层茶树油纳米脂质体的包封率最大，为78. 9%。因此 制备多层茶树油纳米脂质体可以明显提高脂质体的包封率。
[0054] 实施例2多层茶树油纳米脂质体的粒径与多分散系数roi 1实验材料 ①单层茶树油纳米脂质体。
[0055] ②双层茶树油纳米脂质体。
[0056] ③多层茶树油纳米脂质体。
[0057] 2实验方法 用美国布鲁克海文仪器公司产的，型号为BI-9000的高浓度激光粒度仪测定茶树油纳 米脂质体的粒径和多分散系数PDI值，所测样品放入样品池直接测量即可。
[0058] 3茶树油纳米脂质体的粒径与多分散系数roi 多分散系数PDI直接反映茶树油纳米脂质体的稳定性，因此是主要参考指标，脂质体 的PDI在0~0. 3范围内属于最好，在0. 3~0. 7范围内较差，但可以接受，当roi>0. 8时，不予 考虑。如图2所示，单层茶树油纳米脂质体的粒径为176. 4nm、PDI为0. 353,双层茶树油纳 米脂质体的粒径为243. 5nm、PDI为0· 307,多层茶树油纳米脂质体的粒径为294. 8nm、PDI 为0. 214。多层茶树油纳米脂质体的多分散系数PDI最小，因此制备多层茶树油纳米脂质体 可以明显提尚脂质体的稳定性。
[0059] 实施例3茶树油纳米脂质体的Zeta电位 1实验材料 ①单层茶树油纳米脂质体。
[0060] ②双层茶树油纳米脂质体。
[0061] ③多层茶树油纳米脂质体。
[0062] 2实验方法 用英国马尔文仪器有限公司生产的型号为Zetasirer nano ZSZeta的电位仪测量，直 接将待测脂质体样品放入电位仪中测量即可。
[0063] 3茶树油纳米脂质体的Zeta电位 表1茶树油纳米脂质体的Zeta电位
Zeta电位也可以直接反映茶树油纳米脂质体的稳定性，因此也是主要参考指标，脂质 体的Zeta电位的绝对值越大说明脂质体越稳定性，Zeta电位的绝对值在0~30范围内属于 不稳定，在大于30时脂质体较稳定性。如表1所示，三种茶树油纳米脂质体均带负电，单层 茶树油纳米脂质体的Zeta电位为-23. 7mV，其绝对值小于30脂质体不稳定，双层茶树油纳 米脂质体的Zeta电位为-32. lmV，其绝对值大于30脂质体较稳定，多层茶树油纳米脂质体 的Zeta电位为-44. 2mV，其绝对值最大，脂质体最稳定。
[0064] 实施例4多层茶树油纳米脂质体的荧光显微镜观察 1实验材料 多层茶树油纳米脂质体。
[0065] 2实验方法 用德国徕卡仪器公司生产的型号为TCS-SP5的荧光显微镜，直接将待测脂质体样品放 入荧光显微镜中观察。
[0066] 荧光显微镜样品前处理方法： (1)多层茶树油纳米脂质体样品的制备（A液）：取1 mL茶树油脂质体，0. 5 mL甲醇和 0. 5 mL氯仿混合。
[0067] (2)荧光染料DIL的制备（B液）：0. 1 mL的DIL溶于0. 1 mL的二氯甲烷中。
[0068] (3)取A液0· 5 mL和B液50 μ L放入小离心管混合，震荡均匀。
[0069] (4)将上述混合液体放入真空干燥箱，干燥一夜。
[0070] (5)取已干燥的离心管，加入0· 5mL超纯水，在振荡器上震荡30min。
[0071] (6)室温放置3h。
[0072] (7)滴在载玻片上进行观察。
[0073] 3多层茶树油纳米脂质体的荧光显微镜观察 由以上荧光显微镜拍摄到的显微照片可以看出，脂质体染色后，呈现圆形，分散较均 匀。
