含有精氨酸的组合物和用于处理红细胞的方法与流程

该申请要求2010年2月16日递交的美国临时申请号61/338263和2010年8月4日递交的61/370713的权益，两者通过引用以其整体结合到本文中。

背景

全血为活组织，其循环通过心脏、动脉、静脉和毛细血管，向身体组织输送营养物、电解质、抗体、热量和氧气。全血包括悬浮于称为血浆的蛋白质流体中的红细胞(RBC)、白细胞和血小板。如果血液被处理以防止凝血和允许保持在容器中，那么RBC将沉降至容器的底部，血浆将保持在上面，而白细胞将形成RBC上面的层。离心机通常用于加速这种分离。然后去除富含血小板的血浆，并置于无菌袋中用于进一步处理，以分离例如血小板、凝血因子、白蛋白、免疫球蛋白等。

用于通常输血需要的最重要的组分为红细胞或RBC，其含有血红蛋白，血红蛋白为复杂的含铁蛋白，其输送氧气经过全身并赋予血液其红颜色。由RBC组成的血量的百分数称为“血细胞比容”。成年男性体内的平均血细胞比容为47%。在两或三滴血液中存在约10亿个RBC，并且每600个RBC存在约40个血小板和1个白细胞。

RBC在骨髓中制造，无核、双凹面圆盘状，其不断产生、分解和消灭。双凹面圆盘状对于RBC的功能(呈现最大表面积用于在肺部捕获氧气及在组织释放氧气)至关重要。细胞为柔性的并且能够弯曲，以穿过毛细血管床的微小细管。因为该细胞无核并且没有线粒体，其不能进行细胞修复过程并且必须依赖厌氧磷酸化获得能量。在循环系统中平均120天之后，细胞衰老并被网状内皮系统的循环单核细胞或固定巨噬细胞吞噬。

RBC通过去除血浆自全血制备。当输血给患者时，血细胞比容升高，而血量增加减至最小，这对于患有充血性心力衰竭的患者尤其重要。通常将细胞悬浮于约一半的原始体积中；制剂称为浓集红细胞(packed red cell)。最受益于输入RBC的患者包括由于诸如肾衰竭、恶性肿瘤、胃肠道出血或因创伤或手术造成的急性失血等病症而患有慢性顽固性贫血的那些患者。

因为患者很少需要全血中的所有组分，血库的通常做法是将血液分离成各组分，并且仅输入患者对于具体病况或疾病所需要的部分。这种治疗，称为“血液组分疗法”，允许一些患者受益于每单位的血液。不幸的是，分离血液组分用于疗法对于RBC不利，导致储存损伤，其特征在于标记物2,3-二磷酸甘油酸酯(2,3-DPG)减少，氧自由基的产生增加和形态学变化。

用于储存全血的标准溶液包括柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖溶液(CPD)和柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖-腺嘌呤溶液(CPDA)。柠檬酸盐或其它抗凝剂比如肝素对于防止凝血是必要的。因为血液为保持代谢功能的活组织，甚至在冷藏温度下亦如此，已经认为其对提供能源比如葡萄糖是必要的。磷酸盐离子可用于缓冲自葡萄糖利用产生的乳酸盐。

在最近的15年内细胞保存液的改进已将全血或RBC的冷藏保质期从21天增加至42天。在42天后，丢弃血液，因为许多细胞已经变得衰老，并可在输给接受者时立即被吞噬。尽管红细胞在储存中可能呈现存活5或6周，但是它们迅速出现储存损伤，其特征在于溶血和/或生物化学和生物力学变化，这些特征可损害其存活时间及其接受、运输和卸载氧气至组织的能力。因此期望使用抽血后3周或更短时间内的全血和血液制品。

仍然需要一种溶液，全血中的血细胞或浓集红细胞悬浮液可在延长的时间内储存在该溶液中并且当输给接受者时其在功能上存活。还仍然需要一种用于使功能欠佳的血液和RBC复原(rejuvenate)的方法。

概述

在输血之前采集和储存RBC的方法在改进血库实践中仍然是一个挑战。RBC可在4℃下储存42天，但是虽有抗凝剂溶液和血液添加剂的改进，超过这个时间则出现RBC储存损伤。RBC的最显著储存损伤为a) 2,3-DPG贫乏，造成血液向组织卸载氧气的能力降低，导致氧亲和力增加；b) 减少细胞活力，增加脆弱性和减少变形性的形态改变，影响细胞穿过微循环的能力；和c) 释放导致发热、细胞损伤和组织功能障碍的生化物质。这些储存损伤主要起因于细胞能量(即三磷酸腺苷或ATP)贫乏以及与能量代谢减少有关的乳酸积聚。

减慢2,3-DPG贫乏和ATP损失速率的实验添加剂溶液为已知的，参见例如Dawson等, Prog Glin Biol Res. 1985;195:349-68; Dawson等, Transfusion 1984 Jul-Aug; 24(4):327-9; Dawson等, Hum Pathol. 1983 Mar; 14(3):213-7; Dawson等, Transfusion 1981 May-Jun; 21(3):285-90;和Dawson等, Transfusion 1981 Mar-Apr; 21(2):215。这些实验溶液通常包含一系列的无机磷酸盐和肌苷。虽然这些溶液能够在某种程度上保持2,3-DPG水平，但是对溶液组分的要求产生一些问题，限制了其效用。一个问题是肌苷的溶解性低，这造成向RBC中加入浆液，后来需要在输血之前洗涤细胞。另一个问题是生化进程，该进程导致形成潜在毒性的分解产物比如次黄嘌呤和尿酸。另外，输血制品必须在输血之前温热1小时，这影响这类添加剂溶液在目前血库实践中的实用性。在优选的实施方案中，本文公开的血液储存和/或复原组合物解决这些问题中的一个或多个。

