本发明涉及一种精子稀释液及其配制方法和利用该稀释液冷冻、冷藏保存精子的方法。
背景技术：
现有技术通常利用动物源稀释液来存储动物精子，而动物源稀释液如卵黄稀释液会引入其他动物源的病原微生物，给人工授精母畜群带来疾病，特别是在配制稀释液时加入大量的抗生素，不规范使用抗生素以致超级细菌产生。卵黄稀释液现用现配不易保存,不用的卵黄膜内含卵黄及蛋清和蛋壳在垃圾桶内不及时处理,实验室容易有臭鸡蛋的味道，污染环境。卵黄稀释液在显微镜下观察精子活力，由于存在卵黄颗粒使视野不清晰，不易于观察。
也有研究者利用无动物源的物质制备动物精子稀释液，但是该稀释液利用的物质如咖啡因属于禁销药品，不适合大批量推广应用，而且有精子活力不持久、存活时间短的问题。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决传统方法制备的动物精子稀释液的观察视野不清晰、易污染、存活时间短和不规范使用抗生素以致超级细菌产生的问题，而提供了动物精子稀释液及其配制方法和利用该稀释液冷冻、冷藏保存精子的方法。
本发明的动物精子稀释液由丙三醇、葡萄糖、果糖、三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、脱脂小麦蛋白粉(蛋白质、小麦蛋白肽)、脱脂豌豆蛋白粉(蛋白质、K因子、胡萝卜素、维生素Bt、维生素E、维生素C)、脱脂花生蛋白粉(蛋白质、钙、磷、铁、硫胺素，棕榈酸、维生素A、B、C、E、K、)、脱脂大豆蛋白粉(蛋白质、卵磷脂、植物免疫因子、植物微量元素)和灭菌蒸馏水组成。
本发明的动物精子稀释液的制备方法按以下步骤进行：
一、用分析天平称三羟甲基氨基甲烷和灭菌蒸馏水，在容量瓶中混合溶解，得混合物；所述三羟甲基氨基甲烷的质量与灭菌蒸馏水的体积比为(20.00g-30.00g)：(180mL-190mL)；
二、分别称取：0.5-1g脱脂大豆蛋白粉、0.1g-0.5g脱脂豌豆蛋白粉、0.5g-1g脱脂花生蛋白粉,0.1g-0.5g脱脂小麦蛋白粉溶于步骤一的混合物中，超声波裂解大分子蛋白、细菌、病毒等微生物，获得低分子蛋白或多肽混合的无菌溶液；放入0-8℃冷藏沉降24h-48h；
三、弃去步骤二中的沉淀物，得上清液；在分析天平上称取10g-20g柠檬酸、10g-20g葡萄糖、10g-20g果糖和50mL-100mL丙三醇加入上述上清液中，超声波混匀裂解细菌病毒等微生物，放入0-8℃冷藏得到浓缩比例为5×的动物精子稀释液。
本发明利用动物精子稀释液冷冻保存精子的方法按以下步骤进行：
一、将采集到的动物精液放入保温瓶内，温度保持在20-35℃，带到实验室；
二、将步骤一中的动物精液用分光光度计测量密度，用本发明提供的动物精子稀释液按精子数300-1000万/mL稀释，用0.25mL的冻精细管，用灌封机将稀释好的精液灌装到细管中并封口；
三、将步骤二中的细管精液放到降温柜中，以0.1-0.5℃/min的速度降温，降到0-4℃；
四、将步骤三中的细管精液平衡1h-2h；
五、将步骤四的细管精液放到液氮上边，距离液氮面高度1.0cm-2.5cm，温度约为零下100℃-120℃，熏蒸5min-15min，直接投到液氮里，在液氮里把细管冻精装到纱布袋里备用。
本发明利用动物精子稀释液冷藏保存精子的方法按以下步骤进行：
一、将采集到的动物精液放入保温瓶内，温度保持在20-35℃，带到实验室；
二、将步骤一中的精液用分光光度计测量密度，用稀释液按精子数300-1000万/mL稀释，用0.25mL的冻精细管，用灌封机将稀释好的精液灌装到冻精细管中并封口；
三、将步骤二中的细管精液放到降温柜中，以0.1-0.5℃/min的速度降温，降到0-4℃备用。
本发明相对于现有技术的优点：
1.相对于现有技术而言，本发明的动物精子稀释液中添加植物提取物(植物蛋白、植物多肽、植物微量元素、植物因子、卵磷脂、免疫因子、维生素、棕榈酸、K因子等)，对提高冷冻或冷藏保存的精子活力和延长保存时间起了重要的作用，避免了添加兴奋剂咖啡因，咖啡因虽能提高精子活力但缩短了存活时间，咖啡因是禁销药品，妨碍了大量配制和使用推广；避免了添加抗生素和滥用抗生素以致超级细菌产生。避免了动物源稀释液如卵黄稀释液会引入其他动物源的病原微生物，给人工授精母畜群带来疾病。
2.在原技术添加大豆蛋白粉的基础上又改进添加脱脂大豆蛋白粉、脱脂花生蛋白粉、脱脂豌豆蛋白粉和脱脂小麦蛋白粉，与现有技术相比本方法制得的动物精子稀释液使冷冻的精子活力提高1％-3％个点，冷藏保存的精子存活时间延长1-2天。
3.经过改进动物精子稀释液现有配制方法，得到5倍浓缩和保质期24个月的精子稀释液。
