温室白粉虱在分离番茄褪绿病毒的应用的制作方法

本发明涉及温室白粉虱在分离番茄褪绿病毒的应用，属于植物保护和生物技术技术领域。

背景技术：

自2012年以来，一种新的植物病毒-番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)成功入侵中国内陆并呈迅速扩散趋势，目前在我国山东、山西、内蒙古、浙江等多个地区均检测到该病毒的存在，给番茄等蔬菜产业带来严重的经济损失。

危害番茄的病毒种类很多，如番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)、番茄花叶病毒(Tomato masaic virus,ToMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、蚕豆萎蔫病毒(Broad bean wilt virus,BBWV)等。其中TYLCV自2002年传入中国以来，快速蔓延，迅速成为危害我国蔬菜的主要病毒之一，在多个番茄种植区均检测到其存在。烟粉虱(Bemisia tabaci)作为我国主要的蔬菜害虫之一，扩散能力强，是TYLCV和ToCV的主要传播媒介，能够同时完成对两种病毒的有效传播，并且研究者也证实了二者在田间复合侵染的现象。由于ToCV传入我国内陆不久，且刚上升为一种主要番茄病毒，对其发生、传播等特点仍然知之甚少，对其针对性开展一系列基础研究则显得尤为必要。对于科研工作者而言，获得稳定单一的毒源是后续研究的必要前提。目前ToCV的侵染性克隆仍未见报道，而田间采集样品中多同时携带TYLCV和ToCV两种病毒，因此如何从现有复合侵染样品中分离出单一ToCV是解决上述问题的关键。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供温室白粉虱在分离番茄褪绿病毒的应用。目前从TYLCV和ToCV复合侵染植株中分离单一病毒的空缺，提供一种快速、可靠的分离ToCV的方法。

本发明的技术方案如下：

温室白粉虱在从感染番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒的病株中分离番茄褪绿病毒的应用。

上述应用，包括如下步骤：

(1)将温室白粉虱用被番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒侵染的番茄病株饲喂，制得染毒温室白粉虱；

(2)用步骤(1)制得的染毒温室白粉虱侵染番茄健康植株，制得感染番茄褪绿病毒的番茄植株。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的温室白粉虱为初羽化的温室白粉虱。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的饲喂步骤如下：

将温室白粉虱放入直径1.5cm的微虫笼中，置于番茄病株从顶部数第二片叶上，待温室白粉虱全部飞至番茄叶片上计时，饲喂24h以上。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中的侵染步骤如下：

将步骤(1)制得的染毒温室白粉虱置于微虫笼中，然后固定于番茄苗从顶部数第二片叶上，待温室白粉虱全部飞到叶片上，开始计时，24h后，将温室白粉虱取出，即得。

根据本发明优选的，还包括对步骤(1)制得的染毒温室白粉虱进行体内ToCV和TYLCV检测的步骤，体内ToCV检测具体步骤如下：

将温室白粉虱置于液氮冷冻5s，然后用去RNase的研磨棒进行充分研磨后，再加入1mL Trizol试剂，并按照Trizol提取RNA法的说明书完成温室白粉虱总RNA的提取，取1μg总RNA，通过cDNA反转录试剂盒完成第一链cDNA的合成；

根据ToCV基因组序列设计一对检测引物：

上游引物ToCV-F：GGGGAATGTGCGTTTAAAGA；SEQ ID NO.1

下游引物ToCV-R：GAACCAAATCAACGCGATCT；SEQ ID NO.2

ToCV检测反应体系为：

10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)2.5μL、dNTP Mixture 2μL、上游和下游引物各1μL、cDNA模板1μL、r Taq 0.25μL、ddH₂O 17.25μL；

PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃后延伸7min后，将样品进行琼脂糖凝胶电泳，根据目的条带有无判断温室白粉虱是否成功获取ToCV；

体内TYLCV检测具体步骤如下：

将温室白粉虱置于液氮冷冻5s，然后用去RNase的研磨棒进行充分研磨后，按照动物组织DNA提取试剂盒说明书步骤完成虫体基因组DNA的提取；

TYLCV检测引物如下：

上游引物TYLCV-F：CGCCCGTCTCGAAGGTTC；SEQ ID NO.3

下游引物TYLCV-R：GCCATATACAATAACAAGGC；SEQ ID NO.4

TYLCV检测反应体系：

10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)2.5μL、dNTP Mixture 2μL、上游和下游引物各1μL、cDNA模板1μL、r Taq 0.25μL、ddH₂O 17.25μL；

PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃后延伸7min后，将样品进行琼脂糖凝胶电泳，根据目的条带有无判断温室白粉虱是否成功获取TYLCV。

根据本发明优选的，还包括对步骤(2)制得的感染番茄褪绿病毒的番茄植株进行检测的步骤，具体步骤如下：

将感染番茄褪绿病毒的番茄植株放入人工气候室，在27℃，RH 60％，L:D＝14:10的条件下培养一个月，观察发病情况。

有益效果

1、本发明首次发现温室白粉虱具有只传播番茄褪绿病毒而不传播番茄黄化曲叶病毒的特点，从而利用上述特点高效批量进行ToCV单一毒株的建立，不仅可以保证病毒分离的可靠稳定性，而且利用媒介进行传毒也较大程度地提高了毒株建立的效率和成功率；

2、本发明所述方法只需通过处理温室白粉虱以完成整个过程，无需制备侵染性克隆、病毒研磨提取等繁琐步骤，容易掌握，简便实用，成本低廉；

3、本发明通过优化侵染条件，大幅提高了侵染的成功率。

附图说明

图1：获毒24h后，温室白粉虱携毒情况PCR检测的琼脂糖凝胶电泳图；

图中：泳道M为DNA Maker DL2000，条带从上到下依次代表2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道1-4分别为获毒温室白粉虱、ToCV阳性对照、阴性对照(健康温室白粉虱)、空白对照；泳道5-8分别为获毒温室白粉虱、TYLCV阳性对照、阴性对照(健康温室白粉虱)、空白对照；

图2：传毒番茄植株携毒情况PCR检测的琼脂糖凝胶电泳图；

图中：泳道M为DNA Maker DL2000，条带从上到下依次代表2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道1-4分别为传毒番茄植株、ToCV阳性对照、阴性对照(健康番茄植株)、空白对照；泳道5-8分别为传毒番茄植株、TYLCV阳性对照、阴性对照(健康番茄植株)、空白对照。

图3：烟粉虱传毒后，番茄植株携毒情况PCR检测的琼脂糖凝胶电泳图；

图中：泳道M为DNA Maker DL2000，条带从上到下依次代表2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道1-4分别为传毒番茄植株、ToCV阳性对照、阴性对照(健康番茄植株)、空白对照；泳道5-8分别为传毒番茄植株、TYLCV阳性对照、阴性对照(健康番茄植株)、空白对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的原理和内容进行详细描述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例1、温室白粉虱的获毒与检测

准备1株TYLCV和ToCV复合侵染的番茄作为毒源。

取40头初羽化的温室白粉虱，放入直径1.5cm的微虫笼中，将带有温室白粉虱的微虫笼夹在从顶部数第二片叶上。等待温室白粉虱全部飞至番茄叶片上后，开始计时，24h后将虫子吸出，制得染毒温室白粉虱。取20头准备传毒，剩余20头，分别用来提取RNA(15头)和DNA(5头)，用于检测温室白粉虱获毒情况。

温室白粉虱体内ToCV检测：将15头温室白粉虱放入1.5mL RNase Free的离心管中，并将其用液氮冷冻5s，用去RNase的研磨棒进行充分研磨后，加入1mL Trizol，并按照赛默飞世尔公司的Trizol提取RNA法的说明书完成温室白粉虱总RNA的提取。取1μg总RNA，通过宝生物工程有限公司的PrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real Time)试剂盒完成第一链cDNA的合成。根据ToCV基因组序列设计一对检测引物：

上游引物ToCV-F：GGGGAATGTGCGTTTAAAGA；SEQ ID NO.1

下游引物ToCV-R：GAACCAAATCAACGCGATCT；SEQ ID NO.2

ToCV检测反应体系为：

10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)2.5μL、dNTP Mixture 2μL、上游和下游引物各1μL、cDNA模板1μL、r Taq 0.25μL、ddH₂O 17.25μL；

PCR反应程序为：

94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min；

然后后将样品进行琼脂糖凝胶电泳，结果表明从温室白粉虱样品中成功扩增出约250bp左右的ToCV目的片段条带(如图1所示)，并将PCR产物进行测序，将测序结果在NCBI上进行BLASTn比对，结果证实该序列为ToCV次要衣壳蛋白基因片段(如SEQ ID NO.5所示)，证明此方法能够使温室白粉虱成功获取ToCV。

温室白粉虱体内TYLCV检测：将5头温室白粉虱放入1.5mL RNase Free的离心管中，并将其用液氮冷冻5s，用去RNase的研磨棒进行充分研磨后，按照动物组织DNA提取试剂盒说明书步骤完成虫体基因组DNA的提取。