一方面，本公开提供血液储存和/或复原组合物。在一个实施方案中，组合物包含D-核糖和L-精氨酸和/或D-精氨酸(并且优选地为L-精氨酸)。任选地，组合物可进一步包含丙酮酸钠、无机磷酸盐和肌苷中的一种或更多种。在优选的实施方案中，组合物为水溶液。亦公开了使用这种组合物的方法。

在另一个实施方案中，血液储存和/或复原组合物包含：75-1500 mM L-精氨酸和/或D-精氨酸(并且优选地为L-精氨酸)；和75-1500 mM肌苷，其中组合物为水溶液。任选地，组合物可进一步包含浓度为例如75-1500 mM的D-核糖。任选地，组合物可进一步包含浓度为例如75-1500 mM的丙酮酸钠。任选地，组合物可进一步包含浓度为例如75-1500 mM的无机磷酸盐。当用于储存和/或复原血液时，组合物通常被稀释约30倍，以提供最终浓度为2.5-50 mM的L-精氨酸和/或D-精氨酸(并且优选地为L-精氨酸)；2.5-50 mM的肌苷；和任选地2.5-50 mM的D-核糖、2.5-50 mM的丙酮酸钠和/或2.5-50 mM的无机磷酸盐。

在某些优选的实施方案中，血液储存和/或复原组合物包含：150-900 mM L-精氨酸和/或D-精氨酸(并且优选地为L-精氨酸)；和150-900 mM肌苷，并且组合物为水溶液。任选地，组合物可进一步包含浓度为例如150-900 mM的D-核糖。任选地，组合物可进一步包含浓度为例如150-900 mM的丙酮酸钠。任选地，组合物可进一步包含浓度为例如150-900 mM的无机磷酸盐。当用于储存和/或复原血液时，组合物通常被稀释约30倍，以提供最终浓度为5-30 mM的L-精氨酸和/或D-精氨酸(并且优选地为L-精氨酸)；和5-30 mM的肌苷；和任选地5-30 mM的D-核糖、5-30 mM的丙酮酸钠和/或5-30 mM的无机磷酸盐。

在其它优选的实施方案中，血液储存和/或复原组合物包含：300-600 mM L-精氨酸和/或D-精氨酸(并且优选地为L-精氨酸)；和300-600 mM肌苷，并且组合物为水溶液。任选地，组合物可进一步包含浓度为例如300-600 mM的D-核糖。任选地，组合物可进一步包含浓度为例如300-600 mM的丙酮酸钠。任选地，组合物可进一步包含浓度为例如300-600 mM的无机磷酸盐。当用于储存和/或复原血液时，组合物通常被稀释约30倍，以提供最终浓度为10-20 mM的L-精氨酸和/或D-精氨酸(并且优选地为L-精氨酸)；和10-20 mM的肌苷；和任选地10-20 mM的D-核糖、10-20 mM的丙酮酸钠和/或10-20 mM的无机磷酸盐。

在某些实施方案中，L-精氨酸与肌苷的摩尔比为0.5:1-1.5:1。在其它某些实施方案中，L-精氨酸与肌苷的摩尔比为0.8:1-1.2:1。在某些优选的实施方案中，L-精氨酸与肌苷的摩尔比为1:1。

在另一个实施方案中，血液储存和/或复原组合物包含：300 mM L-精氨酸、300 mM肌苷、300 mM D-核糖、300 mM丙酮酸钠和300 mM无机磷酸盐，其中组合物为水溶液。当用于储存和/或复原血液时，组合物通常被稀释约30倍，以提供最终浓度为10 mM的L-精氨酸、10 mM的肌苷、10 mM的D-核糖、10 mM的丙酮酸钠和10 mM的无机磷酸盐。

在某些实施方案中，本文描述的血液储存和/或复原组合物可进一步包含氯化钠、葡萄糖、腺嘌呤、甘露醇、柠檬酸钠和柠檬酸中的一种或更多种。

对于一个实例，血液储存和/或复原组合物可为包含以下的添加剂溶液：L-精氨酸、肌苷、D-核糖、丙酮酸钠、无机磷酸盐、氯化钠、葡萄糖、腺嘌呤和甘露醇。这类添加剂溶液特别可用于含有选自以下的抗凝剂的储存和/或复原血液：ACD、CPD、CPDA-1及其组合。

对于另一个实例，血液储存和/或复原组合物可为包含以下的添加剂溶液：L-精氨酸、肌苷、D-核糖、丙酮酸钠、无机磷酸盐、氯化钠、葡萄糖、腺嘌呤、柠檬酸钠和柠檬酸。这类添加剂溶液特别可用于储存和/或复原含有CP2D抗凝剂的血液。

本文描述了用于储存和/或复原RBC的方法。例如在美国专利申请公开号2007/0111191 Al (St. Cyr等)、美国专利号7687468 (St. Cyr等)和与此同一天递交的标题为“NUCLEOSIDE-CONTAINING COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING RED BLOOD CELLS (含有核苷的组合物和用于处理红细胞的方法)”(律师备案号374.0003010 1)的同时待审美国专利申请系列号中描述了另外的方法。

另一方面，本公开进一步提供改进储存的RBC的抗氧化防护的方法。

在一个实施方案中，所述方法包括使RBC与本文描述的血液储存和/或复原组合物接触。

在另一个实施方案中，所述方法包括使包含RBC和抗凝剂的组合物与本文描述的添加剂溶液接触，其中抗凝剂选自ACD、CPD、CPDA-1及其组合。

在另一个实施方案中，所述方法包括使包含RBC和抗凝剂的组合物与本文描述的添加剂溶液接触，其中抗凝剂为CP2D。

在该申请中描述的技术描述了RBC储存和/或复原组合物，该组合物在优选的实施方案中不呈现与肌苷有关的溶解困难，不产生高水平的分解产物，和/或不需要在输血之前温热RBC。本文描述的储存和/或复原组合物包含戊糖碳水化合物(例如D-核糖)，其可用于辅助嘌呤核苷酸(包括ATP)的从头合成和代谢再利用。储存和/或复原组合物也可包含无机磷酸盐(可用作磷酸解的底物)和/或丙酮酸钠(可用作NAD源和使得1,3-二磷酸甘油酸酯转化为2,3-DPG或3-磷酸甘油酸酯)。在一个实施方案中，L-精氨酸用于充分溶解肌苷。

