一种载银贝壳粉抗菌剂的制备方法与流程

本发明属于抗菌剂的制备技术领域，具体涉及一种载银贝壳粉抗菌剂的制备方法。

背景技术：

健康是我们最关心的话题之一，细菌作为一种适应力极强的物种，在人类生活的区域，细菌几乎无处不在。近年来因为细菌引发的感染事件也层出不穷，近一个世纪以来，抗生素被广泛用于各种抗菌领域，但是近年来随着人们对抗生素研究的深入，由于使用抗生素有可能使细菌产生耐药性的弊端。在滥用抗生素引发各种问题的大背景下，抗生素表现出了一定程度的局限性。于是，人们开始把目光投向传统的一些无机抗菌剂，比如本文提到的金属离子抗菌剂——纳米银抗菌剂。

随着近代纳米技术的发展，纳米级的银粒子，由于其特殊的性质，受到了很大的关注。单质纳米银体积极小，不易于储存、使用，现阶段将纳米银作为抗菌材料使用的主要是将银粒子负载在载体上，起到抗菌作用。在医疗方面有纳米银渗透织物(抗菌纱布)对上上烫伤的伤口处理可以抑制感染细菌，效果能够持续3天，超过了临床常用的诺氟沙星的效果。在织物上负载纳米银，可以促进伤口的愈合，使受损细胞更快再生与修复，能够改善创伤周围组织的微循环，有效地激活并促进组织细胞的生长，使伤口恢复更快，减少留疤的隐患。医疗器械上有载纳米级银的不锈钢材料，净水方面有活性氧化铝吸附纳米银，处理饮水泳池水以及工业循环水等。纳米银也有运用在涂料上，制成抗菌涂料，根据相关专利文献记载，涂料暴露在日光下400h，涂料的性能没有发现变化。

沿海地区贝壳资源丰富，但是大量打捞的同时，留下了很多废弃贝壳，造成贝壳污染。但是贝壳却有着很多不为人所注意的价值，例如作为混凝土骨料制成的混凝土，能够发挥承重的能力，本发明选用贝壳作为负载材料，也有利用价格低廉，甚至作为废品的贝壳资源，变废为宝的考量。贝壳是一种生物矿化作用形成的生物矿物材料，碳酸钙占其质量的95％，其余的5％包括蛋白质，及甲克素等有机基质，贝壳是由碳酸钙和生物大分子组成的纳米复合材料，经适当处理，生物大分子之间的一些基团被破坏，一些活性官能团暴露与表面，表面的一些基团正好为银的负载提供了场所，同时，部分纤维蛋白溶胀降解，甲壳素转化为壳聚糖，而壳聚糖也具有一定的抗菌性能。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种抗菌效果好、广谱性抗菌的载银贝壳粉抗菌剂的制备方法，该制备方法简单快捷，同时变废为宝，具有广泛的市场前景。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种载银贝壳粉抗菌剂的制备方法，主要包括以下步骤：

步骤一、贝壳粉的制备

1.1取贻贝原料，将贝壳敲打成碎片，浸泡于0.5mol/g氢氧化钠溶液中12h，超声振荡处理10min，以清水冲洗，在60℃条件下烘干，用中药粉碎机中粉碎；

1.2将粉碎后的贝壳置于氢氧化钠溶液中，于60℃的磁力搅拌器上保持1h，反应完成后抽滤分离，并同时用去离子水清洗，干燥；

1.3将分离得到的贝壳粉进行无氧煅烧，冷却，煅烧后的贝壳粉呈灰黑色；

1.4将无氧煅烧的贝壳粉进行有氧烧结，冷却收集，灼烧后的贝壳粉呈白色。

步骤二、载银贝壳粉的合成

2.1分别取浓度为0.498mg/ml的柠檬酸钠溶液、浓度为0.5mg/ml的硝酸银溶液混合并添加得到的贝壳粉，将混合液置于磁力搅拌器上搅拌，冰浴状态下于磁力搅拌机上搅拌3min；

