突变酶及其用途

突变酶及其用途
【专利摘要】本发明的课题在于提供一种显示葡萄糖脱氢酶活性的新型酶。此外，本发明的课题在于提供有关酶的修饰的新型方法。本发明提供一种突变酶，其由在来自微生物的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列中选自以下一个或两个以上的氨基酸被其它氨基酸取代而得的氨基酸序列构成：与序列号1所示的氨基酸序列的115位、131位、132位、193位、353位、436位、446位、472位、511位、535位、537位、582位或583位氨基酸对应的氨基酸。
【专利说明】突变酶及其用途
[0001] 本发明专利申请是针对申请日为2010年11月22日、申请号为201080055012.4、
发明名称为“突变酶及其用途”的申请提出的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及突变酶及酶的修饰方法,提供经脱氢酶(dehydrogenase)化的葡萄糖氧化酶及其制备方法等。本申请主张基于2009年12月5日申请的日本专利申请第2009-277096号的优先权，通过参照的方式援引该专利申请的全部内容。
【背景技术】
[0003]使用电化学生物传感器的简易型自我血糖测定器得到广泛使用。在该生物传感器中利用以葡萄糖为底物的酶即葡萄糖氧化酶(以下简称为“G0”)、葡萄糖脱氢酶(以下简称为“GDH”)。GO具有针对葡萄糖的特异性高且热稳定性优异这样的优点，但另一方面被指出如下问题:在使用GO的测定中容易受到测定样品中的溶解氧的影响，溶解氧对测定结果造成影响。
[0004]另一方面，作为不受到溶解氧的影响且在NAD (P)不存在的情况下对葡萄糖发生作用的酶，已知以吡咯喹啉醌(PQQ)为辅酶的⑶H (以下，简称为“PQQ-GDH”)(例如参照专利文献I~3)。但是，PQQ-GDH存在如下问题=(I)PQQ容易从酶中离解；(2)针对葡萄糖的选择性低；以及(3)由于一般存在于膜组分，因此其提取、分离操作中存在困难等。
[0005]除PQQ-GDH以外，作为不受到溶解氧的影响且在NAD(P)不存在的情况下对葡萄糖发生作用的酶，已知以黄素腺嘌呤二核苷酸为辅酶的⑶H(以下，简称为“FAD-GDH”)。迄今为止，从米曲霉(非专利文献I~4、专利文献4)及土曲霉(专利文献5)中分别取得FAD-GDH。作为FAD-GDH的一般特性，已知:针对木糖的反应性比较高(例如在专利文献5所公开的FAD-GDH的情况下，对木糖的反应性为对葡萄糖的作用性的10%左右)以及最适温度高(例如专利文献4所公开的FAD-GDH的最适温度为约60°C)。应予说明，以提高实用性等为目的，正在大力尝试酶的修饰。报告FAD-GDH的修饰的文献如下所示(专利文献6~9)。
[0006]最近，报告了利用GO的结构进行FAD-GDH的立体结构分析，Glu414及Arg502对底物识别是重要的(非专利文献5，6)。
[0007]专利文献
[0008]专利文献1:日本特开2000-350588号公报
[0009]专利文献2:日本特开2001-197888号公报
[0010]专利文献3:日本特开2001-346587号公报
[0011]专利文献4:国际公开第2007/139013号小册子
[0012]专利文献5:国际公开第2004/058958号小册子
[0013]专利文献6:日本特开2009-225801号公报
[0014]专利文献7:日本特开2009-225800号公报
[0015]专利文献8:日本特开2009-159964号公报[0016]专利文献9:日本特开2008-237210号公报
[0017]非专利文献1:Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillusoryzae.1.1nduction of its synthesis by p—benzoquinone and hydroquinone, T.C.Bak, and R.Sato, Biochim.Biophys.Acta, 139, 265-276 (1967).[0018]非专利文献 2:Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillusoryzae.11.Purification and physical and chemical properties, T.C.Bak, Biochim.Biophys.Acta, 139, 277-293(1967).[0019]非专利文献 3:Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillusoryzae.1I1.General enzymatic properties, T.C.Bak, Biochim.Biophys.Acta,146，317-327(1967).[0020]非专利文献 4:Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillusoryzae.1V.Histidyl residue as an active site, T.C.Bak, and R.Sato, Biochim.Biophys.Acta, 146, 328-335(1967).[0021]非专利文献5:2009年度日本药学会年会要旨集卷:129号:第3页:118演讲题目序号:26Q-pmll5
[0022]非专利文献6:2009年度日本生化学会大会要旨集演讲题目序号:3T5a_5(3P-109)

【发明内容】

