一种鉴别烟粉虱隐种和白粉虱的引物及鉴别方法

一种鉴别烟粉虱隐种和白粉虱的引物及鉴别方法
【专利摘要】本发明涉及一种鉴别烟粉虱隐种和白粉虱的引物及鉴别方法。一种鉴别烟粉虱MEAM1隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱的引物，所述引物为一对，分别为SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列。本发明还涉及利用上述引物鉴别烟粉虱隐种和白粉虱的方法。本发明所述鉴别烟粉虱MEAM1隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱的引物能够扩增烟粉虱MEAM1隐种和烟粉虱MED隐种基因组DNA中的BtabCSP2基因，而对白粉虱基因组DNA没有扩增作用，为鉴定烟粉虱MEAM1隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱提供了简便稳定的分子标记，解决了现有烟粉虱MEAM1隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱鉴定较繁琐的问题。
【专利说明】一种鉴别烟粉虱隐种和白粉虱的引物及鉴别方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种鉴别烟粉虱隐种和白粉虱的引物及鉴别方法，特别涉及一种鉴别烟粉虱MEAMl隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱的引物及鉴别方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]烟粉風(Bemisatabaci)和白粉風(Trialeurodes vaporariorum)是两种世界性的杂食性害虫。白粉虱一直是我国北方重要的农业害虫。自20世纪90年代末期以来，烟粉虱在我国广大地区突然大面积暴发成灾。两种粉虱除直接危害农作物外，还传播多种重要的植物病毒病。在我国北方地区，它们寄主重叠、危害习性相同、生活史也十分相近，且体型微小、外形相似，经常同域发生，仅靠外部形态很难区分。
[0003]烟粉虱是一种包含30多个隐种的物种复合体。在世界范围内分布并造成严重危害的是烟粉虱MEAMl隐种和MED隐种，从2000年前后传入我国并迅速扩散，到2009年在我国除重庆、西藏和辽宁之外所有省市均发现MEAMl隐种和MED隐种烟粉虱，在南方及东南沿海地区以MEAMl隐种烟粉虱为主，在长江流域和东部沿海地区以MED隐种为主。[0004]由于长期使用农药，MEAMl隐种和MED隐种烟粉虱对常见农药都产生了抗药性，包括有机磷类、拟除虫菊酯类、生长调节剂类及新烟碱类。MED隐种烟粉虱对吡虫啉、噻虫嗪等新烟碱类杀虫剂抗性较高，而MEAMl隐种烟粉虱较为敏感，针对不同烟粉虱隐种应该制定相应的防治策略。因此开发MEAMl隐种和MED隐种烟粉虱快速准确的鉴定方法对于有效防控烟粉虱具有重要意义。
[0005]MEAMl隐种和MED隐种烟粉虱在寄主范围、传毒能力及抗药性方面存在差异，但在外形上难以区分，目前主要依靠分子生物学方法鉴定，包括mtCOI测序、RAPD, AFLP, SSR和SCAR，其中最常用的是mtCOI测序法。mtCOI方法需要进行测序，费用较高，而且时间长。
[0006]限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术，又称为酶切位点多态性序列(CSPS)技术，是利用已知DNA序列设计特异性引物来扩增一段DNA片段，再利用限制性内切酶对PCR产物进行消化，经琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，进行RFLP分析。该技术是以已知DNA序列上酶切位点的分布为基础，能揭示单个碱基的差异，因此非常适合鉴别MEAMl隐种和MED隐种烟粉虱这种DNA差异较小的物种。Khansdan等(2005)曾利用mtCOI和核钠离子通道基因为基础开发了鉴别MEAMl隐种和MED隐种烟粉虱的方法，由于所扩DNA片段均大于800bp，所以扩增成功的难度较大。
[0007]因此需要开发一种易于扩增的PCR-RFLP方法来鉴别MEAMl隐种和MED隐种烟粉虱以及经常混合发生且较难区分的白粉虱。