2.2逐滴滴加浓度为0.22mg/ml的硼氢化钠溶液，静置；

2.3反应终止后，取出混合悬液，于2000rpm下离心5min弃去上清液，加入双蒸水洗涤，离心，将产物置于60℃烘箱干燥既得载银贝壳粉抗菌剂。

进一步的，

本发明步骤1.3中无氧煅烧的条件为：550℃，1h。

本发明步骤1.4中有氧烧结的条件为：750℃，1h。

本发明步骤二中，柠檬酸钠溶液、硝酸银溶液、硼氢化钠溶液的体积比为4.5:5:3，优选为柠檬酸钠溶液4.5ml，硝酸银溶液5ml，硼氢化钠溶液3ml。

本发明步骤2.1中，贝壳粉的添加量与硼氢化钠溶液的质量体积比为0.1g/ml，优选为0.3g。

本发明贝壳粉的制备过程中可不进行步骤1.3和1.4的处理，也可只选择步骤1.3或1.4的进行处理。

本发明制备载银贝壳粉抗菌剂的方法中，当贝壳粉的制备过程中不进行步骤1.3和1.4的处理时，可在载银贝壳粉的合成后进行步骤1.3和/或1.4的处理。

另外，本发明载银贝壳粉抗菌剂还可通过以下方法制备：

溶液配制同上，在烧杯中加入5.0ml硝酸银溶液、4.5ml PVP、0.3g贝壳粉，于磁力搅拌器上搅拌混匀，用高压汞灯正上方照射混合悬液，反应1h，待悬液颜色不再变化时，终止反应，于2000rpm下离心5min弃去上清液，加入双蒸水洗涤，离心，将产物置于60℃烘箱干燥既得载银贝壳粉抗菌剂。

本发明的有益效果为：

本发明使用化学还原法制备出了纳米银颗粒，利用原位还原法制备出负载纳米银的贝壳粉，经试验证明载纳米银贝壳粉有一定的抑菌作用，符合抑菌剂的标准，通过一定时间的扩散处理(4℃冰箱放置12小时)，可以在一定程度上增强抑菌效果，本发明方法采用二次烧结的工艺处理贝壳粉，使贝壳粉表面有丰富的绒毛状凹凸的脊，银被还原出来后可以负载在缝隙中，在一定程度上增大了单位质量银储存量，本发明方法所得载银贝壳粉抗菌剂抗菌效果可以持续48h保持在一定高强度，有很好的持续抗菌效果，同时本发明方法原料在沿海地区资源丰富，成本低，操作工艺简单，制备出的纳米银抗菌剂能有良好的抗菌性能和释放能力，可以将载银贝壳粉抗菌剂运用于化妆品及涂料中等，具有广泛的市场应用前景。

附图说明

图1是二次灼烧氢氧化钠预处理贝壳粉；

图2是氢氧化钠预处理贝壳粉；

图3是AR贝壳粉结合纳米银后700℃煅烧1h产物；

图4是紫外还原法二次煅烧贝壳粉。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

本发明记载了一种载银贝壳粉抗菌剂的制备方法，下面具体说明本发明的制备工艺。

1、制备纳米银

实验有两种方案：①硼氢化钠还原法。②紫外照射法

①液相还原法

AgNO₃+NaBH₄+3H₂O＝Ag+NaNO₃+B(OH)₃+3.5H₂

试剂：硝酸银(常州市国宇环保科技有限公司)硼氢化钠(Kermel天津市科密欧化学试剂有限公司)二水合柠檬酸三钠(杭州高晶精细化工有限公司)试剂纯度标准均为AR。

仪器：磁力搅拌器(杭州仪表电机公司)UV-Vis-NIR光谱仪(上海仪涛生物仪器有限公司)电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

过程：配置溶液：硝酸银0.5mg/ml二水合柠檬酸三钠0.498mg/ml硼氢化钠0.22mg/ml

实验使用的水，均为二次去离子水。硝酸银溶液置于棕色容量瓶中，防止因光照造成反应损失。

取一定量硝酸银与适量的柠檬酸钠(试过柠檬酸)，以水定容后移至100ml锥形瓶中。冰浴状态下于磁力搅拌机上进行搅拌5min同时滴加少量新鲜配置的硼氢化钠溶液。混合物溶液迅速由无色(可能有些棕色)转变成灰黑色溶液。抽取样品使用UV-Vis-NIR光谱仪检测纳米银粒子的共振吸收峰。当选定柠檬酸三钠和硼氢化钠的量为4.5ml、3ml。硝酸银溶液取5ml时银纳米粒子较小。银纳米粒子吸收峰最小，此时银的颗粒尺寸也比较小。

