一种基于磁性可回收纳米抗菌剂的胶原净化及防腐方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于磁性可回收纳米抗菌剂的胶原净化及防腐方法，属于生物质材料领域。
【背景技术】
[0002]胶原蛋白是动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25%?30%，与组织的形成、成熟、细胞间信息的传递，以及关节润滑、伤口愈合、钙化作用、血液凝固和衰老等有着密切的关系。目前，胶原蛋白凭借其低免疫原性、生物相容性、有利于细胞贴附和迀移、可降解及凝血性等优异性能已成为生物科技产业最关键的原材料之一，在生物医学、化妆品、食品工业等领域均有着广泛应用。
[0003]然而，受自身结构因素的影响，天然胶原蛋白极易受到细菌、霉菌等微生物侵蚀。微生物在生长繁殖的过程中，会酶解胶原蛋白产生杂质，降低胶原蛋白制品品质，使胶原蛋白失去活性。除此之外，微生物的不断增殖和代谢极易导致胶原制品中微生物内毒素含量增加。因此，基于胶原蛋白质的制品，尤其是应用于生物医药领域的胶原蛋白制品在制备期间必须作杀菌、防腐处理。
[0004]将小分子抗菌剂(如氯仿、苯甲酸钠、山梨酸钾等)添加至胶原溶液中是目前最常用、最有效的胶原蛋白净化防腐方法。然而，这些小分子抗菌剂或多或少存在生理毒性，一旦被添加至胶原溶液中，将无法从胶原溶液中彻底分离、回收，一部分有毒的小分子抗菌剂将永久存在于胶原溶液中，影响胶原蛋白自身优异的生物相容性。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种基于磁性可回收纳米抗菌剂的胶原净化及防腐方法，其特征在于该方法的工艺步骤和条件如下(其中所述物料的份数均为重量份数):
(I)磁性可回收纳米抗菌剂的制备:
(1.1)表面含双键的磁性纳米颗粒的制备:将1-10份磁性纳米颗粒分散于150-200份乙醇体积分数为90%的水溶液中，然后滴加2-8份硅烷偶联剂，并于室温下搅拌20-50分钟；然后滴加4-16份引发剂，同时升温至40-60°C反应4-8小时，获得的产物用磁铁进行分离并用无水乙醇反复洗涤，烘干至恒重后即得表面含双键的磁性纳米颗粒；
(1.2)氟喹诺酮乙烯基化:将氟喹诺酮10-20份、催化剂4-8份与溶剂300-500份混合均匀，于0-5°C搅拌30-60分钟，随后在持续搅拌和惰性气体保护下滴加乙烯基化试剂4-8份，滴加完毕后升温至20-35°C反应1-2.5小时；反应完毕后，将以上混合物倒入沉淀剂中，产物经反复水洗、烘干即得乙烯基化氟喹诺酮；
(1.3)磁性可回收纳米抗菌剂的制备:将5-10份表面含双键的磁性纳米颗粒分散于300-500份溶剂中，在持续搅拌和惰性气体保护下加入0.7-1.2份引发剂，在20-40°C下搅拌10-30分钟后滴加4-8份乙烯基化氟喹诺酮和30-40份丙烯酸，滴加完毕后升温至40-80°C反应20-30小时，反应结束后，产物用磁铁分离并用浓度为0.05-lmol/L的碱水溶液反复洗涤，烘干至恒重，得到磁性可回收纳米抗菌剂；
(2)胶原的净化及防腐处理:以无菌操作在100份浓度小于或等于lmg/mL的胶原溶液中加入0.3-3份以上制得的磁性可回收纳米抗菌剂，并在室温条件下搅拌1-3小时，然后用磁铁将抗菌剂吸附、分离、回收，最后以无菌操作将净化后的胶原溶液密封并保存。
[0006]以上方法中步骤(1.1)所述磁性纳米颗粒为粒径为10_50nm的Fe3Ozp γ-Fe2O3中一种或多种。
[0007]以上方法中步骤(1.1)所述硅烷偶联剂为甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三(β_甲氧基乙氧基)硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷中的一种或多种。
[0008]以上方法中步骤(1.1)所述引发剂为盐酸、冰乙酸、硝酸、磷酸、氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾中的一种或多种。
[0009]以上方法中步骤(1.2)所述氟喹诺酮为诺氟沙星、沙氟沙星、环丙沙星、罗氟哌酸、加替沙星、依诺沙星、司氟沙星中的一种或多种。
[0010]以上方法中步骤(1.2)所述催化剂为A1C13、BF3、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、吡啶、三乙胺、4-吡咯烷基吡啶和4- 二甲氨基吡啶中的一种或多种。
[0011]以上方法中步骤(1.2)所述沉淀剂为正己烷、环己烷、环戊烷中的一种或多种。
[0012]以上方法中步骤(1.2)所述溶剂为二氯甲烷、二氯乙烷、四氢呋喃、W I 二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺中的一种或多种。
[0013]以上方法中步骤(1.2)所述乙烯基化试剂为丙烯酰氯、丙烯酰溴、4-戊烯酰氯、己-5-烯酰氯中的一种或多种。