[0023]FAD-GDH与PQQ-GDH相比存在有利之处。另一方面，FAD-GDH针对木糖的反应性比较高，因此在测定木糖负荷试验受试者的血糖时存在难以检测出正确的测定值这样的问题。此外，由于最适温度 高，因此在寒冷地区的测定等温度低的环境下进行测定时，无法发挥充分的活性。在这种测定条件下需要进行温度修正且还容易产生测定误差。如上所述，原有的FAD-GDH存在待改善之处，期望实用性的进一步提高。本发明的课题之一在于响应这种要求。本发明目前的一个课题为提供有关酶的修饰的新型方法。
[0024]作为用于获得实用性高的⑶H的方法，大致有:(1)将现有的⑶H (FAD-GDH,PQQ-GDH )进行修饰的方法、以及(2)将微生物等进行筛选的方法。这些方法大多已有尝试(例如上述专利文献6、7)，今后，与更有效的酶的创造相关的可能性低。鉴于该状况，本发明的发明人等着眼于葡萄糖氧化酶(GO)中没有FAD-GDH所具有的上述问题。已知GO与FAD-GDH的氨基酸序列的同源性比较高。着眼于该同源性，决定采用对GO赋予GDH活性，SP，将GO进行⑶H化这样的新方法。首先,选择来自黑曲霉(Aspergillus niger)的GO,将其氨基酸序列与已知的多种FAD-GDH的氨基酸序列进行多重比对。然后，通过利用比对结果与GO的立体结构数据，从而在位于GO的活性中心附近的氨基酸中，检索出虽然在FAD-GDH间保守(共同性高)，但是在GO与FAD-GDH之间不同的氨基酸。结果是，13处氨基酸位置得到确定。接着，制作在这些氨基酸位置导入突变而得的突变酶，研究其特性，结果认定GDH活性与GO活性的比率(GDH活性/GO活性)上升的突变酶。因此，决定分析该突变酶的序列。由此，成功地确定了对⑶H活性的上升、即⑶H化有效的4处氨基酸位置。该结果一方面启示了在最初确定的13处内，除该4处以外，对GDH活性的上升没有效果。但是，在是通过GO与FAD-GDH的详细比较而发现的氨基酸位置方面没有不同，因此对于其余9处也隐藏着对底物特性、辅酶特异性、温度稳定性等其它特性的改良、改善有用的可能性。此外，通过并用两种以上，也有提高GDH活性、其它特性的可能性。由此，其余9处氨基酸位置也有价值，其活用得到期待。
[0025]另一方面，进一步研究的结果，成功地确定了对⑶H化特别有效的取代位置的组合。在采用该组合时，底物特异性也良好(对木糖的反应性低)。此外，对于最优异的组合，尝试取代的最优化(即，最有效的取代后的氨基酸的确定)，结果对GDH化有效的取代后的氨基酸得到确定，并且发现了带来完全的GDH化的取代后的氨基酸。此外，确认了完全GDH化的突变体的底物特异性也优异(对木糖的反应性低)。
[0026]可是，也经历很多通过将有效果的两种氨基酸突变进行组合而产生相加或协同的效果的可能性高的情况。因此，可以说确定成功的4处突变对象位置不限于单独，关于其组合也对⑶H化有效。
[0027]此外，对于同种酶而言，若鉴于结构(一级结构、立体结构)的相似性高，同样的突变产生同样的效果的概率高这样的技术常识，可以说对于与后述实施例所示的黑曲霉的GO之间结构上的相似性实际上非常高的尼崎青霉(Pen1c1ll1um amagasak1ense)的G0、其它G0，可适用本发明的发明人等发现的突变方法。
[0028]如上所述，本发明的发明人等成功地将GO进行GDH化，创造出GDH活性高的突变型G0。同时，还成功地确定了对GO的突变有效的氨基酸位置。在所得突变型GO中，有的不显示出对木糖的反应性。即，在不显示出对木糖的反应性方面，成功地取得超出现有FAD-GDH的 GDH。
[0029]以上成果一方面证实:在结构相似性高的两种酶之间，将氨基酸序列进行网罗地比较，并且利用活性中心附近的立体结构这样的方法对酶的修饰(特别是，对于修饰对象的酶，赋予其它酶具有的特性或其它酶在更优选的状态下具备的特性)有效。
[0030]以下示出的本发明基于以上成果。
[0031][1] 一种突变酶，由在来自微生物的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列中选自以下(1)~(13)中的一个或两个以上的氨基酸被其它氨基酸取代而得的氨基酸序列所构成:
[0032](1)与序列号1所示的氨基酸序列的115位氨基酸对应的氨基酸；
[0033](2)与序列号1所示的氨基酸序列的131位氨基酸对应的氨基酸；
[0034](3)与序列号1所示的氨基酸序列的132位氨基酸对应的氨基酸；
[0035](4)与序列号1所示的氨基酸序列的193位氨基酸对应的氨基酸；
[0036](5)与序列号1所示的氨基酸序列的353位氨基酸对应的氨基酸；
[0037](6)与序列号1所示的氨基酸序列的436位氨基酸对应的氨基酸；
[0038](7)与序列号1所示的氨基酸序列的446位氨基酸对应的氨基酸；
[0039](8)与序列号1所示的氨基酸序列的472位氨基酸对应的氨基酸；
[0040](9)与序列号1所示的氨基酸序列的511位氨基酸对应的氨基酸；
[0041](10)与序列号1所示的氨基酸序列的535位氨基酸对应的氨基酸；
[0042](11)与序列号1所示的氨基酸序列的537位氨基酸对应的氨基酸； [0043](12)与序列号1所示的氨基酸序列的582位氨基酸对应的氨基酸；
[0044](13)与序列号1所示的氨基酸序列的583位氨基酸对应的氨基酸。
[0045][2]根据[1]所述的突变酶，其中，来自微生物的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列为序列号I或2的氨基酸序列。