TYLCV检测引物序列如下：

上游引物TYLCV-F：CGCCCGTCTCGAAGGTTC；SEQ ID NO.3

下游引物TYLCV-R：GCCATATACAATAACAAGGC；SEQ ID NO.4

TYLCV检测反应体系同ToCV检测；PCR反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸7min；

然后将样品进行琼脂糖凝胶电泳，结果表明从温室白粉虱样品中成功扩增出TYLCV目的片段条带，约600bp左右(如图1所示)，证明取毒24h后，温室白粉虱体内也带有TYLCV。

实施例2、ToCV单一侵染番茄植株的建立

准备3-4真叶期的番茄苗，将20头已获毒24h的温室白粉虱放入微虫笼中，并固定至番茄苗从顶部数第二片叶上，待温室白粉虱全部飞到叶片上，开始计时，24h后，将虫子取出。将传毒后的番茄苗放入人工气候室(27℃，RH 60％，L:D＝14:10)中培养，一个月后观察发病情况，发现番茄植株下部叶片出现了轻微的叶脉间褪绿现象，疑似ToCV发病症状，但是整株并未发现叶片发黄及卷曲等TYLCV发病症状。初步断定番茄植株可能只感染ToCV，有待于进行分子检测。

用酒精消毒的镊子剪取从下部数第一片叶。称取0.1g放入去RNase的研钵中，加入液氮后充分研磨，将磨碎的植物组织粉末转移到含有1mL Trizol的1.5mL RNase Free离心管中，按照Trizol提取RNA法的说明书完成番茄叶片总RNA的提取。取1μg总RNA，通过cDNA反转录试剂盒完成第一链cDNA的合成。番茄中ToCV的PCR检测引物、体系和方法同实施例(1)中温室白粉虱中ToCV检测方法。从琼脂糖凝胶电泳结果可看出，检测样品在250bp左右出现目的条带(如图2中的泳道1-4所示)，说明传毒植株成功携带ToCV。

用酒精消毒的镊子剪取从下部数第二片叶。称取0.5g放入已高温灭菌处理过的研钵中，加入液氮充分研磨后，按照植物组织基因组DNA提取试剂盒的步骤完成番茄叶片基因组DNA的提取。番茄中TYLCV的PCR检测引物、体系和方法同实施例(1)中温室白粉虱中TYLCV检测方法。琼脂糖凝胶电泳结果发现，检测样品并未扩增出TYLCV目的片段条带(如图2中的泳道5-8所示)，说明该植株不携带TYLCV，证明此方法成功分离出ToCV单一毒株，切实可行。

运用该方法对30株3-4真叶期的番茄苗传毒，1个月后观察每株番茄苗的发病情况，并进行分子检测，结果表明有28株番茄苗已成功感染ToCV，所有番茄苗均未感染TYLCV，本方法侵染单一ToCV的成功率为93.33％。

对比例1

同样，选择烟粉虱作为待试昆虫，按照实施例1中的方法进行获毒，并按照实施例2中的方法进行传毒，1个月后进行传毒植株的观察，发现番茄苗下部叶片出现了轻微的叶脉间褪绿现象，顶部叶片有轻微的发黄卷曲现象。

按照实施例2中的方法对植株携毒情况进行分子检测，ToCV检测琼脂糖凝胶电泳结果显示，检测样品在250bp左右出现目的条带(如图3中的泳道1-4所示)，说明传毒植株携带ToCV；TYLCV检测琼脂糖凝胶电泳结果显示，检测样品在600bp左右出现目的条带(如图3中的泳道5-8所示)，说明传毒植株同样携带TYLCV。

由此可以得出，温室白粉虱能够成功分离出单一ToCV病毒，而烟粉虱不具备此特性。

对比例2

如实施例2所述的ToCV单一侵染番茄植株的建立方法，不同之处在于，开始计时后的传毒时间为12h。运用此方法对30株3-4真叶期的番茄苗进行传毒，1个月后观察发病症状。

采用实施例2中的方法对番茄植株病毒侵染情况进行检测，结果发现，仅有12株番茄植株成功携带ToCV，所有番茄植株均不携带TYLCV，表明传毒时间缩短至12h后，分离单一ToCV的成功率仅为40％。而实施例2中的分离传毒成功率为93.33％，传毒时间是影响传毒成功率的重要因素，在一定范围内，相对延长昆虫传毒时间，能够提高其传毒的成功率。