改变还原剂硼氢化钠滴加速度，银胶体的共振吸收峰也会改变，在一定程度内滴加越快，银胶体颗粒平均尺寸逐渐变小。反应温度也会影响银纳米粒子尺寸，温度较低时，银纳米粒子平均尺寸较小。

②紫外照射法

Ag^﹢+R-→Ag+R

R为还原性基团，可直接利用银盐的负离子作为还原剂，也可另加还原剂，该方法制备纳米银，各项工艺的条件都有影响，产量不稳定，易造成浪费。

试剂：硝酸银(常州市国宇环保科技有限公司)二水合柠檬酸三钠(杭州高晶精细化工有限公司)。

仪器：高压汞灯(上海季光特种照明电器厂)磁力搅拌器(杭州仪表电机公司)UV-Vis-NIR光谱仪(上海仪涛生物仪器有限公司)电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)

过程：硝酸银与稳定剂的配比与硼氢化钠法相同。首先混合硝酸银与柠檬酸三钠溶液，置于磁力搅拌器上进行搅拌，并与高压汞灯下照射，期间遮蔽环境光，减少干扰。混合液体的颜色由基本无色透明，渐变成浅褐色→棕色→黑色，表明可以反应终结。

2、贝壳粉生产

仪器：中药粉碎机(温岭市奥力中药机械公司)KQ-500E超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)烘箱(上海三发科学仪器公司)管式炉

选用贻贝粉，贻贝由于其表面含有角质层，通过处理反应去除角质层可以形成一定程度上的空洞或者凹陷。

取适量贻贝原料，大致清洗表面，洗去吸附的杂质，冲洗后，将贝壳敲打成碎片，浸泡于0.5mol/g氢氧化钠溶液中12小时。超声振荡处理10min，大致清洗贝壳表面附着的杂质。以清水冲洗3遍后放入60℃烘箱中干燥。选取适量贝壳碎片，分批少量放于中药粉碎机中粉碎，每一批约粉碎3min。粉碎完成后收集装袋留用。

将贝壳粉置于烧杯中，加入一定浓度的氢氧化钠溶液(浓度无严格要求)置于磁力搅拌器上，设定温度60℃，保持1h。反应完成后抽滤分离贝壳粉，并同时用去离子水清洗2遍。干燥留用。

处理目的：为使贝壳粉中的角质层反应，形成空洞，增大银能负载的面积，一方面也能让银更稳固地结合在贝壳粉上。

无氧煅烧Ar：使用管式炉，进行无氧煅烧，550℃1h冷却后收集装袋，煅烧后的贝壳粉呈灰黑色。

二次烧结：使用管式炉，将无氧煅烧的贝壳粉进行有氧烧结750℃1h，冷却后收集装袋，灼烧后的贝壳粉呈白色。

3、载银贝壳粉合成

制备纳米银有两种方案，载银贝壳粉在合成大方向上也有两种方案。

①液相还原银离子法

按照制备纳米银方案的浓度配制各种溶液。在锥形瓶中滴加4.5ml柠檬酸三钠溶液，与5.0ml硝酸银溶液，同时放入0.3g贝壳粉。将锥形瓶置于磁力搅拌器上进行搅拌，并且冰浴。搅拌时间约3分钟，目的是为使溶液能渗透贝壳粉，并混匀。逐滴滴加3ml硼氢化钠溶液，注意不能滴加过快，否则反应过快，银无法负载在贝壳粉的空隙，抗菌剂样品质量下降。

滴加完毕后在搅拌器上静置片刻，即可终止反应。取出混合悬液，高速离心，2000rpm离心5min(转速以及时间没有严格规定，能分离固液即可)弃去上清液，加入双蒸水洗涤，离心，洗涤操作2次，洗净残留的杂质。将产物置于60℃烘箱干燥。取出样品，于马弗炉中进行二次煅烧，第一次设定温度为550℃，时间1h，待冷却后，第二次煅烧温度为700℃，时间1h，冷却后取出装袋作为样品留用。