定义

术语“包含”及其变体，当这些术语在说明书和权利要求书中出现时，不具有限定的含义。

本文使用的“一个”、“一种”、“该”、“至少一个”和“一个或更多个”可互换使用。

而且本文通过端点叙述的数值范围包括包含在该范围内的所有数值(例如1-5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。

ACD (柠檬酸葡萄糖)为抗凝剂和防腐剂溶液，据报道其1升在水中含有22.0 g柠檬酸三钠(二水合物)、8.0 g柠檬酸(一水合物)和24.5 g葡萄糖(一水合物)。

CPD (柠檬酸盐磷酸盐葡萄糖)为抗凝剂和防腐剂溶液，据报道其1升在水中含有26.30 g柠檬酸三钠(二水合物)、3.27 g柠檬酸(一水合物)、2.22 g磷酸二氢钠(一水合物)和25.5 g葡萄糖(一水合物)。

CPDA-1 (柠檬酸盐磷酸盐葡萄糖腺嘌呤)为抗凝剂和防腐剂溶液，据报道其1升在水中含有26.30 g柠檬酸三钠(二水合物)、3.27 g柠檬酸(一水合物)、2.22 g磷酸二氢钠(一水合物)、31.9 g葡萄糖(一水合物)和0.275 g腺嘌呤。

CP2D (柠檬酸盐磷酸盐双葡萄糖)为抗凝剂和防腐剂溶液，据报道其1升在水中含有26.30 g柠檬酸三钠(二水合物)、3.27 g柠檬酸(一水合物)、2.22 g磷酸二氢钠(一水合物)和51.1 g葡萄糖(一水合物)。

AS1为与柠檬酸盐磷酸盐葡萄糖型抗凝剂溶液(例如CPD和CPDA-1)一起使用的添加剂溶液，据报道其100 ml含有2.20 g葡萄糖(一水合物)、27 mg腺嘌呤、750 mg甘露醇和900 mg氯化钠。添加剂溶液通常在RBC与血浆分离之后加入到RBC中。

AS3为与CP2D抗凝剂溶液一起使用的添加剂溶液，据报道其100 ml含有1.1 g葡萄糖(无水)、30 mg腺嘌呤、276 mg磷酸二氢钠(一水合物)、410 mg氯化钠、588 mg柠檬酸钠(二水合物)和42 mg柠檬酸(一水合物)。添加剂溶液通常在RBC与血浆分离之后加入到RBC中。

AS5为与柠檬酸盐磷酸盐葡萄糖型抗凝剂溶液(例如CPD和CPDA-1)一起使用的添加剂溶液，据报道其100 ml含有900 mg葡萄糖(一水合物)、30 mg腺嘌呤、525 mg甘露醇和877 mg氯化钠。添加剂溶液通常在RBC与血浆分离之后加入到RBC中。

以上本发明各种实施方案的简述并非意欲描述本发明的每个实施方案或每一实施。相反，考虑到附图并通过参照以下描述和权利要求书，本发明的更完整理解将变得显而易见和意识到。进一步应该理解，可采用其它实施方案并可进行结构变化而不背离本发明的范围。

附图简述

图1为显示2,3-DPG水平(无2,3-DPG; 正常水平的2,3-DPG; 和增加2,3-DPG)的影响的氧解离曲线的图示，血氧饱和度(%)标绘在y-轴，和P₀₂ (mm Hg)标绘在x-轴。

图2为显示对于人血使用本发明的实施方案(溶液A)和对照的2,3-DPG水平(毫摩尔2,3-DPG/升红细胞)相对于储存时间(天)的图解说明。

图3为显示对于人血使用本发明的实施方案(溶液A)和对照的ATP水平(ATP, %基线)相对于储存时间(天)的图解说明。

图4为显示对于人血使用本发明的实施方案(溶液A)和对照的还原型谷胱甘肽水平(%基线)相对于储存时间(天)的图解说明。

图5为显示对于人血使用本发明的实施方案(溶液A)和对照的P50水平(mm Hg)相对于储存时间(天)的图解说明。

图6为显示对于人血使用本发明的实施方案(溶液D和E)和对照的2,3-DPG水平(毫摩尔2,3-DPG/升红细胞)相对于储存时间(天)的图解说明。

图7为显示对于人血使用本发明的实施方案(溶液D和E)和对照的ATP水平(ATP, %基线)相对于储存时间(天)的图解说明。

图8为显示对于人血使用本发明的实施方案(溶液D和E)和对照的pH相对于储存时间(天)的图解说明。

图9为显示对于人血使用本发明的实施方案(溶液D和E)和对照的还原型谷胱甘肽水平(%)相对于储存时间(天)的图解说明。

说明性实施方案的详述

在1915年，首次尝试从捐献者直接向接受者输血。在第一次世界大战之后的数年间，实践随着使用柠檬酸盐葡萄糖溶液采集血液、使用冷藏和血型检定而改进。然后，在20世纪60年代和20世纪70年代，改进持续，此时用耐用塑料袋替代玻璃瓶储存、开发了更好的抗凝剂以及加入甘露醇和腺嘌呤使得RBC能够储存42天。参见例如Bartlett等, J Clin. Invest. 1960; 39:56; Bunn等, J Clin. Invest. 1969; 48:311; Akerblom等, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1968; 21:245-248; 和Delivoria-Papadopoulos等, Science 1969; 165:601-602。现今，血液仍然用包含腺嘌呤和柠檬酸盐的各种抗凝剂溶液保存。血液于4℃下储存，用塑料血袋采集，并且如果在42天内未使用，则丢弃，这是因为在那之后RBC活力极大丧失。当RBC死亡，溶解的细胞释放更持久的血红蛋白分子，后者具有低的P50，并且呈现对氧气扩散的阻挡。现今有人估计在美国每年输血约1600万单位的RBC。