[0046][3]根据[I]或[2]所述的突变酶，其中，被取代的氨基酸为(3)的氨基酸、(5)的氨基酸、(7)的氨基酸或(12)的氨基酸、或者选自它们中的两个以上的氨基酸的组合。
[0047][4]根据[3]所述的突变酶，其中，对于(3)的氨基酸，取代后的氨基酸为丙氨酸，对于(5)的氨基酸，取代后的氨基酸为丙氨酸，对于(7)的氨基酸，取代后的氨基酸为组氨酸，对于(12)的氨基酸，取代后的氨基酸为丝氨酸、精氨酸、亮氨酸或脯氨酸。
[0048][5]根据[I]或[2]所述的突变酶，其中，被取代的氨基酸为(3)的氨基酸、(7)的氨基酸或(12)的氨基酸、或者选自它们中的两个以上的氨基酸的组合。
[0049][6]根据[5]所述的突变酶，其中，对于(3)的氨基酸，取代后的氨基酸为丙氨酸，对于(7)的氨基酸，取代后的氨基酸为组氨酸，对于(12)的氨基酸，取代后的氨基酸为丝氨酸，精氨酸、亮氨酸或脯氨酸。
[0050][7]根据[I]或[2]所述的突变酶，其中，被取代的氨基酸为(7)的氨基酸及(12)
的氨基酸。
[0051][8]根据[7]所述的突变酶，其中，对于(7)的氨基酸，取代后的氨基酸为组氨酸，对于(12)的氨基酸，取代后的氨基酸为丝氨酸、精氨酸、亮氨酸或脯氨酸。
[0052][9]根据[I]所述的突变酶，其中，由序列号7~21、59~61中的任一氨基酸序列所构成。
[0053][10] 一种基因，编码[I]~[9]中任一项所述的突变酶。
[0054][11]根据[10]所述的基因,其中，包含序列号22~36、62~64中的任一碱基序列。
[0055][12] 一种重组DNA，包含[10]或[11]所述的基因。
[0056][13] 一种微生物，具有[12]所述的重组DNA。
[0057][14] 一种葡萄糖测定法，其特征在于，使用[I]~[9]中任一项所述的突变酶，测定试样中的葡萄糖。
[0058][15] 一种葡萄糖测定用试剂，其特征在于，包含[I]~[9]中任一项所述的突变酶。
[0059][16] 一种葡萄糖测定用试剂盒，包含[15]所述的葡萄糖测定用试剂。
[0060][17] 一种方法，其特征在于，使用[I]~[9]中任一项所述的突变酶，降低工业制品或其原料中的葡萄糖量。
[0061][18] 一种酶剂，含有[I]~[9]中任一项所述的突变酶。
[0062][19] 一种突变酶的设计方法，包括以下步骤(i)和(ii):
[0063]( i )在突变对象酶的氨基酸序列中，确定选自以下(I)~(13)中的一个或两个以上的氨基酸的步骤，上述突变对象酶为来自微生物的葡萄糖氧化酶或来自微生物的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶:
[0064](I)与序列号I所示的氨基酸序列的115位氨基酸对应的氨基酸；
[0065](2)与序列号I所示的氨基酸序列的131位氨基酸对应的氨基酸；
[0066](3)与序列号I所示的氨基酸序列的132位氨基酸对应的氨基酸；
[0067](4)与序列号I所示的氨基酸序列的193位氨基酸对应的氨基酸；
[0068](5)与序列号I所示的氨基酸序列的353位氨基酸对应的氨基酸；[0069](6)与序列号I所示的氨基酸序列的436位氨基酸对应的氨基酸；
[0070](7)与序列号I所示的氨基酸序列的446位氨基酸对应的氨基酸；
[0071](8)与序列号I所示的氨基酸序列的472位氨基酸对应的氨基酸；
[0072](9)与序列号I所示的氨基酸序列的511位氨基酸对应的氨基酸；
[0073](10)与序列号I所示的氨基酸序列的535位氨基酸对应的氨基酸；
[0074](11)与序列号I所示的氨基酸序列的537位氨基酸对应的氨基酸；
[0075](12)与序列号I所示的氨基酸序列的582位氨基酸对应的氨基酸；
[0076](13)与序列号I所示的氨基酸序列的583位氨基酸对应的氨基酸；
[0077](ii)基于突变对象酶的氨基酸序列，构建在步骤(i)中确定的氨基酸序列被其它氨基酸取代而得的氨基酸序列的步骤。
[0078][20]根据[19]所述的设计方法，其中，突变对象酶为来自微生物的葡萄糖氧化酶，在步骤(i)中被取代的氨基酸为(3)的氨基酸、(5)的氨基酸、(7)的氨基酸或(12)的氨基酸、或者选自它们中的两个以上的氨基酸的组合。
[0079][21]根据[19]所述的设计方法，其中，突变对象酶为来自微生物的葡萄糖氧化酶，在步骤(i)中被取代的氨基酸为(3)的氨基酸、(7)的氨基酸或(12)的氨基酸、或者选自它们中的两个以上的氨 基酸的组合。
[0080][22]根据[19]所述的设计方法，其中，突变对象酶为来自微生物的葡萄糖氧化酶，在步骤(i)中被取代的氨基酸为(7)的氨基酸及(12)的氨基酸。
[0081][23]根据[20]~[22]中任一项所述的设计方法，其中，来自微生物的葡萄糖氧化酶为黑曲霉(Aspergillus niger)或尼崎青霉(Penicillium amagasakiense)的葡萄糖氧化酶。
[0082][24]根据[23]所述的设计方法，其中，葡萄糖氧化酶的氨基酸序列为序列号I或2的氨基酸序列。
[0083][25]根据[19]所述的设计方法,其中，突变对象酶为意大利青霉(Penicilliumitalicum)、薄刺青霉(Penicillium lilacinoechinulatum)、米曲霉(Aspergillusoryzae)或土曲霉(Aspergillus terreus)的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶。