②光化学还原银离子法

溶液配制同上，作为反应的稳定剂，柠檬酸三钠可以用PVP代替。准备一个50ml容量的烧杯，在烧杯中加入5.0ml硝酸银溶液，同时放入4.5ml稳定剂，0.3g贝壳粉，置于磁力搅拌器上进行搅拌混匀。开启高压汞灯，正上方照射混合悬液，反应约1h(贝壳的种类不同，反应时间有些许差别)反应时遮光，同时注意汞灯发热，需要风扇散热。待悬液颜色不再变化时，终止反应，关闭高压汞灯。接下来的处理与液相化学还原法相同，煅烧后的样品装袋留用。

同时本发明贝壳粉的制备过程中对于贝壳粉二次煅烧的处理工艺也可在载银贝壳粉的合成后进行。即，最终合成产品分别的反应过程包括以下几种：

1)贝壳粉硼氢化钠法结合银之后二次煅烧

2)贝壳粉紫外照射法结合银之后二次煅烧

3)二次烧结的贝壳粉硼氢化钠法结合银

4)二次烧结的贝壳粉紫外照射法结合银

5)一次Ar烧结硼氢化钠法结合银后进行煅烧。

虽然通过以上合成路径最终均可以得到本发明合成产品，本发明最终选择的合成载银贝壳粉抗菌剂的最佳方法为二次烧结的贝壳粉硼氢化钠法结合银法，其主要原因具体见效果试验。

实施例1抑菌圈实验

指示菌种：大肠杆菌。

灭菌准备：镊子、牛津杯(内径6mm±0.2mm)、培养皿、双蒸水、氧化钙对照(AR天津博迪化工有限公司)。

需要仪器设备：生化培养箱(Hitachi日立株式会社)、超净台(Thermo Fisher Scientific)。

细菌准备：

取零下20摄氏度冻存的大肠杆菌菌种1:100稀释于液体培养基，220rpm 37℃摇床活化菌种12-14h。活化完成后将菌液保存于4℃冰箱中。待以后留用。

样品准备：每种样品取相同质量，置于EP管中，高温灭菌后，按照浓度配比滴加灭菌双蒸水，并且进行超声扩散处理，使固体颗粒更细致，更均匀地分布在悬液中。

制备培养基：

实验用LB固体培养基配方100ml：

酵母提取物：0.5g(BR杭州百思生物技术有限公司)

蛋白胨：1.0g(BR杭州百思生物技术有限公司)

NaCl：1.0g(AR上海试四赫维化工有限公司)

琼脂粉：1-1.2g(BR杭州百思生物技术有限公司)

PH控制在7.6±0.2

121℃高压灭菌20min。灭菌结束后于超净台中进行无菌操作。实验的细菌平板采用双层平板法。(即先使培养基凝固，再在培养基固体上涂布一层菌液。)

样品处理：根据需要浓度，于灭菌后的样品中加入一定量的dd水，超声分散处理，使悬浮颗粒均匀分散。(加水稀释过程需无菌操作)。

倒平板涂布：每份培养皿中均匀倒入25ml LB固体培养基，待培养基凝固后，在每皿培养基上滴加200μl菌液，再用无菌玻耙把菌液涂布均匀。静置一段时间，时间长短以菌液被吸收，培养基表面没有明显液体为准。

放置牛津杯：在每个培养基上放置4个牛津杯，间距均匀，且超过24mm，与培养皿边距超过15mm。放置时要一次性放准位置，尽量不要移动。

加入抗菌悬液：待牛津杯安置稳定后，在每个牛津杯中滴加200μl相应浓度的样品溶液。注意滴加时不要滴到牛津杯外面，滴加后不能移动牛津杯。

扩散及培养：小心移动培养皿，放于4℃冰箱中12h，扩散处理。再将培养皿统一放入37℃细菌培养箱中进行培养24小时。取出培养皿，使用游标卡尺，用十字交叉法测定抑菌圈的直径。

