本发明涉及一种铁皮石斛纯种繁育和野外移植方法，属于铁皮石斛种质资源保护技术领域。
背景技术：
自然条件下，铁皮石斛种子需要依靠特定真菌诱导才能萌发，导致其自然繁殖率极低；加之，铁皮石斛对生长环境的独特要求，野生铁皮石斛生长缓慢，无法满足药用需求。近年来，通过无菌播种技术实现了铁皮石斛的工厂化生产，但经过5~8次继代后，种苗出现严重的退化，必须通过亲本进行复壮。但随着过度采挖和对铁皮石斛生长环境的破坏，野生资源日渐枯竭，亟需对野生种质资源进行纯种繁育以进行保护。
现有研究表明，野生铁皮石斛主要以侧芽的方式进行无性繁殖，即使对其进行人工授粉，由于铁皮石斛具有自交不亲和性，其自花授粉成功率仅为30%左右，结果率在10%以下。现有解决方案中，必须扩大自花授粉植株量，才能得到足够的果实用于无菌育苗，而现有的野生植株数量难以满足上述要求。
除此之外，在对组培苗进行炼苗处理时，现有技术方案中均采用炼苗床对组培苗进行定植。采用木质或钢网结构作为支架，在其上敷设10cm左右木粒、锯末、树皮等基质作为苗床，通过调控光照、温度、湿度、灌溉等条件，逐步模拟至野外环境。由于铁皮石斛具有匍匐附生的生长特性，在前期调控条件较为适宜的情况下，其枝条在炼苗床上横向生长较快。目前，在炼苗大棚内培育的铁皮石斛种苗株高均在30~40cm，而同期野生铁皮石斛植株高度仅为5~7cm，最终将表现为植株有益成分含量差异明显，导致人工培育的铁皮石斛品质逐步降低。并且，炼苗床中培育的铁皮石斛种苗，由于枝条过长，在移植野外时，只能进行地面定植。一方面，由于野外环境中土壤与炼苗床体基质差异较大，种苗根部极易受有害菌感染，导致成活率较低。另一方面，地面定植与野生铁皮石斛附生生长习性差异较大，导致植株品质变化，并影响成活率。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种铁皮石斛纯种繁育和野外移植方法，能够提高铁皮石斛自花授粉成功率和结实率，以有限的植株数量满足对野生铁皮石斛种质资源的保护要求；同时，模拟野生铁皮石斛生长情况进行炼苗和野外移植，缩小人工种苗与野生植株间的成分差异，且使人工种苗成活率提高至90%。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种铁皮石斛纯种繁育和野外移植方法，其特征在于包括以下步骤：
S1：选取野生纯种铁皮石斛开花期1~4天的花朵，摘下雄蕊，使用浸有授粉促进剂的干净棉团处理雌蕊孔和雄蕊，
授粉促进剂组成为：100mg/L IAA 和100mg/L VB1混合液，pH值6.0；
S2：将S1中所得雄蕊挑送入所得雌蕊孔内，套袋培育，受精成功的果实发育5个月后成熟；
S3：将S2中所得果实中的种子无菌播种于消毒的MS+NAA0.1-0.2培养基上，光照13.5h/d、光强2000Lux、温度23℃，培养1个月形成幼苗；
S4：将S3中所得幼苗转接至培养瓶中继续培养1~2个月，培养瓶内培养基质组成为：30g/L蔗糖和7g/L琼脂，pH值5.8，培养条件与S3相同；
S5：选取S4中株高4~5cm组培苗，使用清水将培养基质洗净，对根部进行消毒、沥水后，分别使用水苔和细绳将组培苗根部和上部固定在方格支架上；
S6：将S5中固定有铁皮石斛组培苗的方格支架首先竖直悬挂于炼苗大棚内，炼苗1个月，随后移至室外背阴处，再自然炼苗1个月；
S7：将S6中完成自然炼苗后的人工种苗连同方格支架一起捆缚于野外树干上，或用木钉扣置于岩石缝隙处。
作为本发明优选方案，所述S5中水苔使用0.1-0.2%百菌清消毒、沥干。
作为本发明优选方案，所述S5中方格支架采用柳树或榕树等枝条编制而成，尺寸为5cm×5cm。
作为本发明优选方案，所述S7中选择树皮肥厚、腐殖质丰富的阔叶树进行捆缚，离地高度为2~4m。
作为本发明优选方案，所述S7中选择苔藓厚实、湿润的岩石缝隙。
本发明的有益效果是：
1. 本发明通过使用授粉促进剂处理野生铁皮石斛花朵雌、雄蕊，干扰其自交不亲和性、并促进结实，从而提高铁皮石斛自花授粉成功率和结实率，以有限的野生铁皮石斛植株数量实现其种质资源的保护要求。
2. 本发明通过竖直悬挂的方式固定种苗，采用分步炼苗的方式，并选取树干、缝隙等野生铁皮石斛生境进行野外定植，缩小人工铁皮石斛种苗与野生铁皮石斛生境间的差异，保证人工种苗品质，并提高成活率。