RBC在储存期间经历重大生化和生物力学变化，这些变化影响其输血后的性能。最近的流行病学研究显示，输入储存较陈旧的血液与死亡率增加、严重感染、多器官功能衰竭和医院住院时间相关联。参见例如Walsh等, Crit. Care Med. 2004; 32:364-371; Van de Watering等, Transfusion 2006; 46:1712-1718; Vamvakas等, Transfusion 2000; 40:101-109; 和Hebert等, Anesthesia & Analgesia. 2005; 100:1433-1438。2,3-DPG的损失证明了RBC储存损伤，2,3-DPG为人红细胞的主要有机磷酸酯。细胞中的2,3-DPG含量与氧-血红蛋白解离曲线的位置相关联，如通过P50 (血红蛋白被50%饱和时的氧(O₂)分压)反映的那样。在于常规血库条件下储存的血液中，2,3-DPG水平急剧下降，并且到储存10天时，2,3-DPG水平仅为其初始水平的20-25%。在储存21天内，其下降至其初始含量的10% (Van de Watering等, Transfusion 2006; 46:1712-1718和Vamvakas等, Transfusion 2000; 40:101-109。

储存损伤仍然是输血医学中的重大关注和主要研究焦点。有证据表明，在长的时间段内储存RBC导致氧气递送减少，并且输入较陈旧的血液(即储存多于14天)已被确定为发生多器官功能衰竭的独立危险因素。参见例如(Fitzgerald等, Crit. Care Med. 1997; 25:726-732; Marik等, JAMA, 1993; 269:3024-3029; Raat等, Crit. Care Med., 2005; 33:39-45和Zallen等, Am. J. Surg., 1999; 178:570-572)。

基于早期研究的结果(例如Van de Watering等, Transfusion 2006; 46:1712-1718和Vamvakas等, Transfusion 2000; 40:101-109)，已经认为RBC中的2,3-DPG水平在输血24小时内复原。这些研究在没有循环问题和具有正常血量的健康志愿者进行。不知这样的恢复是否可发生于患有严重失血、循环问题或与潜在医学病况有关问题的患者。进一步地，在输血后早期数小时的关键时间内，输入的RBC不能向组织递送氧气可显著影响临床结果。尽管某些研究表明，输入的RBC的储存期(age)在某些情况下对临床结果具有很少或者没有影响(例如Hebert等, Anesthesia & Analgesia. 2005; 100:1433-1438)，但其它的研究表明相反的结论，显示RBC的储存持续时间与不利的结果有关(Oski等, Blood 1971; 37:52-58)。

主要文献表明，开发可限制或逆转储存损伤的RBC储存溶液对于输血医学相当重要，并可有助于使RBC输入更加安全和更加有效。参见例如Fitzgerald等, Crit. Care Med. 1997; 25:726-732; Marik等, JAMA, 1993; 269:3024-3029; Raat等, Crit. Care Med., 2005; 33:39-45; Zallen等, Am. J. Surg., 1999; 178:570-572; Buetler等, J. Lab. Clin. Med., 1969; 74:300和Valerie等, J. Lab. Clin. Med., 1969; 73:722-733。假定目前公开的RBC储存和/或复原组合物将提供这种复原益处。

一方面，本公开提供血液储存和/或复原组合物。在一个实施方案中，组合物包含D-核糖和L-精氨酸和/或D-精氨酸(并且优选地为L-精氨酸)。任选地，组合物可进一步包含丙酮酸钠、无机磷酸盐和肌苷中的一种或更多种。在优选的实施方案中，组合物为水溶液。在优选的实施方案中，组合物为具有6-8.5的pH的含水组合物。亦公开了使用这种组合物的方法。

在另一个实施方案中，血液储存和/或复原组合物包含：75-1500 mM L-精氨酸和/或D-精氨酸(并且优选地为L-精氨酸)；和75-1500 mM肌苷，其中组合物为水溶液。任选地，组合物可进一步包含浓度为例如75-1500 mM的D-核糖。任选地，组合物可进一步包含浓度为例如75-1500 mM的丙酮酸钠。任选地，组合物可进一步包含浓度为例如75-1500 mM的无机磷酸盐。当用于储存和/或复原血液时，组合物通常被稀释约30倍，以提供最终浓度为2.5-50 mM的L-精氨酸和/或D-精氨酸(并且优选地为L-精氨酸)；2.5-50 mM的肌苷；和任选地2.5-50 mM的D-核糖、2.5-50 mM的丙酮酸钠和/或2.5-50 mM的无机磷酸盐。

在某些优选的实施方案中，血液储存和/或复原组合物包含：150-900 mM L-精氨酸和/或D-精氨酸(并且优选地为L-精氨酸)；和150-900 mM肌苷，并且组合物为水溶液。任选地，组合物可进一步包含浓度为例如150-900 mM的D-核糖。任选地，组合物可进一步包含浓度为例如150-900 mM的丙酮酸钠。任选地，组合物可进一步包含浓度为例如150-900 mM的无机磷酸盐。当用于储存和/或复原血液时，组合物通常被稀释约30倍，以提供最终浓度为5-30 mM的L-精氨酸和/或D-精氨酸(并且优选地为L-精氨酸)；和5-30 mM的肌苷；和任选地5-30 mM的D-核糖、5-30 mM的丙酮酸钠和/或5-30 mM的无机磷酸盐。