【发明内容】

[0008]本发明针对现有技术的不足，提供一种鉴别烟粉虱MEAMl隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱的引物及鉴别方法。
[0009]一种鉴别烟粉虱MEAMl隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱的引物，所述引物为一对，分别为SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
[0010]正义引物Bc2-F:5，-CAAATCAGTTTAGTGGAGGC-3，；SEQ ID N0.1
[0011]反义引物Bc2-R:5’ -TAAGCAATCCGAACTTGACTA-3’ ；SEQ ID N0.2
[0012]一种鉴别烟粉虱MEAMl隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱的方法，步骤如下:
[0013](I)提取待鉴别样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液；
[0014]所述待鉴别样品为烟粉虱MEAMl隐种、烟粉虱MED隐种或白粉虱；
[0015](2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用上述鉴别烟粉虱MEAMl隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱的引物进行PCR扩增，制得的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，当电泳结果中显示有一条463bp的条带时，待鉴别样品为烟粉虱；当电泳结果中没有条带时，则待鉴别样品为白粉虱； [0016](3)用限制性内切酶Sac II酶切步骤(2)制得的长度为463bp的PCR扩增产物，制得酶切产物；
[0017](4)对步骤(3)制得的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当电泳结果中显示有一条463bp的条带时，则该待鉴别样品为烟粉虱MEAMl隐种；当电泳结果中显示有一条235bp的条带时，则该待鉴别样品为烟粉虱MED隐种。
[0018]所述步骤(2)中PCR扩增的扩增体系为:
[0019]基因组DNA 溶液 2.5μ 1，20μΜ 引物 0.5μ l，5U/y I Taq 酶 0.25 μ 1，IOXTaqBuffer (缓冲液)2.5 μ 1，IOmM dNTP0.5 μ 1，ddH20 补至 25 μ I ；
[0020]优选的，所述步骤(2)中PCR扩增的扩增条件如下:
[0021]94°C预变性2分钟；94°C变性30秒，52°C退火30秒，72°C延伸30秒，进行35个循环；72°C延伸7分钟。
[0022]所述步骤(3)中限制内切酶Sac II酶切反应条件如下:37°C酶切2小时。
[0023]上述步骤(1)中提取待鉴别样品的基因组DNA、步骤(2)和步骤(4)中琼脂糖凝胶电泳分析均按本领域常规技术操作。上述实验步骤如无特别说明均可参见《分子克隆实验指南》第三版(北京:科学出版社，2002)。
[0024]有益效果
[0025]1、本发明所述鉴别烟粉虱MEAMl隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱的引物能够扩增烟粉虱MEAMl隐种和烟粉虱MED隐种基因组DNA中的BtabCSP2基因，而对白粉虱基因组DNA没有扩增作用，为鉴定烟粉虱MEAMl隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱提供了简便稳定的分子标记，解决了现有烟粉虱MEAMl隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱鉴定较繁琐的问题；
[0026]2、本发明所述的限制性内切酶为常用的限制性内切酶，为筛选烟粉虱MEAMl隐种和烟粉虱MED隐种提供了简便稳定的酶切标记；
[0027]3、本发明从分子水平探索了烟粉虱MEAMl隐种和烟粉虱MED隐种BtabCSP2基因序列差异，探索建立了 MEAMl隐种和MED隐种烟粉虱的鉴别技术，为今后烟粉虱MEAMl隐种和烟粉虱MED隐种的种群动态鉴定、生物学以及综合防治奠定了基础。
【专利附图】

【附图说明】
[0028]图1是实施例2中PCR产物经Sac II酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；
[0029]其中:MEAM1:烟粉虱 MEAMl 隐种，MED:烟粉虱 MED 隐种，M:DL2000DNAMarkero[0030]图2是实施例3中利用引物Bc2_F和Bc2_R PCR扩增田间粉虱样品的琼脂糖凝胶电泳图；
[0031]其中:1-5为潍坊蜀葵的粉虱样品，6-10为潍坊向日葵的粉虱样品。11-15为德州棉花的粉虱样品，16-20为德州茄子的粉虱样品，21-25为青岛辣椒的粉虱样品，26-30为济南甘蓝的粉虱样品；
[0032]图3是实施例3中利用内切酶Sac 11酶切PCR产物后的琼脂糖凝胶电泳图。
[0033]其中:1-5为潍坊蜀葵的粉虱样品，6-10为潍坊向日葵的粉虱样品。11-15为德州棉花的粉虱样品，16-20为德州茄子的粉虱样品，21-25为青岛辣椒的粉虱样品，26-30为济南甘蓝的粉風样品。
【具体实施方式】
[0034]下面结合实施例及说明书附图对本发明的内容做进一步的说明，但本发明所保护范围不限于此。
[0035]实施例1、实施例2中所述烟粉虱MEAMl隐种和烟粉虱MED隐种为本实验室饲养种群；
[0036]实施例3中所述烟粉虱和白粉虱于2013年采集于山东省各地(表1)。
[0037]表1
[0038]
【权利要求】
1.一种鉴别烟粉虱MEAMl隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱的引物，所述引物为一对，分别为SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
2.一种鉴别烟粉虱MEAMl隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱的方法，其特征在于，步骤如下: (1)提取待鉴别样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液； 所述待鉴别样品为烟粉虱MEAMl隐种、烟粉虱MED隐种或白粉虱； (2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的鉴别烟粉虱MEAMl隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱的引物进行PCR扩增，制得的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，当电泳结果中显示有一条463bp的条带时，待鉴别样品为烟粉虱；当电泳结果中没有条带时，则待鉴别样品为白粉風； (3)用限制性内切酶SacII酶切步骤(2)制得的长度为463bp的PCR扩增产物，制得酶切产物； (4)对步骤(3)制得的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当电泳结果中显示有一条463bp的条带时，则该待鉴别样品为烟粉虱MEAMl隐种；当电泳结果中显示有一条235bp的条带时，则该待鉴别样品为烟粉虱MED隐种。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中PCR扩增的扩增体系为: 基因组 DNA 溶液 2.5 μ 1，20 μ M 引物 0.5 μ l,5U/y I Taq 酶 0.25 μ 1，IOXTaq 缓冲液2.5μ l, IOmM dNTP0.5 μ 1，ddH20 补至 25 μ l。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中PCR扩增的扩增条件如下: 94°C预变性2分钟；94°C变性30秒，52°C退火30秒，72°C延伸30秒，进行35个循环；72 °C延伸7分钟。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中限制内切酶SacII酶切反应条件如下:37°C酶切2小时。
【文档编号】C12Q1/68GK103898225SQ201410145254
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月11日 优先权日:2014年4月11日
【发明者】刘国霞, 让·弗朗西斯·皮西姆邦, 宣宁, 步迅, 谢红艳, 岳寿松, 杨连群, 张全芳, 范仲学 申请人:山东省农业科学院生物技术研究中心