具体实施方式
结合实施例详细阐述本发明的具体实施方式如下：
实施例1
S1：自花授粉
①配制授粉促进剂
分别称取10mgIAA和10mg VB1置于10ml烧杯中，使用蒸馏水溶解后，倒入100ml容量瓶中定容，并调整pH值至6.0。
②人工授粉
选取野生铁皮石斛植株中开花后1~4日内的花朵，摘下雄蕊置于使用授粉促进剂浸润的消毒棉团上，静置5~10s；
取另一浸有授粉促进剂的消毒棉团擦拭上述花朵的雌蕊孔；
使用75%酒精消毒的牙签挑取处理后的雄蕊送入处理后的雌蕊孔。
S2：套袋结实
对人工授粉后的花朵进行套袋、标记，以防止异花授粉，保证纯种度。培育5个月后，摘取表面转黄的果实。
S3：无菌播种
①制作种子培养基
配制MS+NAA0.1-0.2培养基，高温灭菌、倒平板。
②种子播种
在超净工作台中使用升汞溶液等消毒溶剂对摘取的果实表面进行消毒，在解剖盘内剥离出种子，撒播于上述平板培养基中。
S4：组织培养
①幼苗培养
将播种后的平板培养基放入培养箱中，光照13.5h/d、光强2000Lux、温度23℃，培养1个月后形成幼苗。
②制作种苗培养基质
称取7g琼脂备用；
称取30g蔗糖置于500ml烧杯中，使用蒸馏水溶解后，通过量筒定容至1L，倒入耐热容器中加热煮沸，将琼脂加入搅拌、融化，调整pH值为5.8，分装至240ml培养瓶中，高温灭菌。
③种苗培养
将幼苗从平板培养基中取出，转接至培养瓶中的种苗培养基质上，放入培养室中，光照13.5h/d、光强2000Lux、温度23℃，培养1~2个月，即形成4~5cm高的种苗。
S5：种苗定植
①支架制作
用柳树或榕树的枝条编成5×5cm的方格，作为种苗定植支架。
②绑缚材料处理
将采集或购买的水苔、苔藓用0.1~0.2%百菌清消毒、沥干备用。
③种苗处理
将种苗自培养瓶中取出，清水洗净后，使用0.1~0.2%百菌清对种苗根部进行消毒、沥干。
④种苗固定
将种苗根部用消毒后的水苔缠附于方格支架上，种苗的上部用细绳也固定于方格支架上。
S6：分步炼苗
将固定有种苗的方格支架竖直悬挂于炼苗大棚内，棚内炼苗1个月后，再移至室外背阴处，自然炼苗1个月。
S7：野外移植
在云南广南县海拔800-1000m及四川邛崃天台山海拔800-1200m北坡山林中，距离村庄较远、人迹较少的偏僻处，将种苗连同方格支架一起捆缚于树皮肥厚、腐殖质丰富的阔叶树树干，离地2~4m，或用木钉扣置于苔藓厚实、湿润的岩石缝隙。
约1个月左右，采用上述方法移植于野外的铁皮石斛纯种种苗成活率均达90%以上。
对上述方案进一步说明如下：
授粉促进剂中IAA能够诱导子房发育，从而干扰铁皮石斛自交不亲和基因表达；VB1能够提高植物体代谢率，从而促进果实发育。在上述两种成分的共同作用下，能够显著提高铁皮石斛自花授粉成功率和结实率。
由于铁皮石斛异花授粉成功率显著高于其自花授粉成功率，为保证纯种度，必须对自花授粉后的花朵进行套袋。
野生铁皮石斛多附生于悬崖峭壁、树干、树枝或岩石缝中，通过根系吸收根际微生物，分解树杆上的动植物残体及空气中的养分，自然生境下，铁皮石斛多生于苔藓类植物丰富的石壁、石缝处。为诱导人工种苗发展出适合野外生长的代谢方式，并提高其野外成活率，本发明进行如下创造：
首先，降低种苗培养基质营养供给，仅含有蔗糖一种营养物质用以保证种苗基础代谢要求，从而控制种苗生长速度，诱导其发展出适应恶劣生境条件下的代谢方式。
其次，采用树枝编制而成的支架定植种苗，水苔绑缚种苗根部，竖直悬挂进行炼苗，精确模拟野生生境，促使人工种苗发展出与野生铁皮石斛相同的生长习性和营养获取能力。
再次，采用分步炼苗的方式，首先在炼苗大棚内调控种苗培养条件，将生境条件逐渐调整到接近自然环境的水平，有利于在保证成活率的前提下，使人工种苗具备一定的适应能力。随后，将炼苗棚内种苗转移至室外背阴处，模拟野生生境中70%~80%的自然遮阴度，进行自然炼苗，使人工种苗的适应能力接近于野生铁皮石斛。
最后，通过将支架固定至野生铁皮石斛生境中，将人工种苗定植野外。固定方式简单、可靠，对种苗根部不产生伤害，有利于种苗成活。
采用上述方法移植于野外的铁皮石斛纯种种苗，1个月后成活率达90%以上。