温室白粉虱在分离番茄褪绿病毒的应用的制作方法

文档序号:12513100阅读:来源:国知局

技术特征:

1.温室白粉虱在从感染番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒的病株中分离番茄褪绿病毒的应用。

2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,包括如下步骤:

(1)将温室白粉虱用被番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒侵染的番茄病株饲喂,制得染毒温室白粉虱;

(2)用步骤(1)制得的染毒温室白粉虱侵染番茄健康植株,制得感染番茄褪绿病毒的番茄植株。

3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(1)中的温室白粉虱为初羽化的温室白粉虱。

4.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(1)中的饲喂步骤如下:

将温室白粉虱放入直径1.5cm的微虫笼中,置于番茄病株从顶部数第二片叶上,待温室白粉虱全部飞至番茄叶片上计时,饲喂24h以上。

5.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(2)中的侵染步骤如下:

将步骤(1)制得的染毒温室白粉虱置于微虫笼中,然后固定于番茄苗从顶部数第二片叶上,待温室白粉虱全部飞到叶片上,开始计时,24h后,将温室白粉虱取出,即得。

6.如权利要求2所述的应用,其特征在于,还包括对步骤(1)制得的染毒温室白粉虱进行体内ToCV和TYLCV检测的步骤。

7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述体内ToCV检测具体步骤如下:

将温室白粉虱置于液氮冷冻5s,然后用去RNase的研磨棒进行充分研磨后,再加入1mLTrizol试剂,并按照Trizol提取RNA法的说明书完成温室白粉虱总RNA的提取,取1μg总RNA,通过cDNA反转录试剂盒完成第一链cDNA的合成;

根据ToCV基因组序列设计一对检测引物:

上游引物ToCV-F:GGGGAATGTGCGTTTAAAGA;SEQ ID NO.1

下游引物ToCV-R:GAACCAAATCAACGCGATCT;SEQ ID NO.2

ToCV检测反应体系为:

10×PCR Buffer 2.5μL、dNTP Mixture 2μL、上游和下游引物各1μL、cDNA模板1μL、r Taq 0.25μL、ddH2O 17.25μL;

PCR反应程序为:94℃预变性3min;94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环;72℃后延伸7min后,将样品进行琼脂糖凝胶电泳,根据目的条带有无判断温室白粉虱是否成功获取ToCV。

8.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述体内TYLCV检测具体步骤如下:

将温室白粉虱置于液氮冷冻5s,然后用去RNase的研磨棒进行充分研磨后,按照动物组织DNA提取试剂盒说明书步骤完成虫体基因组DNA的提取;

TYLCV检测引物如下:

上游引物TYLCV-F:CGCCCGTCTCGAAGGTTC;SEQ ID NO.3

下游引物TYLCV-R:GCCATATACAATAACAAGGC;SEQ ID NO.4

TYLCV检测反应体系:

10×PCR Buffer 2.5μL、dNTP Mixture 2μL、上游和下游引物各1μL、cDNA模板1μL、r Taq 0.25μL、ddH2O 17.25μL;

PCR反应程序:94℃预变性3min;94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸50s,35个循环;72℃后延伸7min后,将样品进行琼脂糖凝胶电泳,根据目的条带有无判断温室白粉虱是否成功获取TYLCV。

9.如权利要求2所述的应用,其特征在于,还包括对步骤(2)制得的感染番茄褪绿病毒的番茄植株进行检测的步骤,具体步骤如下:

将感染番茄褪绿病毒的番茄植株放入人工气候室,在27℃,RH 60%,L:D=14:10的条件下培养一个月,观察发病情况。

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