本发明涉及一种超低温贮藏白芷种子的方法，属于中药材种子贮藏领域。
背景技术：
白芷为伞形科植物白芷(Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f)或杭白芷(Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan)的干燥根，因初生根杆为芷，色白，故名白芷，以根入药，其性温，气芳香，味辛、微苦，归胃、结肠、肺经，具有散风除湿、通窍镇痛、消肿排脓等功效，可药食两用。据统计，白芷组成的成方制剂有600余种，在中药材中占有重要地位。历代名方如九味羌活汤、藿香正气散等皆有其入药。白芷为川产道地药材，主产于四川遂宁，其产量高，占全国白芷总产量70％以上，除供应国内市场外，还远销香港、东南亚、日本及欧美等地。
白芷以种子繁殖为主，多采用育苗移栽，在常规保存手段下，隔年陈种子发芽率不高，而制约种子发芽率的原因尚不清楚。一般情况下，白芷种子寿命约1年，种子优劣对田间出苗率、产量、品质有重大影响，从而影响药材种植户的收益。因此，白芷药材的栽培种子是关键。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种超低温贮藏白芷种子的方法，本发明对白芷种子的储藏时间长。
本发明提供的超低温贮藏白芷种子的方法，包括如下步骤：1)将白芷种子干燥，得到干燥的种子；
2)将所述干燥的种子密封包装，冷冻储藏，得到冷冻的种子；
3)对所述冷冻的种子解冻储藏。
上述的方法中，步骤2)中还包括将所述干燥的种子与防冻保护剂混合的步骤。
上述的方法中，所述干燥的种子与所述防冻保护剂的质量比为100：5～10，具体可为100：5或100：10；
所述防冻保护剂包括二甲基亚砜、甘油和聚乙二醇(简称PEG)中的至少一种；所述聚乙二醇的分子量具体可为400。
上述的方法中，所述干燥的种子的含水量可为5～10％，具体可为5.34％、7.70％、9.43％或5.34～9.43％，最优选9.43％；具体的干燥过程为采用105℃低恒温，烘干4h，获得白芷种子含水量，种子放于以硅胶为干燥剂的干燥器中，经不同时间干燥，种子水分调节至所需的含水量。
本发明中，所述干燥的种子的含水量按照质量含水量计。
上述的方法中，包装所述干燥的种子的材料包括塑料离心管、塑料自封袋和牛皮纸中的至少一种；
包装所述干燥的种子的材料的厚度可为0.1～1mm。
本发明中，所述干燥的种子密闭包装，采用的所述塑料离心管为带盖的离心管；塑料自封袋的厚度具体可为0.1mm。
上述的方法中，所述冷冻储藏包括快速冷冻方式、慢速冷冻方式和缓速冷冻方式中的至少一种；
所述快速冷冻方式为在液氮中冷冻0～60d；
所述慢速冷冻方式为在1～10℃冷冻0.2～1h，然后在-25～-15℃冷冻4～5h，最后放置于所述液氮中冷冻0～60d；具体可为在5℃冷冻0.5h，然后在-20℃冷冻4h，最后放置于所述液氮中冷冻0～60d；
所述缓速冷冻方式为在1～10℃冷冻0.2～1h，然后在-25～-15℃冷冻0.5～1h，最后放置于所述液氮中冷冻0～60d；具体可为在5℃冷冻0.5h，然后在-20℃冷冻1h，最后放置于所述液氮中冷冻0～60d。
本发明中，所述液氮环境中的温度指的是-196℃。
上述的方法中，所述解冻储藏包括快速解冻方式、慢速解冻方式和缓速解冻方式中的至少一种；
所述快速解冻方式为从所述液氮中移至30～50℃中解冻；具体可为从所述液态氮中移至40℃温水解冻；
所述慢速解冻方式为从所述液氮中依次移至-25～-15℃解冻0.5～2h、3～8℃解冻；具体可为从所述液氮中依次移至-20℃解冻1h、4℃解冻；
所述缓速解冻方式为从所述液氮中移至15～25℃解冻。
本发明具有以下优点：
本发明对白芷种子的储藏方法简单易行；储藏的时间长；对白芷种子发芽率、电导率、过氧化物酶(POD)活性和可溶性蛋白质含量影响小。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，供试白芷(Angelica dahurica)种子来源于四川遂宁市永兴镇中脊村，2014年采收；
含水量的测定，参照文章(杨枝中，蒋运斌，穆向荣等.川白芷种子质量检验方法研究[J].种子，2013，3(12):119～122.)中的方法；具体过程为采用105℃低恒温，烘干4h，获得白芷种子含水量；种子放于以硅胶为干燥剂的干燥器中，经不同时间干燥，种子水分调节至所需的含水量。
实施例1、白芷种子的储藏