在其它优选的实施方案中，血液储存和/或复原组合物包含：300-600 mM L-精氨酸和/或D-精氨酸(并且优选地为L-精氨酸)；和300-600 mM肌苷，并且组合物为水溶液。任选地，组合物可进一步包含浓度为例如300-600 mM的D-核糖。任选地，组合物可进一步包含浓度为例如300-600 mM的丙酮酸钠。任选地，组合物可进一步包含浓度为例如300-600 mM的无机磷酸盐。当用于储存和/或复原血液时，组合物通常被稀释约30倍，以提供最终浓度为10-20 mM的L-精氨酸和/或D-精氨酸(并且优选地为L-精氨酸)；和10-20 mM的肌苷；和任选地10-20 mM的D-核糖、10-20 mM的丙酮酸钠和/或10-20 mM的无机磷酸盐。

在某些实施方案中，L-精氨酸与肌苷的摩尔比为0.5:1-1.5:1。在其它某些实施方案中，L-精氨酸与肌苷的摩尔比为0.8:1-1.2:1。在某些优选的实施方案中，L-精氨酸与肌苷的摩尔比为1:1。

在另一个实施方案中，血液储存和/或复原组合物包含：300 mM L-精氨酸、300 mM肌苷、300 mM D-核糖、300 mM丙酮酸钠和300 mM无机磷酸盐，其中组合物为水溶液。当用于储存和/或复原血液时，组合物通常被稀释约30倍，以提供最终浓度为10 mM的L-精氨酸、10 mM的肌苷、10 mM的D-核糖、10 mM的丙酮酸钠和10 mM的无机磷酸盐。

在某些实施方案中，本文描述的血液储存和/或复原组合物可进一步包含氯化钠、葡萄糖、腺嘌呤、甘露醇、柠檬酸钠和柠檬酸中的一种或更多种。

对于一个实例，血液储存和/或复原组合物可为包含以下的添加剂溶液：L-精氨酸、肌苷、D-核糖、丙酮酸钠、无机磷酸盐、氯化钠、葡萄糖、腺嘌呤和甘露醇。这类添加剂溶液特别可用于含有选自以下的抗凝剂的储存和/或复原血液：ACD、CPD、CPDA-1及其组合。

对于另一个实例，血液储存和/或复原组合物可为包含以下的添加剂溶液：L-精氨酸、肌苷、D-核糖、丙酮酸钠、无机磷酸盐、氯化钠、葡萄糖、腺嘌呤、柠檬酸钠和柠檬酸。这类添加剂溶液特别可用于储存和/或复原含有CP2D抗凝剂的血液。

本文描述的组合物可用于例如储存血液的方法中。在某些实施方案中，所述方法包括使RBC (例如浓集的RBC或在全血中)与本文描述的血液储存和/或复原组合物接触。

或者，或除此以外，本文描述的组合物可用于例如复原血液(例如浓集的RBC或在全血中)的方法中。在某些实施方案中，所述方法包括使RBC与本文描述的血液储存和/或复原组合物接触。

在一些实施方案中，本文公开的血液储存和/或复原组合物可呈添加剂溶液的形式，其可在采集全血时加入到RBC中；或者在去除血浆之前、期间和/或之后加入到RBC中，和/或在储存之前、期间和/或之后加入到浓集的RBC中。

在某些优选的实施方案中，复原血液的方法包括：提供具有低于新鲜抽取血液的2,3-DPG值的2,3-DPG值的RBC (例如浓集的RBC或在全血中)；并在有效增加2,3-DPG值的条件下使RBC与血液储存和/或复原组合物混合，其中所述血液储存和/或复原组合物包含L-精氨酸和/或D-精氨酸。在某些实施方案中，有效增加2,3-DPG值的条件包括在4℃-37℃的温度下，并且在某些优选的实施方案中为在室温的温度下，用血液储存和/或复原组合物温育细胞。在某些实施方案中，有效增加2,3-DPG值的条件包括用血液储存和/或复原组合物温育细胞至少10分钟的时间，在优选的实施方案中为10分钟-48小时的时间，在某些优选的实施方案中为10分钟-4小时的时间，和在其它优选的实施方案中为30分钟-2小时的时间。有效增加2,3-DPG值的示例性条件包括在37℃下，用血液储存和/或复原组合物温育细胞10分钟-4小时。有效增加2,3-DPG值的其它示例性条件包括在室温下，用血液储存和/或复原组合物温育细胞10分钟-24小时，在一些实施方案中为10分钟-8小时，和在一些实施方案中为10分钟-4小时。在优选的实施方案中，血液储存和/或复原组合物包括本文描述的血液储存和/或复原组合物中的一种或更多种。

在某些优选的实施方案中，复原血液的方法包括：提供具有低于新鲜抽取血液的ATP值的ATP值的RBC (例如浓集的RBC或在全血中)；并在有效增加ATP值的条件下使RBC与血液储存和/或复原组合物混合，其中所述血液储存和/或复原组合物包含L-精氨酸和/或D-精氨酸。在某些实施方案中，有效增加ATP值的条件包括在4℃-37℃的温度下，并且在某些优选的实施方案中为在室温的温度下，用血液储存和/或复原组合物温育细胞。在某些实施方案中，有效增加ATP值的条件包括用血液储存和/或复原组合物温育细胞至少10分钟的时间，在优选的实施方案中为10分钟-48小时的时间，在某些优选的实施方案中为10分钟-4小时的时间，和在其它优选的实施方案中为30分钟-2小时的时间。有效增加ATP值的示例性条件包括在37℃下，用血液储存和/或复原组合物温育细胞10分钟-4小时。有效增加ATP值的其它示例性条件包括在室温下，用血液储存和/或复原组合物温育细胞10分钟-24小时，在一些实施方案中为10分钟-8小时，和在一些实施方案中为10分钟-4小时。在优选的实施方案中，血液储存和/或复原组合物包括本文描述的血液储存和/或复原组合物中的一种或更多种。