[0084][26]根据[25]所述的设计方法，其中，黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列为序列号3~6中的任一氨基酸序列。
[0085][27] 一种突变酶的制备方法，包括以下步骤(1)~(III):
[0086](I)制备将序列号7~21、59~61中的任一氨基酸序列、或由[19]~[26]中任一项所述的设计方法构建的氨基酸序列进行编码的核酸的步骤；
[0087](II)使所述核酸进行表达的步骤，及
[0088](III)回收表达产物的步骤。
【专利附图】

【附图说明】
[0089]图1为来自黑曲霉的GO的氨基酸序列与来自尼崎青霉的GO的氨基酸序列的比较。用下划线表示突变对象的氨基酸。用粗体字表示在突变对象的氨基酸中对GDH活性提闻有效的氣基酸。箭头为活性中心的氣基酸。表不同一(identical), “: ”表不保守性取代(conserved substitutions), ” 表不半保守性取代(sem1-conservedsubstitutions)。
[0090]图2为来自微生物的GO与来自微生物的FAD-GDH的氨基酸序列的比较。从上段开始依次表示意大利青霉FAD-GDH的氨基酸序列(序列号3的N末端侧部分)、薄刺青霉FAD-GDH的氨基酸序列(序列号4的N末端侧部分)、米曲霉FAD-GDH的氨基酸序列(序列号5的N末端侧部分)、土曲霉FAD-GDH的氨基酸序列(序列号6的N末端侧部分)、黑曲霉GO的氨基酸序列(序列号I的N末端侧部分)。用下划线表示在处于GO的活性中心附近的氨基酸中，在FAD-GDH间保守(共同性高)而在GO与FAD-GDH之间不同的氨基酸，并且从N末端侧依次附加序号。
[0091]图3为来自微生物的GO与来自微生物的FAD-GDH的氨基酸序列的比较(图1的接续)。从上段开始依次表示意大利青霉FAD-GDH的氨基酸序列(序列号3的C末端侧部分)、薄刺青霉FAD-GDH的氨基酸序列(序列号4的C末端侧部分)、米曲霉FAD-GDH的氨基酸序列(序列号5的C末端侧部分)、土曲霉FAD-GDH的氨基酸序列(序列号6的C末端侧部分)、黑曲霉GO的氨基酸序列(序列号I的C末端侧部分)。用下划线表示在处于GO的活性中心附近的氨基酸中，在FAD-GDH间保守(共同性高)而在GO与FAD-GDH之间不同的氨基酸，从N末端侧依次附加序号。箭头为GO的活性中心的氨基酸。
[0092]图4为包含用PCR扩增的黑曲霉GO的基因序列的序列(序列号37)。在Y末端添加HindIII位点(框线)与Kozak序列(下划线),在3'末端侧添加XhoI位点(框线)。应予说明，通过添加Kozak序列，第2个氨基酸从谷氨酰胺变更成丝氨酸。黑曲霉GO的基因序列如序列号38所示。
[0093]图5为平板测 定法的结果。制作包含导入突变的质粒的文库(酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)),将生长的菌落在表达平板中复制后,用平板测定法检测GO活性及⑶H活性。
[0094]图6为表示液体培养中的活性确认的结果。对于突变酶转化株内可确认阳性菌落(在GO测定中不发色，在GDH测定中发色)的转化株进行液体培养，比较GO活性及GDH活性。与未突变(PYES-GO)进行比较，用网纹表示⑶H活性值及⑶H活性与GO活性之比(⑶H活性/GO活性)同时高的转化株。表中的pYES-GO表示未突变的转化株，表中的pYES2表示用插入基因前的质粒转化而得的转化株，表中的GO表示GO “Amano”2 (天野酶公司)，表中的FAD-GDH表示⑶H “Amano ” 8 (天野酶公司)。
[0095]图7为表示用液体培养的活性确认的结果的图表。用条形表示各突变酶转化株的GOH活性及GO活性，用折线表示⑶H活性/GO活性。pYES-GO表示未突变的转化株。图表中的pYES-GO表示未突变的转化株，图表中的pYES2表示用插入基因前的质粒转化而得的转化株，图表中的GO表示GO “Amano”2 (天野酶公司)，图表中的FAD-GDH表示⑶H “Amano”8(天野酶公司)。
[0096]图8为表示确认⑶H/G0活性比变化大的突变酶转化株的突变的表。推测5-1-5的T353H起因于混合。同样，推测7-2-17的D446S及7_2_42的D446R也起因于混合。
[0097]图9为表示突变型GO的底物特异性的图表。以对葡萄糖的反应性的相对值的形式，算出对各底物的反应性。pYES-GO表示未突变的转化株。
[0098]图10为表示在各酶中的突变对象氨基酸的表。对各酶均表示了(I)与序列号I所示的氨基酸序列的115位氨基酸对应的氨基酸，(2)与序列号I所示的氨基酸序列的131位氨基酸对应的氨基酸，(3)与序列号I所示的氨基酸序列的132位氨基酸对应的氨基酸，
(4)与序列号I所示的氨基酸序列的193位氨基酸对应的氨基酸，(5)与序列号I所示的氨基酸序列的353位氨基酸对应的氨基酸，(6)与序列号I所示的氨基酸序列的436位氨基酸对应的氨基酸，(7)与序列号I所示的氨基酸序列的446位氨基酸对应的氨基酸，(8)与序列号I所示的氨基酸序列的472位氨基酸对应的氨基酸，(9)与序列号I所示的氨基酸序列的511位氨基酸对应的氨基酸，(10)与序列号I所示的氨基酸序列的535位氨基酸对应的氨基酸，(11)与序列号I所示的氨基酸序列的537位氨基酸对应的氨基酸，(12)与序列号I所示的氨基酸序列的582位氨基酸对应的氨基酸，(13)与序列号I所示的氨基酸序列的583位氨基酸对应的氨基酸。
[0099]图11为多重突变型GO的活性的比较。以培养上清为样品，将突变组合不同的各种转化株的GDH/G0活性比进行比较。用〇表示各突变酶转化株具有的突变。
