一种高稳定性的茶树油纳米脂质体抗菌剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于抗菌剂及药物制剂或者化妆品领域，具体涉及一种高稳定性的茶树油 纳米脂质体抗菌剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 茶树油，系唇形科茶树油属植物，常绿灌木，因含有大量天然抗氧化成分而备受人 们关注，其中茶树油茎和叶提取得到的挥发油具有很好的抗菌消炎功效；茶树油无色或淡 黄色，主要化学成分为桉叶油素、樟脑、龙脑、α -蒎烯、莰烯、乙酸龙脑酯、马鞭草烯酮等，茶 树油全草可入药，有健胃发汗功效，精油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、霍乱弧菌等有较好 的抗菌作用，茶树油作为香辛料可广泛地应用于食品工业，而且经研究表明茶树油还是一 种高效理想的抗氧化剂。
[0003] 国内有很多关于茶树油在食品、保健品、医药的专利申请；CN103788494A公开了 一种果蔬保鲜薄膜及其制备方法，添加茶树油作为活性成分抑制微生物繁殖及起到抗氧 化作用；CN104365822A公开了一种用茶树油保鲜南方葡萄的方法；CN103316158A发明提 供了一种包括茶树油的复方精油以达到减肥瘦身效果；CN101506106公开了一种含草药 成分的饮用水的配方及方法，配方包括茶树油以稳定成分，从而延长保存期；CN101402864 公开了属于高活性抗氧化产品制备技术领域的一种从茶树油中制备抗氧化产品的方法； CN103031210A公开了一种可兼制茶树油的茶树油脱水方法，最大化利用茶树油之良好经 济效果；CN102899170A公开了一种采用亚临界流体技术萃取茶树油的方法，适合工业化推 广。
[0004] 虽然茶树油在医学，食品和化妆品行业被广泛应用，具有较好的杀菌、增香等特 点，但是茶树油易挥发，暴露在空气中不稳定，所以要寻找有效地方法降低茶树油在使用过 程中的挥发程度，延长保存期。
[0005] 纳米脂质体能将茶树油包裹在内，并且纳米脂质体不会对茶树油的主要活性成分 造成破坏；纳米脂质体使茶树油中的活性成分与外界环境隔绝开来，可以降低茶树油挥发 性，延长保存期，但由于脂质体的缓释作用，包裹精油的脂质体保质期受限，所以，选用壳聚 糖和明胶制成稳定性高的多层脂质体，此外，纳米脂质体由于它们的亚细胞尺寸，能加强脂 质体的被动吸收机制，减少物质运输阻力，从而增强精油的抗菌等效果。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是公开一种高稳定的茶树油纳米脂质体及其制备方法，通过将茶树 油包裹在多层纳米脂质体中，以实现减少茶树油在使用过程中的挥发，从而减少茶树油的 浪费，达到长效抗菌与高效利用的目的。
[0007] -种高稳定性的茶树油纳米脂质体，茶树油包裹在磷脂双分子层中，其特征在于： 磷脂双分子层为第一层纳米脂质体，还设有第二层纳米脂质体，第二层由壳聚糖组成。
[0008] 进一步地，所述的一种高稳定性的茶树油纳米脂质体，其特征在于：还设有第三层 纳米脂质体，第三层由明胶组成。
[0009] 进一步地，第二层纳米脂质体中壳聚糖的浓度为0· 2 mg/mL。
[0010] 进一步地，第三层纳米脂质体中明胶的浓度为0. 4 mg/mL。
[0011] 本发明由茶树油，大豆卵磷脂，胆固醇和表面活性剂，壳聚糖和明胶制成茶树油纳 米脂质体。
[0012] 大豆卵磷脂、胆固醇是构成脂质体的组要成分，胆固醇均有调节膜流动性的作用， 所以考察其两者的配比变化，对构成的脂质体分散性等参数有无影响；表面活性剂是增加 脂质体稳定性；茶树油浓度是根据包封率来确定的；醋酸盐溶液的pH是为了最佳溶解壳聚 糖；壳聚糖和明胶可以增加稳定性。
[0013] 本发明的制备方法是将茶树油，大豆卵磷脂，胆固醇混合于有机溶剂，减压蒸干形 成光滑的薄膜，加入水相介质和表面活性剂组成的混合溶液溶解薄膜并超声成乳、离心后 取上层液体过滤得到单层茶树油纳米脂质体，其特征在于：将单层茶树油纳米脂质体与壳 聚糖溶液搅拌均匀，通过离心和微孔滤膜过滤，得到粒径为纳米级的双层茶树油纳米脂质 体。
[0014] 进一步地，将双层茶树油纳米脂质体与明胶溶液搅拌均匀，通过离心和微孔滤膜 过滤，得到粒径为纳米级的多层茶树油纳米脂质体。
[0015] 进一步地，本发明的大豆卵磷脂和胆固醇的质量比例为5:1 ;表面活性剂、茶树油 与胆固醇的质量比为：1:4:4,此条件下可以得到最高的包封率。
[0016] 进一步地，表面活性剂为PVP，混合溶液中PVP的浓度为1. 0 mg/mL。
[0017] 单层茶树油纳米脂质体与壳聚糖溶液的体积比为1:10 ;双层茶树油纳米脂质体 与明胶溶液的体积比为1:10。
[0018] 本发明中所述的有机溶剂是氯仿。
[0019] 本发明中所用的水相介质是根据中国药典2000版标准配制的醋酸盐缓冲溶液， pH 值 3. 5~4· 0。