在某些优选的实施方案中，复原血液的方法包括：提供具有低于新鲜抽取血液的还原型谷胱甘肽值的还原型谷胱甘肽值的RBC (例如浓集的RBC或在全血中)；并在有效增加还原型谷胱甘肽值的条件下使RBC与血液储存和/或复原组合物混合，其中所述血液储存和/或复原组合物包含L-精氨酸和/或D-精氨酸。在某些实施方案中，有效增加还原型谷胱甘肽值的条件包括在4℃-37℃的温度下，并且在某些优选的实施方案中为在室温的温度下，用血液储存和/或复原组合物温育细胞。在某些实施方案中，有效增加还原型谷胱甘肽值的条件包括用血液储存和/或复原组合物温育细胞至少10分钟的时间，在优选的实施方案中为10分钟-48小时的时间，在某些优选的实施方案中为10分钟-4小时的时间，和在其它优选的实施方案中为30分钟-2小时的时间。有效增加还原型谷胱甘肽值的示例性条件包括在37℃下，用血液储存和/或复原组合物温育细胞10分钟-4小时。有效增加还原型谷胱甘肽值的其它示例性条件包括在室温下，用血液储存和/或复原组合物温育细胞10分钟-24小时，在一些实施方案中为10分钟-8小时，和在一些实施方案中为10分钟-4小时。在优选的实施方案中，血液储存和/或复原组合物包括本文描述的血液储存和/或复原组合物中的一种或更多种。

在某些优选的实施方案中，复原血液的方法包括：提供具有低于新鲜抽取血液的氧解离P50值的氧解离P50值的RBC (例如浓集的RBC或在全血中)；并在有效增加氧解离P50值的条件下使RBC与血液储存和/或复原组合物混合，其中所述血液储存和/或复原组合物包含L-精氨酸和/或D-精氨酸。在某些实施方案中，有效增加氧解离P50值的条件包括在4℃-37℃的温度下，并且在某些优选的实施方案中为在室温的温度下，用血液储存和/或复原组合物温育细胞。在某些实施方案中，有效增加氧解离P50值的条件包括用血液储存和/或复原组合物温育细胞至少10分钟的时间，在优选的实施方案中为10分钟-48小时的时间，在某些优选的实施方案中为10分钟-4小时的时间，和在其它优选的实施方案中为30分钟-2小时的时间。有效增加氧解离P50值的示例性条件包括在37℃下，用血液储存和/或复原组合物温育细胞10分钟-4小时。有效增加氧解离P50值的其它示例性条件包括在室温下，用血液储存和/或复原组合物温育细胞10分钟-24小时，在一些实施方案中为10分钟-8小时，和在一些实施方案中为10分钟-4小时。在优选的实施方案中，血液储存和/或复原组合物包括本文描述的血液储存和/或复原组合物中的一种或更多种。

另一方面，本公开进一步提供改进储存的RBC的抗氧化防护的方法。

在一个实施方案中，所述方法包括使RBC与本文描述的血液储存和/或复原组合物接触。

在另一个实施方案中，所述方法包括使包含RBC和抗凝剂的组合物与本文描述的添加剂溶液接触，其中抗凝剂选自ACD、CPD、CPDA-1及其组合。

在另一个实施方案中，所述方法包括使包含RBC和抗凝剂的组合物与本文描述的添加剂溶液接触，其中抗凝剂为CP2D。

通过增加应激RBC中的2,3-DPG浓度，假定本文公开的RBC储存和/或复原组合物可在输血后减少氧亲和力和增加向受影响组织的氧递送。进一步地，通过保持细胞能量，假设本文公开的储存和/或复原组合物可减少细胞脆弱性和增加变形性，从而改进经过毛细血管的流动。最终结果将是在输血后储存损伤减少以及向受影响组织的氧递送更多。

在优选的实施方案中，本文公开的血液储存和/或复原组合物具有保持和增强储存的红细胞的抗氧化防护，从而减少储存损伤的另外益处。认为通过提供将RBC储存损伤的影响减至最小并且改进储存的RBC功能的组合物，储存溶液可对血库和输血技术产生积极的影响。

由2,3-DPG和细胞内ATP损失引起的RBC功能变化均被充分记载。RBC低温储存已导致RBC成功储存最多42天。然而，一些目前的储存溶液并未防止对红细胞的时间依赖性氧化攻击，导致形成活性氧簇、变性血红蛋白附着于膜磷脂和在整个储存期间释放含有血红蛋白的膜微泡(Kanias等, FEBS Journal, 2009; 277:343-356)。

据报道自发性脂质过氧化为红细胞老化的主要原因之一。参见例如等, Clin. Chim. Acta., 1997年11月28日; 267(2):129-142; Dormandy, Br. J. Haematol, 1971; 20:457-461; Halliwell等, Biochem. J., 1984; 219:1-14; Chiu等, Seminars in Hematology, 1989; 26:257-276; Knight等, Transfusion, 1992; 32:354-357和Jain, Biochim. Biophys. Acta, 1988; 937:205-210。氧化通常为细胞损伤的重要原因，并且造成脂质氧化的反应最终产物积聚、膜蛋白和核酸结构的修饰、以及酶活性的减少(Dumaswala等, Free Rad. Res., 2000, 33:517-529)。在健康的红细胞中，由小的抗氧化化合物比如谷胱甘肽(GSH)、维生素E、维生素C和酶比如GSH-过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶(SOD)组成的非常有效的抗氧化系统，防止显著的氧化损伤。还原型GSH与GSH-PX一起为RBC中活性氧簇的主要清除剂之一。GSH占细胞内非蛋白硫醇的90%，并因此为RBC的重要细胞内还原剂。据报道RBC的低温储存诱导时间依赖性的GSH丧失，这继而导致潜在毒性过氧化物(例如过氧化氢)增加。另外，已经表明，GSH浓度下降伴随GSH-PX减少及膜脂质和蛋白的氧化修饰包括丙二醛(MDA)的增加(Deneke等, Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol., 1989; 257:L163-L173)。在优选的实施方案中，本文公开的血液储存和/或复原组合物防止对低温储存期间的RBC的氧化攻击。

