一种高成活率的转基因棉花再生株移栽法的制作方法

本发明涉及转基因棉花技术领域，具体涉及一种高成活率的转基因棉花再生株移栽法。

背景技术：

传统的棉花农杆菌介导转化研究使用下胚轴为外植体，其转化和再生经历体细胞胚胎发生途径，再生植株的高频转化再生体系等。受转化周期长、成胚率低、易出现畸形胚、体细胞胚植株再生比例低和缺乏茎的伸长等多因素的限制，获得转基因再生株的整个过程相对较长。一般从农杆菌共培养开始，到获得完整再生幼苗需8～12个月。在此基础上，通过分子检测证实目的基因已经成功导入受体的转基因再生苗就更为珍贵。尽管如此，转基因再生苗只有移栽成活才能真正实现进入常规遗传育种应用。因此，提高转基因再生株的移植成活率一直是棉花转基因领域非常重要的研究环节。目前，转基因棉花再生株的移植主要采用常规移栽法和嫁接法。

李燕娥等(2010)报道了转基因棉花再生株的常规移栽法，其主要程序包括：转基因再生株生根苗打开瓶盖→培养间炼苗1-2天→洗去再生株根部培养基→栽入装有灭菌的土壤或砂土中→一次性浇透水→放入湿度70％、温度27℃～29℃培养箱中先整株盖株培养8～10天，然后移去盖株的容器，再在培养箱中培养5～7天左右→移入温室或网室中至棉花吐絮成熟(李燕娥,上官小霞,吴霞等.一种转基因棉花再生株移植法.专利公告号CN 101773039A)。

陈天子等(2013)也报道了转基因棉花再生幼苗简易移栽方法。其主要程序包括：将有健壮根系的再生幼苗，直接移栽到商品化的有机栽培基质，移栽后保湿14d左右再缓慢透气7d左右、温度控制在25～30℃相对稳定的温度范围内，转基因棉花再生幼苗移栽成活(陈天子，秦郁，张保龙.转基因棉花再生幼苗简易移栽方法.江苏农业科学，2013,41(11):87-89)。

王清连等(1999)报道的转基因棉花再生株嫁接法，其主要程序包括：在温室或网室把转基因棉花再生株嫁接在盆钵内种植的(棉花)砧木上，然后用塑料薄膜(或特殊容器)包裹整株棉花苗，7天后逐步放风，最后取掉包裹的塑料薄膜或容器(王清连,张宝红,刘方。一种适用于再生植株和转基因移栽的新方法。河南职技师院学报，1999，27(3):27～29)。

由于经过组织培养再生体系获得的转基因棉花再生株长势较弱，根系不发达。利用前人报道的常规移栽法获得的转基因再生株成活率一般50％～80％，跨度较大，程序也较繁琐；而转基因棉花再生株嫁接法对于操作人员的技术要求较高，工作量较大。要求转基因再生苗和砧木的长势大小要协调，符合嫁接要求，在时间上不好控制。同时，嫁接苗与砧木在包裹的环境中极易发生腐烂，特别在夏季高温季节腐烂更为突出。为有效避免上述弊端，简化操作程序，提高棉花再生植株和转基因苗的移栽成活率，我们发明了一种高成活率的转基因棉花再生株移栽法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种高成活率的转基因棉花再生株移栽法，它能有效解决背景技术中所存在的问题，简便易操作，大大提高了棉花再生植株和转基因苗的移栽成活率。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种高成活率的转基因棉花再生株移栽法，将转基因棉花再生株生根苗从培养基中取出，洗净再生株根部的培养基转移至新的栽培容器中，向栽培容器中加水至浸没再生株根部进行水培炼苗，经水培炼苗，生长健壮的转基因植株移栽到基质或土壤中，培养至棉花吐絮成熟。

上述高成活率的转基因棉花再生株移栽法，包括以下步骤：

(1)将转基因棉花再生株生根苗从培养基中取出，洗净再生株根部的培养基转移至新的栽培容器中，向栽培容器中加水至浸没再生株根部进行水培炼苗；

(2)将转基因棉花再生株在湿度60％～70％、温度为27℃～29℃、光照为白天/晚上16h/8h，12000～15000Lx的条件下进行培养；每隔2～3天更换一次栽培容器中的水，直至转基因再生株植株健壮，生长出更多根系；