[0020] 所述的壳聚糖溶液为壳聚糖的醋酸盐溶液，浓度为0.2 mg/mL，醋酸盐溶液是根 据中国药典2000版标准配制的醋酸盐缓冲溶液，pH值3. 5~4. 0,优选3. 6,能够最佳溶解壳 聚糖。
[0021] 所述明胶溶液为明胶的醋酸盐溶液，浓度为0. 4 mg/mL，醋酸盐溶液是根据中国药 典2000版标准配制的醋酸盐缓冲溶液，pH值3. 5~4. 0。
[0022] 本发明中脂质体的第一层是磷脂双分子层，即人工细胞膜层。
[0023] 本发明中脂质体的第二层由壳聚糖组成，浓度为0. 2 mg/mL。
[0024] 本发明中脂质体的第三层由明胶组成，浓度为0.4 mg/mL。
【附图说明】
[0025] 图1为茶树油纳米脂质体的包封率。
[0026] 图2为茶树油纳米脂质体的粒径与多分散系数roi。
[0027] 图3为多层茶树油纳米脂质体荧光显微图。
[0028] 图4为多层茶树油纳米脂质体原子力显微图。
[0029] 图5多层茶树油纳米脂质体对大肠杆菌的抗菌性能。
[0030] 图6多层茶树油纳米脂质体对金黄色葡萄球菌的抗菌性能。
[0031] 表1为茶树油纳米脂质体的Zeta电位。
【具体实施方式】
[0032] 通过下面实例说明本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护内容，不仅局限于此 实施例1多层茶树油纳米脂质体的包封率 1实验材料 大豆卵磷脂；BR ;国药集团化学试剂有限公司。
[0033] 胆固醇；AR ;国药集团化学试剂有限公司。
[0034] 三氯甲烷；AR ;国药集团化学试剂有限公司。
[0035] 茶树油；AR ;法国florihana精油。
[0036] PVP ;GR ;国药集团化学试剂有限公司。
[0037] 壳聚糖；BR ;国药集团化学试剂有限公司。
[0038] 明胶；BR ;国药集团化学试剂有限公司。
[0039] 2实验方法 1)单层茶树油纳米脂质体的制备 ①称取1 g大豆卵磷脂，0. 2 g胆固醇和200mg的茶树油，加50 mL氯仿使其溶解。
[0040] ②在旋转蒸发仪中蒸发至溶剂蒸干，蒸发温度为10~30 °C，圆底烧瓶内壁会形 成光滑的薄膜；然后将所得产品放入真空干燥箱中，30 °C，真空状态下干燥24小时。
[0041] ③称取0. 05 g的PVP于50mL醋酸盐缓冲液中，超声波条件下扩散，然后将PVP 的醋酸盐缓冲液加入圆底烧瓶中超声波条件下进行水化。
[0042] ④将水化后的混合液于细胞超微粉碎仪中以工作10 S，间隙5 S的频率粉碎 30 min来进一步使脂质体乳状液粒径更均勾细小一些。
[0043] ⑤将所得产品进行离心，4000 rpm，15min，取上层液体。
[0044] ⑥将所得液体用0. 22 μ m滤膜进行过滤，得滤液，为单层茶树油纳米脂质体。
[0045] 2)双层茶树油纳米脂质体的制备 ①按照上述单层茶树油纳米脂质体的制备方法，制备含200 mg茶树油的单层纳米脂 质体。
[0046] ②将单层茶树油脂质体分散在含0. 2 mg/mL壳聚糖的醋酸盐溶液中混合均匀； 单层茶树油纳米脂质体与壳聚糖的醋酸盐溶液的体积比1 :1〇。
[0047] ③将所得混合液于细胞超微粉碎仪中以工作10 s，间隙5 s的频率粉碎30 min〇
[0048] ④将所得产品进行离心，4000 rpm，15min，取上层液体； ⑤将所得液体用〇. 22 μ m滤膜进行过滤，得滤液，为双层茶树油纳米脂质体。
[0049] 3)多层茶树油纳米脂质体的制备 ①按照上述双层茶树油纳米脂质体的制备方法，制备含200mg茶树油的双层纳米脂 质体。
[0050] ②将双层茶树油纳米脂质体分散在含0. 4 mg/mL明胶的醋酸盐溶液中使其混合 均匀；双层茶树油纳米脂质体与明胶的醋酸盐溶液的体积比为1 :1〇。
[0051] ③将所得混合液于细胞超微粉碎仪中以工作10 s，间隙5 s的频率粉碎30 min ； ④ 将所得产品进行离心，4000 rpm，15min，取上层液体； ⑤ 将所得液体用〇. 22 μ m滤膜进行过滤，得滤液，为多层茶树油纳米脂质体。
[0052] 4)包封率的测定 用无水乙醇稀释茶树油，逐级稀释成浓度分别为0. l、〇. 2、0. 4、0. 6、0. 8 mg/mL的标准 溶液。然后，分别吸取1 yL标准溶液进行GC-MS分析，对其主要成分1，8-桉叶素的谱峰 面积进行自动积分，绘制1，8-桉叶素峰面积-茶树油浓度标准曲线。首先取lmL茶树油纳 米脂质体样品，13500 rpm，离心3 h，倒掉上清液。接着加入1 mL乙醇破乳剂，超声3 h，最 后以10000 rpm的转速离心15 min，取上清液，用于GC-MS分析；制备好的脂质体样品，对 精油主成分的峰面进行自动积分，再根据步骤1中绘制的标准曲线，计算出脂质体中植物 精油的含量，则：
[0053] 3茶树油纳米脂质体的包封率 包封率是评价脂质体制剂质量好坏的最重要的指标，也是脂质体能否发挥较普通制剂 高效、低毒等特点的关键；由图1可看出，单层茶树油纳米脂质体的包封率为20. 7%，双层茶 树油纳米脂质体的包封率为37. 3%，多