4.可以工厂化生产动物精子稀释液来冷冻、冷藏保存精子，省时省力，推广应用前景广阔。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方案，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式的动物精子稀释液由丙三醇、葡萄糖、果糖、三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、脱脂小麦蛋白粉、脱脂豌豆蛋白粉、脱脂花生蛋白粉、脱脂大豆蛋白粉和灭菌蒸馏水组成。
具体实施方式二：如具体实施方式一所述的动物精子稀释液的制备方法按以下步骤进行：
一、用分析天平称三羟甲基氨基甲烷和灭菌蒸馏水，在容量瓶中混合溶解，得混合物；所述三羟甲基氨基甲烷的质量与灭菌蒸馏水的体积比为(20.00g-30.00g)：(180mL-190mL)；
二、分别称取：0.5-1g脱脂大豆蛋白粉、0.5g-1g脱脂豌豆蛋白粉、0.5g-1g脱脂花生蛋白粉,0.1g-0.5g脱脂小麦蛋白粉溶于步骤一的混合物中，超声波裂解大分子蛋白、细菌和病毒，获得低分子蛋白或多肽混合的无菌溶液；放入0-8℃冷藏沉降24h-48h；
三、弃去步骤二中的沉淀物，得上清液；在分析天平上称取10g-20g柠檬酸、10g-20g葡萄糖、10g-20g果糖和50mL-100mL丙三醇加入上述上清液中，超声波混匀裂解细菌和病毒，放入4℃冷藏得到动物精子稀释液。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是，所述三羟甲基氨基甲烷的质量与灭菌蒸馏水的体积比为20.00g：180mL。其他步骤与参数与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：利用具体实施方式一所述的动物精子稀释液冷冻保存精子的方法按以下步骤进行：
一、将采集到的动物精液放入保温瓶内，温度保持在20-35℃，带到实验室；
二、将步骤一中的动物精液用分光光度计测量密度，用本发明提供的动物精子稀释液按精子数300-1000万/mL稀释，用0.25mL的冻精细管，用灌封机将稀释好的精液灌装到细管中并封口；
三、将步骤二中的细管精液放到降温柜中，以0.1-0.5℃/min的速度降温，降到0-4℃；
四、将步骤三中的细管精液平衡1h-2h；
五、将步骤四的细管精液放到液氮上边，距离液氮面高度1.0cm-2.0cm，温度约为零下100℃-120℃，熏蒸5min-15min，直接投到液氮里，在液氮里把细管冻精装到纱布袋里备用。
具体实施方式五：利用具体实施方式一所述的动物精子稀释液冷藏保存精子的方法按以下步骤进行：
一、将采集到的动物精液放入保温瓶内，温度保持在20-35℃，带到实验室；
二、将步骤一中的精液用分光光度计测量密度，用稀释液按精子数300-1000万/mL稀释，用0.25mL的冻精细管，用灌封机将稀释好的精液灌装到冻精细管中并封口；
三、将步骤二中的细管精液放到降温柜中，以0.1-0.5℃/min的速度降温，降到0-4℃备用。
实施例1
本实施例的动物精子稀释液的制备方法按以下步骤进行：
一、用分析天平称三羟甲基氨基甲烷和灭菌蒸馏水，在容量瓶中混合溶解，得混合物；所述三羟甲基氨基甲烷的质量与灭菌蒸馏水的体积比为20.00g：180mL；
二、分别称取：0.5g脱脂大豆蛋白粉、0.1g脱脂豌豆蛋白粉、0.5g脱脂花生蛋白粉,0.2g脱脂小麦蛋白粉溶于步骤一的混合物中，超声波裂解大分子蛋白、细菌、病毒等微生物，获得低分子蛋白或多肽混合的无菌溶液；放入4℃冷藏沉降24h；
三、弃去步骤二中的沉淀物，得上清液；在分析天平上称取12g柠檬酸、15g葡萄糖、10g果糖和50mL丙三醇加入上述上清液中，超声波混匀裂解蛋白、细菌、病毒等微生物，放入4℃冷藏得到动物精子稀释液。
利用动物精子稀释液冷冻保存精子的方法按以下步骤进行：
一、将采集到的狗的精液放入保温瓶内，温度保持在28℃；
二、将步骤一中的动物精液用分光光度计测量密度，用本发明提供的动物精子稀释液按精子数500万/mL稀释，用0.25mL的冻精细管，用灌封机将稀释好的精液灌装到细管中并封口；
三、将步骤二中的细管精液放到降温柜中，以0.2℃/min的速度降温，降到4℃；
四、将步骤三中的细管精液平衡1h；
五、将步骤四的细管精液放在液氮上方，距离液氮面高度2.5cm，温度约为零下110℃，熏蒸10min，直接投到液氮里，在液氮里把细管冻精装到纱布袋里备用。
本发明利用动物精子稀释液冷藏保存精子的方法按以下步骤进行：
一、将采集到的狗的精液放入保温瓶内，温度保持在28℃；
二、将步骤一中的精液用分光光度计测量密度，用稀释液按精子数600万/mL稀释，用0.25mL的冻精细管，用灌封机将稀释好的精液灌装到冻精细管中并封口；
三、将步骤二中的细管精液放到降温柜中，以0.4℃/min的速度降温，降到4℃备用。
本实施例得到的动物精子稀释液冷冻保存的精子活力为0.48，存活时间为7-12天，冷藏保存的精子的精子活力为0.6，存活时间为10-15天。