实验使用的抗菌剂稀释浓度一律为1％，抑菌圈大小数据(单位mm)。

样品编号：

1：Cao对照组

2：二次煅烧生贝粉对照组

3：贝壳粉硼氢化钠法结合银之后二次煅烧

4：贝壳粉紫外照射法结合银之后二次煅烧

5：二次烧结贝壳粉负载硼氢化钠法还原纳米银

6：二次烧结的贝壳粉负载紫外照射法还原纳米银

7：一次Ar烧结硼氢化钠法结合银后进行煅烧

实验结果：

表1抑菌圈实验

由统计数据得知：

在1％浓度下，硼氢化钠还原银离子结合纳米银的方法制作成的样品抗菌能力最强，根据国家卫生局相关文件，“抑菌圈直径大小在7mm以下的，则视为无抑菌效果，抑菌圈大于7mm的，表现出弱抑菌效果，而抑菌圈直径在10-20mm的，具有较强的抑制作用。

实施例2最小抑菌浓度测定

从实施例1实验结果来看，硼氢化钠还原法制成的抗菌样品抗菌能力最强，选用此类样品进行进一步的实验：

制备菌悬液：取以上实验活化过的大肠杆菌10μL，37℃摇床培育到对数生长期(约20分钟)。

配制培养基：

营养肉汤NB培养基配方如下：(100ml)

蛋白胨1.0g(BR杭州百思生物技术有限公司)

牛肉膏0.3g(BR上海生工生物工程有限公司)

NaCl 0.5g(AR上海试四赫维化工有限公司)

PH 7.2±0.2(25℃)

稀释样品抗菌剂：取13支灭菌试管，在第一管中加入1.6ml培养基。其余每管均加入1ml培养基，在第一管加入抗菌样品原液(1280μg/ml)0.4ml，混匀，吸取1ml至第二管，混匀后再吸取1ml至第三管，以此规律连续倍比稀释至第12管，并从第12管吸取1ml液体弃去。第13管作为空白对照。各管药物浓度依次为：256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。，

接种菌液：

在上述试管中，每一管加入20μl等量菌液，混匀。

培养：

塞好塞子之后，将试管置于37℃普通空气培养箱中进行培养。培养时间18小时。

18h过后，于培养箱中取出试管，观察细菌生长情况，试管中没有细菌生长的，样品浓度最低试管对应的浓度即为样品的最小抑菌浓度MIC。

实验结果如表2：

表2细菌生长数量(+表示生长，-表示没有生长)

从表2可知，样品的最小抑菌浓度在6--7管的浓度之间，范围(4--8μg/ml)。

实施例3抑菌率测定

使用固体培养基培养观察菌落比例的方法，按照LB培养基的配制方法配制培养基，灭菌后，每个培养皿均匀倒25ml培养基，待冷却后，滴加100μl菌液，用无菌耙铺平菌液，然后滴加100μl样本溶液，铺平，重复3次，将培养基置于37℃培养箱培养24h，观察菌落数，计算抑菌率。

抑菌率＝(空白对照菌落数-加抗菌样品菌落数)/空白对照组菌落数。

实验结果如表3：

表3抑菌率

实验测量后再将培养基放于37℃培养箱，于36h，48h，60h时分别再次取出观察细菌生长情况，观察到48h后加了抗菌剂的培养基菌落仍然可数，60h后菌落数渐渐增多，之后逐渐同无抗菌剂组类似。

实施例4表征实验

抗菌剂样品制备完成后需要对样品进行表征实验，从而确定样品的一些特殊性质。

1)扫描电子显微镜观测形貌

取少许(微量)样品置于EP管中，加入2ml无水乙醇，超声分散约20分钟，使微量样品分散，取少量样品滴于硅片上，待干燥后，送至扫描电子显微镜，拍摄形貌图片。

如图1和图2对比所示，可清楚地发现，经过灼烧处理，贝壳粉颗粒表面生产了绒毛状的不规则凹凸，利于附着纳米银颗粒，而且可以在一定程度上能够让纳米银缓慢释放出来。

如图3和图4对比所示，紫外照射反应过程中，银离子还原成银单质，并吸附在煅烧贝壳粉的缝隙中。