种滁菊株系离体再生的方法，具体操作如下:
[0045]1、从大田选取生长良好的多年生滁菊优良株系，剪取新生的30d苗龄的未木质化的枝条；
[0046]2、去叶后，分装于500ml烧杯中添加2ml洗涤剂，于流水冲洗15min;然后剪切成5cm大小的茎段，于无菌操作台中，用无菌水冲洗3遍后用75%酒精消毒10s，无菌水冲洗3遍，之后用0.1%的升汞消毒2min，最后用无菌水冲洗7遍，消毒期间不停的摇动。消毒后将茎段两端坏死部位切除，再将茎段切成0.4cm左右的切段备用；
[0047]3、将茎段切段竖直接种于不定芽诱导培养基中进行腋芽的萌发和不定芽的诱导，经过第I周的光照培养后茎段腋芽萌发(图1)，再光照培养I周后腋芽周边诱导出不定芽丛(图2)，腋芽萌发率为100%，不定芽的诱导率为100%;不定芽诱导培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+30g/L鹿糖+7.0g/L琼脂，pH=5.8 ；
[0048]4、继续培养2周后，将不定芽丛转接于不定芽增殖培养基中进行不定芽的增殖和伸长培养，光照培养3周后获得大量伸长的不定芽丛(图3)，平均每个外植体产生11.5个不定芽;不定芽增殖培养基为:MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH=5.8；
[0049]5、将高度为2?3cm的不定芽转至生根培养基中培养2周，获得完整的再生植株(图4)，滁菊无菌苗生根率为100%，根系长而健壮，生根培养基为:1/2MS+0.2mg/L IBA+20g/L鹿糖+7.5g/L琼脂，pH=5.8 ；
[0050]6、光照培养3?4周，待幼苗长至3?4cm并带有2?4个真叶时，进行炼苗和移栽，获得健壮的滁菊再生植株(图5)。
[0051 ] 实施例3
[0052]一种滁菊株系离体再生的方法，具体操作如下:
[0053]1、从大田选取生长良好的多年生滁菊优良株系，剪取新生的45d苗龄的未木质化的枝条；
[0054]2、去叶后，分装于500ml烧杯中添加2ml洗涤剂，于流水冲洗20min;然后剪切成6cm大小的茎段，于无菌操作台中，用无菌水冲洗2遍后用75%酒精消毒30s，无菌水冲洗4遍，之后用0.1%的升汞消毒3min，最后用无菌水冲洗8遍，消毒期间不停的摇动。消毒后将茎段两端坏死部位切除，再将茎段切成0.6cm左右的切段备用；
[0055]3、将茎段切段竖直接种于不定芽诱导培养基中进行腋芽的萌发和不定芽的诱导，经过第I周的光照培养后茎段腋芽萌发，再光照培养I周后腋芽周边诱导出不定芽丛，腋芽萌发率为100%，不定芽的诱导率为80%;不定芽诱导培养基为MS+2.0mg/L 6_BA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH=5.8 ；
[0056]4、继续培养2周后，将不定芽丛转接于不定芽增殖培养基中进行不定芽的增殖和伸长培养，光照培养3周后获得大量伸长的不定芽丛，平均每个外植体产生7.6个不定芽;不定芽增殖培养基为:MS+0.75mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH=5.8 ；
[0057]5、将高度为2?3cm的不定芽转至生根培养基中培养2周，获得完整的再生植株，滁菊无菌苗生根率为100%，根多而短粗，生根培养基为:1/2MS+1.0mg/L IBA+20g/L蔗糖+7.5g/L 琼脂，ρΗ=5.8;
[0058]6、光照培养3?4周，待幼苗长至3?4cm并带有2?4个真叶时，进行炼苗和移栽，获得健壮的滁菊再生植株。
[0059]实施例4
[0060]一种滁菊株系离体再生的方法，具体操作如下:
[0061]1、取所获得的苗龄滁菊优良株系组培无菌苗的茎段，切成0.4cm大小，每个茎段至少带一个腋芽；
[0062]2、将茎段切段竖直接种于不定芽诱导培养基中进行腋芽的萌发和不定芽的诱导，经过2周的光照培养，腋芽萌发并在腋芽周边诱导出不定芽丛，不定芽的诱导率为100%;不定芽诱导培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH=5.8;
[0063]3、继续培养2周后，将不定芽丛转接于不定芽增殖培养基中进行不定芽的增殖和伸长培养，光照培养3周后获得大量伸长的不定芽，平均每个外植体产8.0个不定芽;不定芽增殖培养基为:MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH=5.8 ；