在优选的实施方案中，本文公开的血液储存和/或复原组合物保持低温储存的RBC的GSH水平，其继而在储存的血液中保持抗氧化活性。在优选的实施方案中，本文公开的血液储存和/或复原组合物包含在溶液中的D-核糖，其可允许绕过葡萄糖代谢的戊糖磷酸途径的限速步骤，以刺激PRPP合成。

本发明通过以下实施例进行说明。应该理解，具体实例、材料、数量和程序将根据本文阐述的本发明范围和精神进行广泛解释。

实施例

实施例1

制备作为浆液且包含浓度均为300 mM的D-核糖、肌苷、丙酮酸钠和无机磷酸盐的储存和/或复原组合物。当用于储存和/或复原RBC时，将该浆液稀释30倍至最终浓度为10 mM，以形成溶液。该组合物在储存RBC中恢复2,3-DPG水平和自基线值增加ATP含量方面呈现显著性结果。在一项研究中，根据标准血库实践采集RBC并在4℃下储存平均21天。向储存21天的RBC加入各种RBC储存和/或复原组合物，并在37℃下保持1-4小时，之后测试2,3-DPG浓度。使用可得自Roche Diagnostics Corp. (目录号10148334001)的2,3-二磷酸甘油酸酯(DPG)诊断试剂盒，在全部实施例中测量2,3-DPG水平。RBC的正常2,3-DPG浓度在一经收获时为4.0 μmol/ml。在储存后平均2,3-DPG浓度降至0.17 μmol/ml (表1)。加入RBC储存和/或复原组合物使浓度恢复至大于正常收获后水平的50%。认为增加至1.0 μmol/ml为显著改进。这一系列的试验证实了RBC储存和/或复原组合物增加ATP含量和2,3-DPG水平。然而，在血库实践中采用的溶液的实用性可能由于肌苷的低溶解性以及需要在输血之前温热血液(例如1小时)而受到限制

表1：含有RBC储存和/或复原组合物的储存RBC的2,3-DPG水平

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设计实验方案以找出增加肌苷溶解性的方法。发现在等分子溶液中的L-精氨酸提高肌苷的溶解性，使得肌苷在室温下保持在浓度高于50 mM的溶液中。将包含各300 mM的肌苷、L-精氨酸、丙酮酸钠、D-核糖和无机磷酸盐的储存和/或复原组合物稀释30倍至储存21天的RBC中。将一组储存的血样在室温下温育60分钟，而另一组在37℃下温育60分钟。如在表2中显示的那样，含有L-精氨酸的储存和/或复原组合物成功恢复2,3-DPG和ATP水平而与温热模式无关。该结果证实使用室温温育和溶液复原2,3-DPG和ATP没有与浆液和在输血之前洗涤红细胞有关的问题

表2：用含有L-精氨酸的溶液储存的RBC的2,3-DPG和ATP

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实施例2

设计另外的实验方案以确定肌苷以外的核苷是否可成功帮助恢复2,3-DPG和ATP水平，并潜在地减少分解产物次黄嘌呤和尿酸的形成。鸟苷，一种由通过其N9氮与核糖的C1碳键合的鸟嘌呤组成的嘌呤核苷，被选作受试核苷酸。表3呈现了使用包含终浓度各为10 mM的鸟苷、丙酮酸钠、无机磷酸盐和D-核糖的储存和/或复原组合物得到的数据

表3：用含有鸟苷的溶液储存的RBC的2,3-DPG和ATP

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当加热至37℃保持60分钟时，10 mM鸟苷溶液能够恢复2,3-DPG水平。浓缩的鸟苷组合物未完全溶解，并且在稀释时，在室温温育后并未恢复2,3-DPG水平，但ATP水平升高。

实施例3

表4呈现了使用包含各10 mM的无机磷酸盐和D-核糖以及所示浓度的鸟苷的储存和/或复原组合物得到的数据。该溶液不包含丙酮酸钠。在37℃下温育60分钟观测到复原

表4

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实施例4

表5呈现了使用包含终浓度各为10 mM的L-精氨酸、鸟苷、D-核糖、丙酮酸钠和无机磷酸盐的储存和/或复原组合物得到的数据。在37℃下温育10分钟和60分钟后观测到复原

表5

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当在包含各10 mM的D-核糖、丙酮酸钠和无机磷酸盐的储存和/或复原组合物中用不同浓度的一磷酸肌苷替代肌苷时，在37℃下温育60分钟未观测到复原。

实施例6

当在包含各10 mM的D-核糖、丙酮酸钠和无机磷酸盐的储存和/或复原组合物中用不同浓度的核糖-5-磷酸替代肌苷时，在37℃下温育60分钟未观测到复原。

实施例7

用包含各10 mM的肌苷、D-核糖、丙酮酸钠和无机磷酸盐的储存和/或复原组合物，在4℃下温育10分钟未观测到复原。

实施例8：氧解离评价

氧解离曲线(ODC)提供在不同氧分压下血红蛋白百分比饱和度的量度。ODC提供P50值，其为红细胞被氧气饱和50%时压力的量度。

1904年S-形O₂平衡曲线和玻尔效应的发现促进了对血液呼吸功能和血红蛋白(Hb)变构机制的多产和持续研究。玻尔效应(pH/CO₂对HbO₂亲和力的影响)和相互的霍尔丹效应(HbO₂饱和度对H⁺/CO₂结合的影响)源自Hb氧合-脱氧构象变化和O₂与H⁺/CO₂结合位点之间的变构相互作用。在稳态下，H⁺跨RBC膜被动分布，并且细胞内pH (pHi)变化与细胞外pH变化、Hb-O₂饱和和RBC有机磷酸酯含量有关。当Hb分子在动脉-静脉气体运输中在氧合和脱氧构象之间变换时，其递送O₂并吸收组织毛细血管中的CO₂和H⁺ (Jensen, Acta Physiol Scand, 2004年11月, 182(3):215-27)。