[0100]图12为具有有效突变的组合的突变酶转化株产生的突变型酶的比活性。用〇表示各突变酶转化株具有的突变。
[0101]图13为具有有效突变的组合的突变酶转化株产生的突变型酶的底物特异性。比较对麦芽糖、木糖、果糖、半乳糖、甘露糖及乳糖的反应性。
[0102]图14为D446及V582多重突变酶的活性的比较。对于取代后的氨基酸不同的各种酶，比较⑶H/G0活性比。*:G0活性为检测限以下。
[0103]图15为D446H及V582P多重突变酶的底物特异性。将对麦芽糖、木糖、果糖、半乳糖、甘露糖及乳糖 的反应性与FAD-GDH (⑶H “Amano”8 (天野酶公司))进行比较。
【具体实施方式】
[0104]为了便于说明，对于用于本发明的用语的一部分，定义如下。
[0105](用语)
[0106]用语“突变酶”为利用本说明书公开的方法将“基础酶”进行突变乃至修饰而得到的酶。“突变酶”、“突变型酶”及“修饰型酶”可交换使用。基础酶典型地为野生型酶。但是，并不妨碍将已经被施加人工操作的酶作为“基础酶”而适用于本发明。应予说明，在本说明书中，“基础酶”也被称作“突变对象酶”或“靶标酶”。
[0107]将使某种酶(为了便于说明称作A酶)与其它酶(为了便于说明称作B酶)近似，SP，以使A酶的一种以上的特性与B酶的对应特性接近的方式进行修饰称作“将A酶进行B酶化”。这里的“特性”的示例为酶活性(例如在A酶为葡萄糖氧化酶的情况下的葡萄糖氧化酶活性)、底物特异性、温度特性(最适温度、温度稳定性等)、PH特性(最适pH、pH稳定性)、辅酶特异性、与介质的反应性。
[0108](使葡萄糖氧化酶进行突变而得的酶)
[0109]本发明的第I方面涉及使来自微生物的葡萄糖氧化酶(GO)进行突变而得的酶(以下也称作“突变G0”)。本发明突变GO具有在来自微生物的GO (突变对象酶)的氨基酸序列中选自以下(I)~(13)中的一个或两个以上的氨基酸被其它氨基酸取代而得的氨基酸序列。
[0110](I)与序列号I所示的氨基酸序列的115位氨基酸对应的氨基酸
[0111](2)与序列号I所示的氨基酸序列的131位氨基酸对应的氨基酸[0112](3)与序列号I所示的氨基酸序列的132位氨基酸对应的氨基酸
[0113](4) 与序列号I所示的氨基酸序列的193位氨基酸对应的氨基酸
[0114](5)与序列号I所示的氨基酸序列的353位氨基酸对应的氨基酸
[0115](6)与序列号I所示的氨基酸序列的436位氨基酸对应的氨基酸
[0116](7)与序列号I所示的氨基酸序列的446位氨基酸对应的氨基酸
[0117](8)与序列号I所示的氨基酸序列的472位氨基酸对应的氨基酸
[0118](9)与序列号I所示的氨基酸序列的511位氨基酸对应的氨基酸
[0119](10)与序列号I所示的氨基酸序列的535位氨基酸对应的氨基酸
[0120](11)与序列号I所示的氨基酸序列的537位氨基酸对应的氨基酸
[0121](12)与序列号I所示的氨基酸序列的582位氨基酸对应的氨基酸
[0122](13)与序列号I所示的氨基酸序列的583位氨基酸对应的氨基酸
[0123]如后述实施例所示，上述115位氨基酸、131位氨基酸、132位氨基酸、193位氨基酸、353位氨基酸、436位氨基酸、446位氨基酸、472位氨基酸、511位氨基酸、535位氨基酸、537位氨基酸、582位氨基酸及583位氨基酸为通过将黑曲霉的GO与多种FAD-GDH进行比较而发现的氨基酸，处于GO的活性中心附近且具有GO特征性。在本发明中，通过使被认为对GO特性起到重要作用的与这些氨基酸对应的氨基酸进行突变，从而实现酶特性的改良、改善。
[0124]在此，在本说明书中对于氨基酸残基使用时的用语“对应”是指在被比较的蛋白质(酶)间对其功能的发挥作出同等贡献。例如，对于基准氨基酸序列(即，序列号I的氨基酸序列)，将比较对象的氨基酸序列在考虑一级结构(氨基酸序列)的部分同源性的同时，以能够进行最优比较的方式进行排列时(此时可以根据需要导入空位(gap)而使比对最优化)，可将与基准氨基酸序列中的特定氨基酸对应的位置的氨基酸确定为“对应的氨基酸”。也可代替一级结构彼此的比较而利用立体结构(三次元结构)彼此的比较，或者不仅利用一级结构彼此的比较，而且还利用立体结构(三次元结构)彼此的比较，确定“对应的氨基酸”。通过利用立体结构信息，可得到可靠性高的比较结果。在该情况下，可采用在将多种酶的立体结构的原子坐标进行比较的同时进行比对的方法。突变对象酶的立体结构信息例如可由蛋白质数据库(Protein Data Bank) (http://www.pdbj.0rg/index_j.html)取得。
[0125]利用X射线晶体结构分析的蛋白质立体结构的决定方法的一例如下所示。
[0126](I)将蛋白质进行结晶化。为了确定立体结构，结晶化不可缺少，但除此以外，作为蛋白质的高纯度的纯化法、高密度且稳定的保存方法，也有产业上的有用性。在该情况下，优选将作为配体结合有底物或者其类似化合物的蛋白质进行结晶化。
[0127](2)对制成的结晶照射X射线，收集衍射数据。应予说明，蛋白质结晶因X射线照射而受到损害并使衍射能劣化的情形有很多。在该情况下，将结晶急剧地冷却至_173°C左右，在该状态下收集衍射数据的低温测定技术最近逐渐普及。应予说明，为了最终收集用于确定结构的高分解能数据，亮度高的同步加速器放射光得到利用。