(3)经水培炼苗后的转基因再生株移栽到基质或土壤中，培养至棉花吐絮成熟。

上述的高成活率的转基因棉花再生株移栽法，根据再生株的根系及幼苗生长情况确定水培炼苗的天数，一般水培炼苗7～15天。

上述的高成活率的转基因棉花再生株移栽法，所述的水为自来水。

上述的高成活率的转基因棉花再生株移栽法，所述的栽培容器为三角瓶。

本发明高成活率的转基因棉花再生株移栽法的详细步骤为：

待转基因棉花再生株生根苗在培养基中生长至三角瓶瓶盖，将再生株根部的培养基洗净，移栽到一个空三角瓶中，装入适量的自来水浸没再生株根部。在湿度60％～70％、温度27℃～29℃、光照(白天/晚上：16h/8h,12000～15000Lx)培养箱中培养。每隔2～3天更换一次三角瓶中的自来水，直至转基因再生株植株健壮，生长出更多根系。根据再生株的根系及幼苗生长情况决定具体培养天数，一般培养7～15天。经水培炼苗后的转基因再生株移栽到基质或土壤中，在正常条件的温室或网室中成活，直到棉花吐絮成熟。

选择转基因棉花再生株生根苗，历经上述培养基培养——根部培养基洗净——水培炼苗——基质/土壤移栽等步骤后，继续在温室中培养15天，统计移栽成活率。每次移栽50株，共设计6次重复实验。结果表明，每批次移栽成活率均非常高，6次重复的平均成活率达98.67％(表1)。该方法简便易操作，可高效、安全地用于转基因再生株的移栽，确保转基因再生株的正常生长发育。

表1转基因棉花再生株移栽成活率评价

本发明旨在提高转基因棉花再生株的移栽苗成活率。在转基因棉花再生株生根苗从培养基到基质/土壤的移栽过程中，增加自来水炼苗环节，能够增强移栽苗的长势及根系密集程度，培养健壮苗。避免了再生株直接从培养基移栽到基质/土壤中，容易使根部和茎部腐烂的难题。利用本发明的方法，其移栽苗成活率达到98％以上，且操作方法简单易行。

采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

1)将培养基上的转基因棉花再生株首先洗净根部培养基，移栽到装自来水的三角瓶中培养1-2周，避免携带培养基带来的污染，使再生株的根系发达，植株长势增强；

2)水培移栽法可使再生株从培养基生长条件向自然生长条件过渡间有一个缓冲阶段，为更好的适应自然环境奠定基础；

3)解决了再生株直接从培养基移栽到基质/土壤中，容易使根部和茎部腐烂，不易成活的难题。

4)转基因再生株移栽用的基质/土壤无需灭菌，无需地膜或烧杯等大量容器保湿，操作方法简便易行。

5)为珍贵的转基因棉花再生苗提供了一种高成活率的移栽法。利用本发明的方法，其移栽苗成活率达到98％以上。

附图说明

图1刚从培养基中移栽到装有自来水的三角瓶中的转基因棉花再生株

图2经水培炼苗15天后的转基因棉花幼苗生长发育表现

图3转基因棉花再生株水培炼苗后移栽至基质或土壤中生长一周的生长发育表现

具体实施方式

实施例1

(1)待转基因棉花再生株生根苗在培养基中生长至三角瓶瓶盖，将再生株根部的培养基洗净，移栽到一个空三角瓶中，装入适量的(浸没再生株根部)自来水(如图1为刚从培养基中移栽到自来水瓶中的转基因棉花再生株)进行水培炼苗。

(2)在湿度60％～70％、温度27℃～29℃、光照(白天/晚上：16h/8h,12000～15000Lx)培养箱中培养。每隔2～3天更换一次三角瓶中的自来水，培养15天，直至转基因再生株植株健壮，生长出更多根系(图2为经水培炼苗15天后的转基因棉花幼苗)。

(3)水培炼苗后的转基因再生株移栽到基质或土壤中，在正常条件的温室或网室中成活，移栽一周后，生长健壮的转基因棉花幼苗(图3为移栽一周后，生长健壮的转基因棉花幼苗)。进一步生长发育，直到棉花吐絮成熟。

本发明在转基因棉花再生株生根苗从培养基到基质/土壤的移栽过程中，增加自来水炼苗环节，能够增强移栽苗的长势及根系密集程度，培养健壮苗。避免了再生株直接从培养基移栽到基质/土壤中，容易使根部和茎部腐烂的难题。利用本发明的方法，其移栽苗成活率达到98％以上，且操作方法简单易行。