一种高效快速的梨叶片再生出不定芽的方法与流程

本发明属于生物技术与育种的范畴，涉及梨叶片再生的方法，具体涉及一种高效快速的梨叶片再生出不定芽的方法及培养基。
背景技术：
：梨是以无性繁殖为主的多年生木本植物，世代周期长，遗传上杂合程度高、童期长，育种时费时、费力、投入高。以植物组织培养、离体组织再生为主体的遗传转化技术在梨上的应用，极大的推动了梨的种质创新和新品种选育进程，成为梨基因工程育种的一个有效途径。但相对于其他物种来说，梨的遗传转化研究进展缓慢，遗传转化效率很低。其主要原因在于梨品种再生困难，再生率低、不同品种之间再生率相差很大，尤其是经过侵染，共培养、暗培养等一系列操作后，其再生出不定芽的机率更低。叶片再生作为遗传转化的前提和基础，获得高的再生率，显得极为重要。梨叶片再生率很大程度上取决于梨的基因型，关于梨离体培养的研究很多，但是大多数都是西洋梨品，也有关于砂梨的报道，如翠冠、雪青、幸水、丰水等，关于白梨系统的再生报道很少，且其再生率普遍很低。因此在白梨系统中寻找到再生率高的品种，对推进遗传转化技术在东方梨尤其是白梨品种中的应用具有极其重要的意义，对于东方梨品种品质改良和创新品种影响巨大，是梨育种方面的突破。雪花梨(PyrusbretschneideriRehd.)属白梨系统，至今已有2000多年的栽培历史。是河北省传统的大宗出口水果，在国内外久负盛誉。一般单果重300g，果肉洁白，细脆而嫩，汁多味甜，还含有果酸，矿物质及多种维生素等营养成分，具有很高的食用价值和药用价值。但是近年来，由于在生产中出现的管理粗放，农药、化肥使用不合理等问题，导致梨树品种品质严重退化，果实外观比较差，果皮粗糙、果实石细胞含量较高，口感差，严重影响了其鲜果品质和市场价值。随着国内外果品贸易竞争的日益激烈，生产经营者也意识到果实品质的优劣直接关系到产业能否在市场竞争中获得长足发展。因此，对雪花梨品种品质改良迫在眉睫。技术实现要素：本发明的目的在于以雪花梨叶片为材料对影响雪花梨叶片再生的因素进行探索，建立了雪花梨组培苗的高效扩繁体系，提供一种高效快速的梨叶片再生出不定芽的方法及培养基，以解决东方梨品种再生困难，遗传转化体系在东方梨品种难以应用的问题。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种高效快速的梨叶片再生出不定芽的方法，包括：获取无菌组培苗、诱导产生不定芽、不定芽的初代培养和继代培养等。包括以下具体步骤：1)梨无菌组培苗的获取：剪取带芽梨树枝条，置于2％蔗糖溶液中，在温度25-28℃下催芽；待腋芽萌发后，将枝条剪成茎段，每个茎段带3个芽，流水冲洗；将芽切下，芽消毒后，接种于继代培养基：MS+0.1-0.3mg/LIBA+1.8-2.2mg/L6-BA+25-35g/L蔗糖+6-7g/L琼脂上，培养基pH5.8-6.0，每隔30-60d继代培养一次，获得组培苗；2)叶片处理：取当次继代培养20-50d，平展、健壮、肥厚的保留叶柄的组培苗叶片，根据叶片大小，垂直于叶片主脉横切2-3刀，叶片远轴面向下接种于诱导培养基上；所述的诱导培养基为：NN69+1.0-2.0mg/LTDZ+0.2-0.5mg/LIBA+25-35g/L蔗糖+8-10g/L琼脂，培养基pH为5.8-6.0；3)叶片暗培养、光培养：将叶片置于避光处暗培养，培养皿倒置，每隔7d换一次培养基，在温度25-28℃下暗培养14-21d，再置于光下培养，光周期(昼/夜)14/10h(即14h/d)，光照强度2000-4000lx，温度25-28℃，培养皿正面放置，每隔10d换一次培养基，不定芽产生后，将带芽叶片置于继代培养基上继续培养，诱导其分化出更多的不定芽；所述的继代培养基为：MS+0.1-0.3mg/LIBA+1.8-2.2mg/L6-BA+25-35g/L