1)白芷种子干燥，水分调节至5.34％、7.70％和9.43％三种不同含水量，然后将不同含水量的种子置密闭铝盒中备用。
2)将上述1)中不同含水量的白芷种子，分别与二甲基亚砜、甘油、聚乙二醇400(PEG400)作为防冻保护剂混合(白芷种子与防冻保护剂的质量比如表1所示)，然后均分别装在塑料离心管(带盖)、塑料自封袋(0.1mm厚)中，分别采用下述三种方式冷冻储藏：
快速冷冻：液态氮；
慢速冷冻：冰箱(5℃，0.5h)-冰箱(-20℃，4h)-液态氮；
缓速冷冻：冰箱(5℃，0.5h)-冰箱(-20℃，1h)-液态氮。
3)将上述2)中冷冻的种子，分别采用下述三种方式解冻储藏：
快速解冻：液态氮移至40℃温水解冻；
慢速解冻：液态氮-冰箱(-20℃，1h)-冰箱(4℃)解冻；
缓速解冻：液态氮移至20℃环境解冻。
上述2)-3)中在液态氮中保存的时间均为7d、30d或60d，具体如表1中所示。
上述条件采用正交试验设计进行了最佳方案的优化，得到最佳的种子超低温储存组合；选用L18(21+37)正交表。正交试验的各因素及其水平见表1。根据正交试验设计，共进行18次试验，试验以4℃环境下未进行超低温贮藏的种子为对照。
表1正交试验栏目表
由表1中可知，本发明选用的包装材料为塑料离心管和0.1mm塑料自封袋，种子含水量设置3个水平分别是5.34％、7.70％和9.43％，保护剂二甲基亚砜、甘油、PEG均分别设置0％、5％和10％3个水平，冷冻方式、解冻方式均分为快、慢、缓3个档次，冷藏时间设置7天、30天、60天3个水平。
经上述的储藏方法后，白芷种子活性测定实验按照如下1-5的方法进行测定：
1、种子发芽试验
培养箱设置25℃/18℃昼夜变温，光照12h，每份材料每种处理随机数取100粒种子，3次重复。
发芽率(GR)(％)＝n/N×100％(n为最终发芽数；N为供试种子数)。
待突破种皮的胚轴长度达到真种子自身长度时计为发芽，并作为初次计数时间。种子萌发达到最高，以后再无新萌发种子的天数为末次计数时间。
2、电导率测定
随机数取白芷种子50粒净种子，3次重复。用离子水冲洗3遍，用滤纸吸干表面水分，将种子放入250mL烧杯中，加入100mL去离子水，测定初始电导率；用保鲜膜将烧杯封口，室温条件下静置24h后测定种子浸出液电导率。
种子浸出液电导率[μs/(cm*g)]＝(种子浸出液电导率-初始电导率)/种子样品质量。
3、过氧化物酶(POD)活性
取白芷种子0.5g，置于研钵中，加入5ml 0.02mol/L KH2PO4研磨成匀浆，4000r/min，离心15min，收集上清液保存在冰上。所得残渣再用5ml 0.02mol/L KH2PO4提取一次，合并两次上清液，酶提取液10ml冰浴研磨，在4℃1200r/min离心15min，上清液为酶粗提液，在0～4℃下保存。
取酶提取液0.5ml(视酶活性大小稀释原液)，加POD反应液3ml，内含0.08％H2O2，0.1％愈创木酚的PBS(pH 7.0)，立即于470nm处比色，每30s记录一次读数，记录读数3min，取呈线部分计算OD值变化，酶活性单位以△OD 470/min·g表示。
反应混合液配置100mmol/L pH 6.0磷酸缓冲液50ml，加入愈创木酚28ul，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30％过氧化氢19ul，混合均匀，保存于冰箱中，备用。
4、可溶性蛋白质含量测定
参照高俊凤的方法[8]测定白芷种子中可溶性蛋白质含量，略有改动。
取白芷种子0.5g，置于研钵中用pH 7.0磷酸缓冲液研磨成匀浆后，定容25ml，10000r/min离心10min，取上清1ml(视蛋白质含量适当稀释)于试管中，备用。
吸取样品提取液0.1ml，放入具塞刻度试管中(设两个重复管)，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后在595nm下比色，记录吸光度值，通过标准曲线回归方程Y＝0.0608x+0.2218(R2＝0.9073)查得蛋白质含量。
蛋白质含量(％)＝C×V2×V0×100/(m×V1)
式中：C——从标准曲线上查得的蛋白质浓度，g/mL
V0——样品溶液的总体积，mL
V1——测定时加样量，mL
V2——测定时定容体积，mL
m——样品的质量，g
5、数据分析处理
采用DPS统计分析软件对数据进行方差分析，采用新复极差法进行显著性分析。实验结果：