[0074] 实施例5多层茶树油纳米脂质体的原子力显微镜观察 1实验材料 多层茶树油纳米脂质体。
[0075] 2实验方法 用美国安捷伦科技公司生产的型号为Agilent5500的原子力显微镜，直接将待测脂质 体样品放入原子力显微镜中观察。原子力前处理方法是取植物精油脂质体样品10 yL滴 在云母片上10 min。然后用移液枪吸除表面的液体，再滴上10 μ L超纯水30 S，重复清洗 3次，通风处静置3 h，放置于原子力显微镜下观察。
[0076] 3多层茶树油纳米脂质体的原子力显微镜观察 由以上原子力显微镜拍摄到的显微照片可以看出，脂质体呈现圆形，分散较均匀。
[0077] 实施例6多层茶树油纳米脂质体的抗菌性能 1实验材料 ①单层茶树油纳米脂质体(保存7天、30天、60天、90天)。
[0078] ②双层茶树油纳米脂质体(保存7天、30天、60天、90天)。
[0079] ③多层茶树油纳米脂质体(保存7天、30天、60天、90天)。
[0080] 2实验方法 采用平板菌落计数法，以大肠杆菌（fecAericAia coJi)和金黄色葡萄球菌 ayrei/6·)为模式菌测定茶树油纳米脂质体的残存菌数，将大肠杆菌和金 黄色葡萄球菌接种到液体培养基中，分别置于气浴摇床中在37°C、150rpm条件下震荡培 养24~48h，获得对数生长期的细菌，取适量处于对数期的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别 加入含有一定量无菌磷酸缓冲液的试管中（菌浓度约为l〇5~l〇6cfu/mL)，然后再向试管中 加入浓度为10%的各种茶树油纳米脂质体，同时另取两个分别含有以上两种菌的试管并向 其中加入等量无菌水（不加茶树油纳米脂质体）作为对照，将各试管均置于气浴摇床中在 37°C、150rpm条件下震荡反应24h，分别于不同时间点的取适量培养液进行十倍梯度稀释 到合适的浓度，然后移取100 μ L稀释液滴到无菌固体平板培养基上，涂布均匀，之后放入 37°C恒温恒湿培养箱中倒置培养，24~48h后进行平板菌落计数，从而对评价各茶树油纳米 脂质体的抗菌活性，做三次重复，结果取平均值。
[0081] 3多层茶树油纳米脂质体的抗菌性能 不同保存期的茶树油纳米脂质体的抗菌活性的变化也可以间接反映脂质体的稳定性， 因此对保存7天、30天、60天、90天的各种茶树油纳米脂质体进行了抗菌性能评价，结果如 图5、图6所示；保存时间为7天时，单层茶树油纳米脂质体、双层茶树油纳米脂质体、多层 茶树油纳米脂质体的抗菌活性均相同，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均显示了良好的抗菌 效果；保存时间为30天时，单层茶树油纳米脂质体的抗菌效果明显降低、而双层茶树油纳 米脂质体和多层茶树油纳米脂质体均显示良好的抗菌效果；保存时间为60天和90天时，单 层茶树油纳米脂质体没有显示抗菌效果，双层茶树油纳米脂质体的抗菌效果明显降低，而 多层茶树油纳米脂质体一直保持良好的抗菌效果。
【主权项】