[0128](3)在进行晶体结构分析时，除了衍射数据以外，还需要相位信息。对于目标蛋白质，在不知道类似的蛋白质的晶体结构时，不可能用分子取代法确定结构，必须利用重原子同晶取代法解决相位问题。重原子同晶取代法为如下方法:将汞、钼等原子序号大的金属原子导入结晶中，利用金属原子的大X射线散射能对X射线衍射数据的贡献而得到相位信息的方法。决定的相位可通过将结晶中的溶剂区域的电子密度平滑化而进行改善。溶剂区域的水分子由于波动大而几乎观测不到电子密度，因此通过使该区域的电子密度近似于O，从而能够接近真正的电子密度，乃至相位得到改善。此外，在非对称单元中包含多种分子时，通过将这些分子的电子密度进行平均化，从而相位得到更大幅度的改善。使蛋白质模型符合使用这样改善的相位计算出的电子密度图。该工艺在计算机绘图的基础上使用MSI公司(美国)的QUANTA等程序进行。然后，使用MSI公司的X-PLOR等程序，进行结构精密化，完成结构分析。对于目标蛋白质，在类似的蛋白质的晶体结构是已知的情况下，使用已知蛋白质的原子坐标，利用分子取代法可进行决定。分子取代与结构精密化可用程序CNS_S0LVEver.11等进行。
[0129]突变对象酶即来自微生物的GO的示例为来自黑曲霉的GO及来自尼崎青霉的G0。在公共数据库中登记的来自黑曲霉的GO的氨基酸序列及来自尼崎青霉的GO的氨基酸序列分别如序列号I及序列号2所示。此外，这两种氨基酸序列的比对比较如图1所示。
[0130]在以具有序列号I的氨基酸序列的来自黑曲霉的GO为突变对象酶时，上述(I)的氨基酸为序列号I的115位氨基酸，上述(2)的氨基酸为序列号I的131位氨基酸，上述(3)的氨基酸为序列号I的132位氨基酸，上述(4)的氨基酸为序列号I的193位氨基酸，上述
(5)的氨基酸为序列号I的353位氨基酸，上述(6)的氨基酸为序列号I的436位氨基酸，上述(7)的氨基酸为序列号I的446位氨基酸，上述(8)的氨基酸为序列号I的472位氨基酸，上述(9)的氨基酸为序列号I的511位氨基酸，上述(10)的氨基酸为序列号I的535位氨基酸，上述(11)的氨基酸为序列号I的537位氨基酸，上述(12)的氨基酸为序列号I的582位氨基酸，上述(13)的氨基酸为序列号I的583位氨基酸。
[0131]另一方面，在以具有序列号2的氨基酸序列的来自尼崎青霉的GO为突变对象酶时，上述(I)的氨基酸为序 列号2的115位氨基酸，上述(2)的氨基酸为序列号2的131位氨基酸，上述(3)的氨基酸为序列号2的132位氨基酸，上述(4)的氨基酸为序列号2的193位氨基酸，上述(5)的氨基酸为序列号2的353位氨基酸，上述(6)的氨基酸为序列号2的436位氨基酸，上述(7)的氨基酸为序列号2的446位氨基酸，上述(8)的氨基酸为序列号2的472位氨基酸，上述(9)的氨基酸为序列号2的511位氨基酸，上述(10)的氨基酸为序列号2的535位氨基酸，上述(11)的氨基酸为序列号2的537位氨基酸，上述(12)的氨基酸为序列号2的582位氨基酸，上述(13)的氨基酸为序列号2的583位氨基酸。
[0132]被取代的氨基酸优选为(3)的氨基酸、(5)的氨基酸、(7)的氨基酸或(12)的氨基酸。这些如后述实施例所示，为对⑶H活性的提高有效得到确认的氨基酸。在这些氨基酸中的至少一个被取代的突变GO中，与突变前的酶相比能够发挥高的GDH活性。(3)的氨基酸被取代的突变GO的具体例为由序列号7的氨基酸序列所构成的酶。同样，(5)的氨基酸被取代的突变GO的具体例为由序列号8的氨基酸序列所构成的酶，(7)的氨基酸被取代的突变GO的具体例为由序列号9的氨基酸序列所构成的酶，(12)的氨基酸被取代的突变GO的具体例为由序列号10的氨基酸序列所构成的酶。这些突变GO均与突变前的酶即来自黑曲霉的GO相比显示出高的⑶H活性。
[0133]取代后的氨基酸的种类没有特别限定，但优选以不属于所谓“保守性氨基酸取代”的方式，选择取代后的氨基酸。这里的“保守性氨基酸取代”是指将某种氨基酸残基取代成具有同样性质的侧链的氨基酸残基。氨基酸残基根据其侧链而分成碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、非带电极性侧链(例如甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸，苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)之类的若干族。保守性氨基酸取代典型地为同一族内的氨基酸残基间的取代。
[0134]若举出取代后的氨基酸的示例，对于(3)的氨基酸而言为丙氨酸，对于(5)的氨基酸而言为丙氨酸，对于(7)的氨基酸而言为组氨酸，对于(12)的氨基酸而言为丝氨酸，精氨酸、亮氨酸及脯氨酸。
[0135]上述(I)~(13)的氨基酸内，两种以上的氨基酸可得到取代。如下列举出被取代的氨基酸的组合的示例。
[0136](3)与(5)的组合
[0137](3)与(7)的组合
[0138](3)与(12)的组合
[0139](5)与(7)的组合
[0140](5)与(12)的组合 [0141](7)与(12)的组合
[0142](3)、(5)与(7)的组合
[0143](3)、(5)与(12)的组合
[0144](3)、(7)与(12)的组合
[0145](5)、(7)与(12)的组合
[0146](3)、(5)、(7)与(12)的组合
[0147]应用以上的组合而得到的突变酶的氨基酸序列的示例如序列号11~21所示。这些序列为针对黑曲霉的GO应用上述组合而得到的突变GO的氨基酸序列。序列号与突变的组合的对应关系如下所述。
[0148]序列号11: (3)与(5)的组合
[0149]序列号12: (3)与(7)的组合
[0150]序列号13: (3)与(12)的组合
[0151]序列号14: (5)与(7)的组合
[0152]序列号15: (5)与(12)的组合
[0153]序列号16: (7)与(12)的组合