上述1-5的实验结果如下(1)-(4)所示。
(1)超低温保存对白芷种子发芽的影响
表2正交试验设计L18(21+37)和种子发芽率
表2中，A:包装材料；B:含水量；C:二甲基亚砜；D:甘油；E:PEG；F:冷冻方式；G:解冻方式；H:贮藏时间；M:均值；R：极差。
表3发芽试验方差分析表
表3中，MS:偏差平方和；df：自由度。
表4白芷种子超低温贮藏重要影响因素对照表
表2中应用正交设计L18(21+37)，因素A、B、C、D、E、F、G和H分别为包装材料、含水量、二甲基亚砜、甘油、PEG400、冷冻方式、解冻方式和贮藏时间，均按照实施例1中表1中试验条件进行。A因素为2个水平，其余因素选择3个水平，每个水平作3次重复，结果如表2所示。
从表2中可以看出，在各因素中对白芷种子发芽影响最大的是冷冻方式，其次是解冻方式。8个因素影响白芷种子发芽率的顺序是：F>G>A>D>C>H>B>E。方差分析表明，冷冻方式、解冻方式能极显著影响白芷种子发芽，包装材料能显著影响种子发芽，其余5个因素对种子发芽的影响不显著(如表3所示)，但有同一因素的不同水平之间是有差异的。另外，包装材料采用塑料离心管时白芷种子的发芽率较高，为43.19％。快速冷冻和慢速冷冻分别为种子发芽率最高(52.45％)和最低(32.95％)的两种冷冻方式，极差为19.50％。在解冻方式中慢速解冻时种子发芽率最高，为45.5％，快速解冻时发芽率最低，为39.28％(如表4所示)。
(2)超低温保存对白芷种子电导率的影响
对应用正交设计处理的白芷种子进行电导率测定，一般情况下，种子活力越低，电导率越高。从表2可以看出，白芷种子在超低温保存过程中，各因素中对浸出液电导率影响最大的是冷冻方式，其次是解冻方式。8个因素影响白芷种子电导率的顺序依次是：F>G>E>D>C>A>H>B。方差分析表明，冷冻方式能极显著影响白芷种子浸出液电导率，PEG、解冻方式对白芷种子浸出液电导率的影响呈显著差异，其它7个因子对白芷种子浸出液电导率的影响不显著(见表3)。另外，PEG的体积分数为10％时浸出液电导率在3个处理水平中最低，为17.79μs/cm*g。在3种冷冻方式中，快速冷冻的效果最好，浸出液电导率最低，为15.73μs/cm*g，慢速冷冻的效果最差，浸出液电导率最高，为20.52μs/cm*g，二者极差为4.79μs/cm*g。慢速解冻在3种解冻方式中效果最好，浸出液电导率低于对照(见表4)。
(3)超低温保存对过氧化物酶(POD)活性的影响
过氧化物酶是细胞内很重要的抗逆酶之一，用POD活性来衡量种子活力，高活力种子抗逆性酶活力强。由表2可知，各因素对白芷种子POD活性影响最大的是冷冻方式，其次是解冻方式。8个因素影响白芷种子POD活性的顺序依次是：F>G>C>A>D>E>H>B。方差分析表明，冷冻方式能极显著影响POD活性，其它7个因子对POD活性的影响不显著。另外，在3冷冻方式中，快速冷冻的效果最好，POD活性最高16.59U·g-1min-1，慢速冷冻的效果最差，POD活性最低13.44U·g-1min-1，低于对照14.33U·g-1min-1。
(4)超低温保存对可溶性蛋白的影响
种子内可溶性蛋白大多是参与各种代谢的酶类，其含量高低反映了植物体内各类酶的活性水平，与种子活力具有一定相关性，种子活力降低其可溶性蛋白含量下降。由表2可知，各因素对白芷种子可溶性蛋白含量影响最大的是冷冻方式，其次是PEG。8个因素影响白芷种子可溶性蛋白含量的顺序依次是：F>E>G>A>C>B>D＝H。方差分析表明，冷冻方式和解冻方式能极显著影响可溶性蛋白含量，PEG对可溶性蛋白含量呈显著差异，其它5个因子对可溶性蛋白含量的影响不显著。另外，随着PEG的体积分数的增加可溶性蛋白含量不断上升，但均低于对照。在3种冷冻方式中，快速冷冻的效果最好，可溶性蛋白含量最高，为6.92mg/g，高于对照的5.62mg/g，慢速冷冻方式时可溶性蛋白最低，为4.09mg/g。慢速解冻在3种解冻方式中效果最好可溶性蛋白含量最高，为5.78mg/g，快速解冻时可溶性蛋白最低，为5.11mg/g。
上述试验结果表明，本发明白芷种子能在超低温方式进行贮藏，在9.43％含水量的白芷种子用塑料离心管作为包装材料、在10％PEG防冻保护剂的保护下，采用快速方式冷冻，经液氮超低温保存后，以慢速方式解冻，能有效地降低种子的电导率，提高种子的发芽率、POD活性和可溶性蛋白含量，延缓种子衰老。本发明的最佳处理组合为：塑料离心管+9.43％含水量+10％PEG+快速冷冻+慢速解冻。