RBC储存和/或复原组合物优选地升高ATP含量，并增加2,3-DPG水平。然而，也期望所述储存和/或复原组合物导致从红细胞至组织的氧解离增加。目前公开的RBC储存和/或复原组合物已经显示有效增强氧解离。

2,3-DPG降低O₂对血红蛋白的结合亲和力，这使曲线向右移动。2,3-DPG对氧解离的影响在图1中进行说明。

P50值使用Hemox Analzer (TCS Medical, South Hampton PA)进行评价。在室温和37℃下氧解离评价的概述显示在表6中。在以下列出的所有试验中，评价了以下储存和/或复原组合物：10 mM的以下组分(核糖、丙酮酸钠、L-精氨酸、无机磷酸盐、肌苷)。评价的袋为CDPA-AS1

表6

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实施例9：储存试验

用柠檬酸盐磷酸盐葡萄糖抗凝剂溶液(AS1, Fenwal Inc., Lake Zurich, IL)制备D-核糖、肌苷、L-精氨酸、丙酮酸钠和无机磷酸盐的30X浓度储备溶液，产生溶液A，配制溶液A以提供最终血液浓度为10 mM的D-核糖、10 mM的肌苷、10 mM的L-精氨酸、10 mM的丙酮酸钠和10 mM的无机磷酸盐。据报道柠檬酸盐磷酸盐葡萄糖抗凝剂溶液每70 ml溶液含有1.8 g柠檬酸三钠、1.78 g葡萄糖、209 mg柠檬酸和155 mg磷酸二氢钠。用HCl将溶液A的pH调节至6.25。

用溶液A以1:8的溶液A与血液体积比，自正常捐献者采集人血：通过在注射器中预先填充2.5 mL的溶液A，然后将20 mL捐献者血液直接采集到含有溶液A的注射器中。作为对照，使用AS1添加剂溶液替代溶液A制备样品。

样品用20 ml袋热封并在4℃下储存。

如本文描述的那样测量2,3-DPG水平、pH、ATP和P50，并且结果显示在表7和图2-5中。使用来自Oxis Research的Bioxytech GSH-420试剂盒测量还原型谷胱甘肽

表7

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实施例10：复原实验

过期的浓集RBC (45-47天)得自美国红十字会(Chicago, IL)，其含有AS3或AS5作为添加剂。

用AS3添加剂(Pall)制备D-核糖、肌苷、L-精氨酸、丙酮酸钠和无机磷酸盐的30X浓度储备溶液，产生溶液B，配制溶液B以提供最终血液浓度为10 mM的D-核糖、10 mM的肌苷、10 mM的L-精氨酸、10 mM的丙酮酸钠和10 mM的无机磷酸盐。将10 mL溶液B加入到300 mL的47天陈旧的浓集RBC中。作为对照，使用AS3添加剂替代溶液B制备样品。

用AS5添加剂(Terumo)制备D-核糖、肌苷、L-精氨酸、丙酮酸钠和无机磷酸盐的30X浓度储备溶液，产生溶液C，配制溶液C以提供最终血液浓度为10 mM的D-核糖、10 mM的肌苷、10 mM的L-精氨酸、10 mM的丙酮酸钠和10 mM的无机磷酸盐。将10 mL溶液C加入到300 mL的45天陈旧的浓集RBC中。作为对照，使用AS5添加剂替代溶液C制备样品。

复原条件为伴随混合下在37℃下60分钟。测量2,3-DPG水平并且结果显示在表8中

表8

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实施例11：储存实验

如本文以下描述的那样，除了使用AS3和AS5添加剂溶液替代AS1添加剂溶液，如在实施例9中描述的那样实施储存实验。

用AS3添加剂溶液(Pall)制备D-核糖、肌苷、L-精氨酸、丙酮酸钠和无机磷酸盐的30X浓度储备溶液，产生溶液D，配制溶液D以提供最终血液浓度为10 mM的D-核糖、10 mM的肌苷、10 mM的L-精氨酸、10 mM的丙酮酸钠和10 mM的无机磷酸盐。用溶液D以1:8的溶液D与血液体积比，自正常捐献者采集人血：通过在注射器中预先填充2.5 mL的溶液D，然后将20 mL捐献者血液直接采集到含有溶液D的注射器中。

用AS5添加剂溶液(Terumo)制备D-核糖、肌苷、L-精氨酸、丙酮酸钠和无机磷酸盐的30X浓度储备溶液，产生溶液E，配制溶液E以提供最终血液浓度为10 mM的D-核糖、10 mM的肌苷、10 mM的L-精氨酸、10 mM的丙酮酸钠和10 mM的无机磷酸盐。用溶液E以1:8的溶液E与血液体积比，自正常捐献者采集人血：通过在注射器中预先填充2.5 mL的溶液E，然后将20 mL捐献者血液直接采集到含有溶液E的注射器中。

作为对照，使用AS1添加剂溶液替代溶液D或溶液E制备样品。

样品用20 ml袋热封并在4℃下储存。

如本文描述的那样测量2,3-DPG水平、pH、P50和ATP，并且结果显示在表9和图6-9中。使用来自Oxis Research的Bioxytech GSH-420试剂盒测量还原型谷胱甘肽

表10

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本文引用的所有专利、专利申请和出版物以及可电子获得的材料(例如递交的GenBank氨基酸和核苷酸序列，以及递交的蛋白数据库(pdb))的完整公开内容通过引用结合到文本中。给出上述详述和实施例仅为了理解清楚。不应由此理解为不必要的限制。本发明不限于所显示和描述的准确细节，对本领域技术人员显而易见的变化将包括在权利要求书限定的本发明内。