蔗糖+6-7g/L琼脂，培养基pH为5.8-6.0；4)不定芽继代：待不定芽长至0.8-1.2cm，将芽切下，置于初代培养基中初代培养，30-45d后置于继代培养基中继代培养，每隔45d继代一次，获得组培苗；所述的初代培养基：MS+0.1-0.3mg/LIBA+0.8-1.2mg/L6-BA+25-35g/L蔗糖+6-7g/L琼脂，培养基pH为5.8-6.0；所述的继代培养基：MS+0.1-0.3mg/LIBA+1.8-2.2mg/L6-BA+25-35g/L蔗糖+6-7g/L琼脂，培养基pH为5.8-6.0。优选的，步骤1)中，剪取40厘米长、芽眼饱满的梨树枝条，置于2％蔗糖溶液中，在25-28℃的培养室内催芽；待腋芽萌发后，将枝条剪成茎段，每个茎段带3个芽，流水冲洗40min；在超净工作台内，将芽切下，先用70％乙醇处理芽30s，然后用无菌水洗涤3遍，再用2.5％次氯酸钠处理4min，最后用无菌水洗涤4遍，滤纸吸去多余水分，芽消毒后，接种于继代培养基：MS+0.2mg/LIBA+2.0mg/L6-BA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂上，培养基pH5.8-6.0，每隔30d继代培养一次，继代培养4次后，组培苗的形态和生长状况即可达到正常化，可作为叶片再生的试验材料，此后可根据试验需要，每隔45-60d继代培养一次。继代培养初期，继代培养周期角度，是为了使培养基保持足够的营养，尽快形成组培苗形态。优选的，步骤2)中，取当次继代培养45d，平展、健壮、肥厚的保留叶柄的组培苗叶片垂直于叶片主脉横切3刀，叶片接种于诱导培养基上，保持叶片完整不破碎，切口紧贴诱导培养基放置。所述的诱导培养基为：NN69+1.5mg/LTDZ+0.2mg/LIBA+30g/L蔗糖+9g/L琼脂，培养基pH为5.8-6.0。优选的，步骤3)中，暗培养时间为21d；所述的继代培养基为：MS+0.2mg/LIBA+2.0mg/L6-BA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，培养基pH为5.8-6.0。培养皿放置方法暗培养期间培养皿倒置，转至光培养后培养皿正面放置。优选的，步骤4)中，待不定芽长至0.8-1.2cm，将芽切下，置于初代培养基中初代培养，30d后置于继代培养基中继代培养，每隔45d继代一次；所述的初代培养基：MS+0.2mg/LIBA+1.0mg/L6-BA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，培养基pH为5.8-6.0；所述的继代培养基：MS+0.2mg/LIBA+2.0mg/L6-BA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，培养基pH为5.8-6.0。本发明所述的梨品种为雪花梨。一种用于高效快速的梨叶片再生出不定芽的培养基，包括：诱导培养基、初代培养基和继代培养基；所述的诱导培养基为：NN69+1.0-2.0mg/LTDZ+0.2-0.5mg/LIBA+25-35g/L蔗糖+8-10g/L琼脂，培养基pH为5.8-6.0；所述的初代培养基：MS+0.1-0.3mg/LIBA+0.8-1.2mg/L6-BA+25-35g/L蔗糖+6-7g/L琼脂，培养基pH为5.8-6.0；所述的继代培养基：MS+0.1-0.3mg/LIBA+1.8-2.2mg/L6-BA+25-35g/L蔗糖+6-7g/L琼脂上，培养基pH5.8-6.0。培养基配制方法：准确称量MS粉末(固体，不含蔗糖和琼脂，青岛高科园海博生物技术有限公司生产)或量取NN69母液和蔗糖溶于蒸馏水中，加入激素充分混匀后，逐滴加入0.1mol/L的NaOH溶液或0.1mol/L的HCl溶液调节pH至5.8-6.0，最后加入琼脂；116℃灭菌30分钟，超净台内分装，冷却。