[0014]以上方法中步骤(1.3)所述溶剂为甲醇、乙醇、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、W I 二甲基甲酰胺、W I 二甲基乙酰胺、二甲亚砜中的一种或多种。
[0015]以上方法中步骤(1.3)所述引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、偶氮二环己腈、过氧化环己酮、过氧化二苯甲酰、过氧化苯甲酸特丁酯、叔丁基过氧化氢中的一种或多种。
[0016]以上方法中步骤(1.3)所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾中的一种或多种。
[0017]本发明与现有技术相比，具有以下积极效果:
1、氟喹诺酮抗菌剂自身抗菌谱广、抗菌活性强。其7位哌嗪环上的胺基基团是氟喹诺酮抗菌剂非药效活性位点，该基团与丙稀酰氯、丙稀酰溴、4-戊稀酰氯、己-5-稀酰氯间酰化反应具有高度专一性，对氟喹诺酮抗菌剂基本母核结构域及各增效取代基并无影响，因此在对氟喹诺酮乙烯基化后，并不会影响氟喹诺酮抗菌剂自身生物活性；这些乙烯基化氟喹诺酮被固定于磁性纳米颗粒表面后，所获得的磁性可回收纳米抗菌剂仍然抗菌谱广、抗菌效率高。
[0018]2、氟喹诺酮抗菌剂的疏水性较强，在水中的溶解度较小；另一方面，磁性纳米Fe3Ozp γ-Fe2O3颗粒在水中又容易沉淀。本发明采用丙稀酸与乙稀基化氟喹诺酮共聚，在磁性纳米颗粒表面形成抗菌壳层，由于表面含有大量丙烯酸(含亲水羧基)，制备的磁性可回收纳米抗菌剂在胶原水溶液中可以很好地分散，保证了杀菌作用范围的全面性和彻底性。
[0019]3、本发明将氟喹诺酮抗菌剂共价固定于磁性纳米颗粒表面，在防腐处理过程中，抗菌剂分子不会从纳米颗粒表面脱落、释放出来，在防腐处理完毕后，这些磁性纳米抗菌剂在磁场作用下可彻底地从胶原溶液中分离、回收，抗菌剂分子不会残留于胶原溶液中，不会影响胶原蛋白自身结构及其优异的生物相容性。
【附图说明】
[0020]图1为本发明所涉及的磁性可回收纳米抗菌剂的合成路线。
[0021]图2为本发明所涉及的磁性可回收纳米抗菌剂用于胶原溶液净化及防腐处理效果图。
【具体实施方式】
[0022]下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
[0023]实施例1:
(1)制备表面含双键的磁性纳米颗粒:将0.6份粒径为1nm的纳米Fe3O4和0.4份粒径为50nm的γ -Fe2O3分散于150份乙醇体积分数为90%的水溶液中，然后滴加2份乙烯基三甲氧基硅烷，并于室温下搅拌20分钟；然后滴加4份冰乙酸，同时升温至40°C反应4小时，获得的产物用磁铁进行分离并用无水乙醇反复水洗，烘干至恒重后即得表面含双键的磁性纳米颗粒；
(2)制备乙烯基化环丙沙星:将环丙沙星10份、吡啶4份和二氯甲烷300份混合均匀，于(TC搅拌30分钟，随后在持续搅拌和惰性气体保护下滴加丙烯酰氯4份，滴加完毕后升温至20°C反应I小时；反应完毕后，将以上混合物倒入环己烷中，沉淀经反复水洗、烘干即得乙烯基化环丙沙星；
(3)合成磁性可回收纳米抗菌剂:将5份以上制得的表面含双键的磁性纳米颗粒分散于300份二甲亚砜中，在持续搅拌和惰性气体保护下加入0.7份偶氮二异庚腈，在40°C下搅拌10分钟后滴加4份乙烯基化环丙沙星和30份丙烯酸，滴加完毕后升温至80°C反应20小时，反应结束用磁铁分离并用lmol/L碳酸钾溶液反复洗涤，烘干至恒重，得到磁性可回收纳米抗菌剂；
(4)以无菌操作在100份浓度为0.8mg/mL的胶原溶液中加入0.3份以上制得的磁性可回收纳米抗菌剂，并在室温条件下搅拌I小时，然后用磁铁将抗菌剂吸附回收，使胶原溶液与之分离，最后以无菌操作将分离出来的胶原溶液密封并保存。
[0024]采用以上方法对胶原溶液进行处理后，通过平板计数法测定磁性可回收纳米抗菌剂的杀菌率为100% ;对净化后的胶原进行光电子能谱分析，净化后的胶原中无任何纳米抗菌剂残留；对净化后胶原的红外光谱和圆二色谱结果进行分析后发现，以上处理方法并没有破坏胶原蛋白的三股螺旋结构。
[0025]实施例2:
(I)制备表面含双键的磁性纳米颗粒:将3份粒径为20nm的纳米Fe3O4分散于170份乙醇体积分数为90%的水溶液中，然后滴加6份甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷，并于室温下搅拌30分钟；然后滴加4份氨水和4份碳酸钠，同时升温至50°C反应5小时，获得的产物用磁铁进行分离并用无水乙醇反复水洗，烘干至恒重后即得表面含双键的磁性纳米Fe3O4;
(2)制备乙烯基化诺氟沙星:将诺氟沙星13份、三乙胺5份和二氯甲烷400份混合均匀，于2°C搅拌40分钟，随后在持续搅拌和惰性气体保护下滴加丙烯酰氯5份，滴加完毕后升温至25°C反应1.5小时；反应完毕后，将以上混合物倒入环戊烷中，沉淀经反复水洗、烘干即得乙烯基化诺氟沙星；
(3)合成磁性可回收纳米抗菌剂:将6份表面含双键