1. 一种高稳定性的茶树油纳米脂质体抗菌剂，茶树油包裹在磷脂双分子层中，其特征 在于：磷脂双分子层为第一层纳米脂质体，还设有第二层纳米脂质体，第二层由壳聚糖组 成，以提高包封率、稳定性和抗菌性能。2. 如权利要求1所述的一种高稳定性的茶树油纳米脂质体抗菌剂，其特征在于：还设 有第三层纳米脂质体，第三层由明胶组成，进一步提高包封率、稳定性和抗菌性能。3. 如权利要求1所述的一种高稳定性的茶树油纳米脂质体抗菌剂，其特征在于：第二 层纳米脂质体中壳聚糖的浓度为0.2mg/mL。4. 如权利要求2所述的一种高稳定性的茶树油纳米脂质体抗菌剂，其特征在于：第三 层纳米脂质体中明胶的浓度为0.4mg/mL。5. 如权利要求1所述的一种高稳定性的茶树油纳米脂质体抗菌剂的制备方法，是将茶 树油，大豆卵磷脂，胆固醇混合于有机溶剂，减压蒸干形成光滑的薄膜，加入水相介质和表 面活性剂组成的混合溶液溶解薄膜并超声成乳、离心后取上层液体过滤得到单层茶树油纳 米脂质体，其特征在于：将单层茶树油纳米脂质体与壳聚糖溶液搅拌均匀，通过离心和微孔 滤膜过滤，得到粒径为纳米级的双层茶树油纳米脂质体。6. 如权利要求5所述的一种高稳定性的茶树油纳米脂质体抗菌剂的制备方法，其特 征在于：进一步地，将双层茶树油纳米脂质体与明胶溶液搅拌均匀，通过离心和微孔滤膜过 滤，得到粒径为纳米级的多层茶树油纳米脂质体。7. 如权利要求5所述的一种高稳定性的茶树油纳米脂质体抗菌剂的制备方法，其特征 在于：大豆卵磷脂和胆固醇的质量比例为5:1 ;表面活性剂、茶树油与胆固醇的质量比为： 1:4:4,此条件下可以得到最高的包封率；所述的有机溶剂是氯仿。8. 如权利要求5所述的一种高稳定性的茶树油纳米脂质体抗菌剂的制备方法，其特征 在于：表面活性剂为PVP，混合溶液中PVP的浓度为1. 0mg/mL;所用的水相介质是根据中国 药典2000版标准配制的醋酸盐缓冲溶液，pH值3. 5~4. 0。9. 如权利要求5所述的一种高稳定性的茶树油纳米脂质体抗菌剂的制备方法，其特征 在于：单层茶树油纳米脂质体与壳聚糖溶液的体积比为1:10 ;所述的壳聚糖溶液为壳聚糖 的醋酸盐溶液，浓度为0. 2mg/mL，醋酸盐溶液是根据中国药典2000版标准配制的醋酸盐 缓冲溶液，pH值3. 5~4. 0,优选3. 6,能够最佳溶解壳聚糖。10. 如权利要求6所述的一种高稳定性的茶树油纳米脂质体抗菌剂的制备方法，其特 征在于：双层茶树油纳米脂质体与明胶溶液的体积比为1:10 ;所述明胶溶液为明胶的醋酸 盐溶液，浓度为〇. 4mg/mL，醋酸盐溶液是根据中国药典2000版标准配制的醋酸盐缓冲溶 液，pH值 3.5~4.0。
【专利摘要】本发明属于抗菌剂及药物制剂或者化妆品领域，具体涉及一种高稳定性的茶树油纳米脂质体抗菌剂及其制备方法。本发明由茶树油，大豆卵磷脂，胆固醇，表面活性剂，壳聚糖，明胶制成多层茶树油纳米脂质体。其方法是将茶树油，大豆卵磷脂，胆固醇混合于有机溶剂，减压蒸干形成光滑的薄膜，加入水相介质和表面活性剂溶解膜状物并超声成乳，再分别与壳聚糖，明胶溶液搅拌均质均匀，通过离心和微孔滤膜过滤，得到粒径为纳米级的脂质体。本发明制备工艺重现性好，茶树油多层纳米脂质体包封率最高可达78.9%，且产品形态完整，粒径均一，具有良好的稳定性与抗菌性。
【IPC分类】A01N65/28, A61P31/04, A01N25/28, A01P1/00, A61K9/127, A61K36/61
【公开号】CN105287379
【申请号】CN201510485134
【发明人】崔海英, 李伟
【申请人】江苏大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年8月10日