[0154]序列号17: (3)、(5)与(7)的组合
[0155]序列号18: (3)、(5)与(12)的组合
[0156]序列号19: (3)、(7)与(12)的组合
[0157]序列号20: (5)、(7)与(12)的组合
[0158]序列号21: (3)、(5)、(7)与(12)的组合
[0159]序列号59: (7)与(12)的组合
[0160]序列号60: (7)与(12)的组合
[0161]序列号61: (7)与(12)的组合
[0162]若按照后述实施例(确认突变组合的效果)中表示的实验结果，则在以上组合中，优选(3)与(12)的组合，(7)与(12)的组合，及(3)、(7)与(12)的组合。特别优选的组合为(7)与(12)的组合(该组合的突变酶的氨基酸序列的具体例如上所述为序列号16、59~61)。取代后的氨基酸对于(7)而言优选组氨酸，对于(12)而言优选丝氨酸(序列号16)、精氨酸(序列号59 )、亮氨酸(序列号60 )或脯氨酸(序列号61)。对于(12 )，特别优选取代后的氨基酸为脯氨酸。
[0163]不过，一般而言，在使某种蛋白质的氨基酸序列的一部分进行突变时，有时突变后的蛋白质具有与突变前的蛋白质同等的功能。即，有时氨基酸序列的突变对于蛋白质的功能未带来实质性的影响，蛋白质的功能在突变前后得以维持。若考虑到该技术常识，则在与由选自上述(I)~(13)中的一个或两个以上的氨基酸被其它氨基酸取代而得的氨基酸序列所构成的突变GO进行比较时，虽然氨基酸序列的稍微不同未被确认(其中，氨基酸序列的不同在实施了上述氨基酸取代的位置以外的位置发生)，但是特性中实质性的差异未被确认的酶可被认为是与上述突变GO实质同一的酶。这里的“氨基酸序列的稍微不同”典型地是指利用构成氨基酸序列的I~数个(上限为例如3个、5个、7个、10个)氨基酸的缺失、取代，或者I个~数个(上限为例如3个、5个、7个、10个)氨基酸的添加、插入、或这些组合而在氨基酸序列中产生突变(变化)。“实质同一的酶”的氨基酸序列与作为基准的上述突变GO的氨基酸序列的同一性(％)优选为90%以上，更优选为95%以上，进一步优选为98%以上，最优选为99%以上。应予说明，氨基酸序列的不同可以在多个位置产生。“氨基酸序列的稍微不同”优选由保守性氨基酸取代产生。
[0164](编码突变GO的核酸等)
[0165]本发明的第2方面提供与本发明突变GO相关的核酸。即，提供能够作为用于鉴别编码突变GO的基因、编码突变GO的核酸的探针使用的核酸；能够作为用于使编码突变GO的核酸扩增或突变等的引 物使用的核酸。
[0166]编码突变GO的基因典型地用于突变GO的制备。根据使用编码突变GO的基因的基因工程学的制备方法，可得到更均质状态的突变G0。此外，该方法在制备大量的突变GO时也可以说是优选的方法。此外，编码突变GO的基因的用途不限于突变GO的制备。例如，作为以突变GO作用机制的解释等为目的的实验用工具，或者作为用于设计或制作酶的进一步的突变体的工具，也可利用该核酸。
[0167]在本说明书中，所谓“编码突变GO的基因”是指在使该基因表达时得到该突变GO的核酸，当然包含具有与该突变GO的氨基酸序列对应的碱基序列的核酸，还包含在这种核酸中附加有不编码氨基酸序列的序列而成的核酸。此外，还考虑密码子的简并。
[0168]编码突变GO的基因的序列的示例如序列号22~36、62~64所示。这些序列为编码在黑曲霉的GO中实施了特定的氨基酸取代而得的突变GO的基因。各序列中的氨基酸取代如下所述。
[0169]序列号22:T132A
[0170]序列号23 =T353A
[0171]序列号24:D446H
[0172]序列号25:V582S
[0173]序列号26:T132A 及 T353A
[0174]序列号27:T132A 及 D446H[0175]序列号28:T132A 及 V582S
[0176]序列号29:T353A 及 D446H
[0177]序列号30:T353A 及 V582S
[0178]序列号31:D446H 及 V582S
[0179]序列号32:T132A、T353A 及 D446H
[0180]序列号33:T132A、T353A 及 V582S
[0181]序列号34:T132A、D446H 及 V582S
[0182]序列号35:T353A、D446H 及 V582S
[0183]序列号36:T132A、T353A、D446H 及 V582S
[0184]序列号62:D446H 及 V582R
[0185]序列号63:D446H 及 V582L
[0186]序列号64:D446H 及 V582P
[0187]本发明的核 酸可参考本说明书或所附序列表公开的序列信息，通过使用标准的基因工程学方法、分子生物学方法、生物化学方法等，制备成分离状态。
[0188]在本发明的其它方式中，提供了一种核酸，其在与编码本发明突变GO的基因的碱基序列相比时，虽然其编码的蛋白质的功能相同，但是一部分碱基序列不同(以下，也称作“同源核酸”。此外，将规定同源核酸的碱基序列也称作“同源碱基序列”)。作为同源核酸的示例，可举出如下编码如下蛋白质的DNA，所述蛋白质由以编码本发明突变GO的核酸的碱基序列为基准来包含I个或者多个碱基的取代、缺失、插入、添加、或倒位的碱基序列所构成，且具有突变GO特征性的酶活性(即，GDH活性)。碱基的取代、缺失等可在多个部位产生。这里的“多个”根据该核酸编码的蛋白质的立体结构中的氨基酸残基的位置、种类不同而异，例如为2~40个碱基，优选为2~20个碱基，更优选为2~10个碱基。