[0064]将高度为2?3cm的不定芽转至生根培养基中培养2周，获得完整的再生植株，滁菊无菌苗生根率为100%，根系长而健壮，生根培养基为:l/2MS+0.2mg/L IBA+20g/L蔗糖+7.5g/L 琼脂，ρΗ=5.8;
[0065]5、将上述滁菊无菌苗的茎段切成0.5cm大小，每个茎段带有至少一个腋芽，接种于上述不定芽诱导和增殖培养基中进行不定芽的诱导和增殖，平均每个茎段可产生12个左右不定芽;并将增殖后的不定芽接种于上述相同的伸长和生根培养基中进行不定芽的伸长和生根培养；
[0066]6、光照培养3?4周，待幼苗长至3?4cm并带有2?4个真叶时，进行炼苗和移栽，获得健壮的滁菊再生植株。
[0067]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种滁菊株系离体再生的方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)取田滁菊株系的新生未木质化的带腋芽茎段为外植体，对其表面进行消毒处理； (2)将茎段接种于不定芽诱导培养基中，进行I?2周光照培养，待茎段腋芽萌发，并在腋芽周边诱导出不定芽丛； (3)培养2?3周后，将带有不定芽丛的茎段转接于增殖培养基中进行不定芽的增殖和伸长培养； (4)待芽长至2?3cm，转至生根培养基中进行生根； (5)光照培养3?4周，待幼苗长至3?4cm并带有2?4片真叶时，进行炼苗并移栽，获得滁菊再生植株。2.根据权利要求1所述的一种滁菊株系离体再生的方法，其特征在于:所述步骤(I)的茎段为取材于田间筛选出的滁菊优良株系新生的未木质化枝条。3.根据权利要求1所述的一种滁菊株系离体再生的方法，其特征在于，所述步骤(I)的中所述的带腋芽茎段为外植体经初步消毒后，于无菌操作台内进行表面消毒。4.根据权利要求3所述的一种滁菊株系离体再生的方法，其特征在于，所述初步消毒是指茎段去叶后分装于500ml烧杯中，于流水下冲洗10?20min，期间添加I?2ml洗涤液冲洗，并不断摇晃。5.根据权利要求3所述的一种滁菊株系离体再生的方法，其特征在于，所述茎段表面消毒是指茎段剪切成4?6cm大小，于无菌操作台中，经无菌水冲洗2?3遍;再用75 %酒精进行表面消毒10?30s,无菌水冲洗3?5遍;之后再经0.1%的HgCl2消毒I?3min，最后用无菌水冲洗6?8遍，消毒期间不停地摇动。6.根据权利要求1所述的一种滁菊株系离体再生的方法，其特征在于:所述步骤(2)中，用于接种的茎段是指茎段在接种前切去两端消毒损伤部位，然后切成0.3?0.6cm大小的切段备用，每个切段带至少带有一个腋芽。7.根据权利要求1所述的一种滁菊株系离体再生的方法，其特征在于:所述步骤(2)中，茎段接种方式为竖直放置于不定芽诱导培养基中。8.根据权利要求1所述的一种滁菊株系离体再生的方法，其特征在于:所述步骤(2)中，所述诱导培养基包括:MS+0.2?2.0mg/L 6_BA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH=5.8。9.根据权利要求1所述的一种滁菊株系离体再生的方法，其特征在于:所述步骤(3)中，所述增殖培养基包括:MS+0.I ?0.75mg/L 6-BA+0.0?0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼月旨，ρΗ=5.8。10.根据权利要求1所述的一种滁菊株系离体再生的方法，其特征在于:所述步骤(3)中，所述生根培养基包括:1/2MS+0.0?1.0mg/L IBA+20g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH=5.8。
【专利摘要】本发明公开一种滁菊株系离体再生的方法，取田间滁菊株系的新生未木质化的带腋芽茎段为外植体，对其表面进行消毒处理；将茎段接种于不定芽诱导培养基中，1～2周光照培养，待茎段腋芽萌发，并在腋芽周边诱导出不定芽丛；培养2～3周，将带有不定芽丛的茎段转接于增殖培养基中进行不定芽的增殖和伸长培养；待芽长至2～3cm，转至生根培养基中进行生根；光照培养3～4周，待幼苗长至3～4cm并带有2～4片真叶时，进行炼苗并移栽，获得滁菊再生植株。本发明具有繁殖速度快，繁殖系数高，一次扩大培养后，平均每个外植体至少产生数十个丛生芽，保持滁菊母本植株优良特性；为优良滁菊株系快速规模化繁殖和遗传改良提供技术支持。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105706933
【申请号】CN201610124391
【发明人】侯金艳, 吴丽芳, 马朝东
【申请人】中国科学院合肥物质科学研究院