用于不定芽诱导的诱导培养基琼脂含量较高，含量为8-10g/L；用于再生芽初代培养的初代培养基和用于再生芽继代培养的继代培养基中琼脂含量较低，为6-7g/L。本发明的有益效果：1)基因型决定梨叶片的再生潜力，不同的基因型其再生率有很大差异。本发明选择使用雪花梨品种作为研究对象，首次获得雪花梨叶片的高效再生体系。雪花梨作为白梨的重要品种，对其再生效果进行研究，有利于对其他白梨品种的再生体系探索提供参考，为遗传转化体系在白梨品种中的应用提供一个有效途径，促进东方梨品种遗传转化的研究。2)梨叶片再生率的影响因素很多，内在因素是梨的基因型，外在因素包括基础培养基种类、激素种类、裂素种类和浓度配比等。本发明所用的叶片再生培养基种类为NN69，激素种类为TDZ、IBA相组合；不定芽初代和继代培养的培养基为MS，激素种类为6-BA、IBA相组合。基础培养基和激素都常用易得，激素均可高温灭菌，省去过滤除菌的麻烦，配制方法简单方便，省时、省力。初次发现了细胞分裂素TDZ和生长素IBA组合对白梨品种叶片再生的显著作用，再生率可达到70.83％，愈伤发生率达到100％，可以为提高其他白梨品种的再生率提供参考。3)再生主要经历脱分化、再分化两个过程，脱分化形成愈伤组织，再分化形成不定芽，再生过程仅使用一种培养基，方法简单、易于掌握，再生效果显著。本发明初次发现叶片再生中促进产生更多不多芽的关键因素，提出在光培养末期绿色芽眼产生后，将叶片由NN69培养基转移至MS培养基，平均每叶再生芽数可由每叶片2.06个增加到平均每叶片3.0个，有利于在同一块愈伤组织分化出更多的不定芽；而叶片不转移至MS培养基，平均每叶再生芽数为2.06个。4)放宽了叶片材料对叶龄的要求。以往的很多报道认为梨叶片再生时所使用叶片叶龄应为30d，叶片再生率随着叶龄的增大而降低，但用本发明中的培养基配方，继代培养20-50d的叶片均能取得很好的再生效果，大大扩增了材料的来源，且使用45d的叶片做再生时，能大大降低其褐化率，甚至不出现褐化。5)有效克服了梨等木本植物再生过程中易褐化的难题。首先通过使用较大叶龄的叶片，提高了伤口对环境的适应能力，大大降低了褐化率；其次，利用培养初期较频繁的更换培养基，减少伤口处代谢废物的积累，有效的避免褐化；再次，将培养皿倒置，既能有效减少冷凝水的产生，防止冷凝水对伤口的伤害，又能使伤口保持在适当湿度，加快其生长。若暗培养时培养皿正面放置，由于培养皿盖较薄，水汽上升接触培养皿盖，外界温度变化时，就会产生很多冷凝水，正着放置可能冷凝水过多往下滴对叶片切口伤害很大，倒着放置就可避免，且倒置能保持培养皿中培养基表面的湿润，有利于伤口形成愈伤组织。光培养时，愈伤基本已形成，有的甚至已经分化出芽，叶片伤口变硬，不容易贴合培养基，若倒着培养，叶片更不容易与培养基接触，会从培养基上掉下来。附图说明图1为梨叶片再生出不定芽的不同过程的情况；图1A为叶片暗培养0天；图1B为叶片暗培养10天；图1C为叶片暗培养21天；图1D为叶片接种后60天再生芽生长状况；图1E为初代培养30天后再生芽生长状况，图1F是再生芽继代培养得到的健壮组培苗。图2为诱导培养基不同激素配比对雪花梨叶片褐化率的影响。图3为诱导培养基不同激素配比对雪花梨叶片再生率的影响。图4为暗培养时培养皿放置方式对叶片的影响；图4A为培养皿正面放置时产生冷凝水导致叶片褐化；图4B为培养皿正面放置时产生冷凝水导致叶片白化形成叶片残缺；图4C为培养皿倒置时无凝水产生，叶片形态正常。具体实施方式下面通过具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明。实施例1一种高效快速的梨叶片再生出不定芽的方法，包括：获取无菌组培苗、诱导产生不定芽、不定芽的初代培养和继代培养等，其具体操作过程如下：1)雪花梨无菌组培苗的获取：春季树体刚开始萌动时，于雪花梨梨树上剪取40厘米长、芽眼饱满的枝条，置于2％蔗糖溶液中，在25℃左右培养室内催芽；待腋芽萌发后，将枝条剪成茎段，每个茎段带3个芽，流水冲洗40min；在超净工作台内，先用70％乙醇处理芽30s，然后用无菌水洗涤3遍，再用2.5％次氯酸钠处理4min，最后用无菌水洗涤4遍，滤纸吸去多余水分，芽消毒后，接种于继代培养基；每隔30d继代一次，继代培养4次后，组培苗的形态和生长状况即可达到正常化，此后，每隔45-60d继代培养一次。继代培养基为：MS+0.2mg/LIBA+2.0mg/L6-BA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂上，培养基pH为5.8-6.02)叶片处理：选取继代4次以上，当次继代培养45d，平展、健壮、肥厚的保留叶柄的组培苗叶片，垂直于叶片主脉横切3刀，叶片远轴面向下接种于诱导培养基上，切口尽量紧贴培养基；所述的诱导培养基为：NN69+1.5mg/LTDZ+0.2mg/LIBA+30g/L蔗糖+9g/L琼脂，培养基pH为5.8-6.0；3)叶片暗培养、光培养：将叶片置于避光处暗培养，培养皿倒置，每隔7天换一次培养基，培养温度为25℃，暗培养21d；再置于光下培养，光培养条件：光周期(昼/夜)14/10h，光照强度2000lx，温度25℃，每隔10d换一次培养基，约30d不定芽产生后，将带芽叶片置于继代培养基上，诱导其分化出更多的芽；继代培养基为：MS+0.2mg/LIBA+2.0mg/L6-BA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，培养基pH为5.8-6.04)不定芽继代：待不定芽长至0.8-1.2cm，将芽切下，置于不定芽初代培养基中初代培养，培养30d左右后置于继代培养基中继代培养，每隔45d继代一次，待组培苗生长健壮，即可作为生根、遗传转化等后续试验的试验材料，或每隔45d继代一次，作为种质保存的材料。初代培养基为：MS+0.2mg/LIBA+1.0mg/L6-BA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，培养基pH为5.8-6.0；继代培养基为：MS+0.2mg/LIBA+2.0mg/L6-BA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，培养基pH为5.8-6.0。实施例1中雪花梨叶片再生率可达到70.83％，愈伤发生率达到100％，平均每叶再生芽数为3.0个，褐化率为0。实施例2发明人考察了诱导培养基中激素TDZ、IBA不同配比以及暗培养时间对雪花梨叶片再生效果的影响，其他操作同实施例1，结果如表1、图2和图3所示。表1不同激素配比及暗培养时间对雪花梨叶片再生效果的影响发明人考察了步骤2)中不同叶龄雪花梨叶片对再生中褐化率的影响，其他操作同实施例1，考察结果见表2。表2不同叶龄对梨树叶片再生褐化率的影响叶龄褐化率(％)20d＜叶龄＜30d4.030d≤叶龄＜45d0.545d045d＜叶龄≤50d1.5发明人考察了步骤3)暗培养时培养皿倒置放置和正面放置时对叶片培养的影响操作同实施例1。如图4A所示，培养皿正面放置时，叶片褐化；如图4B所示，培养皿正面放置，叶片培养一周内叶片白化形成叶片残缺；如图4C所示，培养皿倒置，叶片形态正常。原因为：培养皿较薄，水汽上升接触培养皿盖，外界温度变化时，就会产生很多冷凝水，正面放置可能冷凝水过多往下滴对叶片切口伤害很大，出现切口白化，水渍化，甚至整个叶片呈水渍态，培养基表面很容易受农杆菌污染。当前第1页1 2 3