[0189]如上所述的同源核酸例如可以如下得到:限制性内切酶处理；利用核酸外切酶、DNA连接酶等的处理；利用定位突变导入法(Molecular Cloning, Third Edition,Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)、随机突变导入法(Molecular Cloning, Third Edition, Chapterl3, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, New York)的突变导入等。此外,通过紫外线照射等其它方法也可得到同源核酸。
[0190]本发明的其它方式涉及一种核酸，其具有相对于编码本发明突变GO的基因的碱基序列互补的碱基序列。本发明的进一步其它方式提供一种核酸，其具有相对于编码本发明突变GO的基因的碱基序列或者与其互补的碱基序列为至少约60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.9%同一的喊基序列。
[0191]本发明的进一步其它方式涉及一种核酸，其具有相对于编码本发明突变GO的基因的喊基序列或与其同源喊基序列互补的喊基序列在严谨型条件下进行杂交的喊基序列。这里的“严谨型条件”是指形成所谓特异性杂交而不形成非特异性杂交的条件。这样的严谨型条件是本领域技术人员公知的，例如可参照Molecular Cloning (Third Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)、 Current protocols in molecularbiology (edited by Frederick M.Ausubel et al., 1987)进行设定。作为严谨型条件，例如可举出用杂交液(50% 甲醛、10XSSC(0.15M NaCl、15mM 柠檬酸钠，pH7.0)、5XDenhardt溶液、1%SDS、10%硫酸葡聚糖、10μ g/ml的变性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5)),在约42°C~约50°C下进行温育，然后用0.1XSSC、0.1%SDS在约65°C~约70°C下清洗的条件。作为进一步优选的严谨型条件，例如可举出，作为杂交液，使用50%甲醛、5XSSC(0.15MNaClU5mM 柠檬酸钠，pH7.0)、I XDenhardt 溶液、1%SDS、10% 硫酸葡聚糖、10 μ g/ml 的变性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))的条件。
[0192]本发明的进一步其它方式提供了一种核酸(核酸片段)，其具有编码本发明突变GO的基因的碱基序列或者与其互补的碱基序列的一部分。这种核酸片段可用于将具有编码本发明突变GO的基因的碱基序列的核酸等进行检测、鉴别和/或扩增等。核酸片段例如以如下方式设计:在编码本发明突变GO的基因的碱基序列中连续的核苷酸部分(例如约10~约100碱基长度，优选约20~约100碱基长度，更优选约30~约100碱基长度)中至少包含杂交部分。在用作探针时，可标记核酸片段。在标记中例如可使用荧光物质、酶、放射性同位素。
[0193]本发明的进一步其它方式涉及包含本发明的基因(编码突变GO的基因)的重组DNA。本发明的重组DNA例如以载体的形态提供。在本说明书中用语“载体”是指能够将插入其中的核酸输送到靶标内的核酸性分子。
[0194]根据使用目的(克隆、蛋白质的表达)，此外考虑宿主细胞的种类而选择适当的载体。作为大肠菌为宿主的载体，可例示M13噬菌体或其修饰体、λ噬菌体或其修饰体、pBR322或其修饰体(pB325、pAT153、pUC8等)等，作为以酵母为宿主的载体，可例示pYepSecUpMFa, pYES2等，作为以昆虫细胞为宿主的载体，可例示pAc、pVL等，作为以哺乳类细胞为宿主的载体，可例示PCDM8、pMT2PC等。
[0195]本发明的载体优选为表达载体。“表达载体”是指能够将插入其中的核酸导入到目标细胞(宿主细胞)内，且能够使之在该细胞内进行表达的载体。表达载体通常包含对所插入的核酸的表达必需的启动子序列、促进表达的增强子序列等。也可以使用包含选择标记的表达载体。在使用该表达载体时，可利用选择标记而确认表达载体导入的有无(及其程度)。
[0196]本发明的核酸向载体的插入、选择标记基因的插入(必要时)、启动子的插入(必要时)等可使用标准的重组DNA技术(例如，可参照Molecular Cloning, Third Edition, 1.84,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 的、使用限制性内切酶及 DNA 连接酶的公知方法)进行。
[0197]作为宿主细胞，从操作容易方面考虑，优选使用大肠菌(Escherichia coli)、芽殖酵母(Saccharomyces cerevisiae)等微生物，但只要是重组DNA可复制且突变GO的基因可表达的宿主细胞则可利用。作为大肠菌的示例，在利用T7系启动子时，可举出大肠菌BL21(DE3)pLysS，在并非这样时可举出大肠菌JM109。此外，作为芽殖酵母的示例，可举出芽殖酵母SHY2、芽殖酵母AH22或者芽殖酵母INVScl (Invitrogen公司)。
[0198]本发明的其它方面涉及具有本发明重组DNA的微生物(B卩，转化体)。本发明的微生物可利用使用上述本发明载体的转染乃至转化而得到。例如，可利用氯化钙法(Journalof Molecular Biology (J.Mol.Biol.)、第 53 卷，第 159 页(1970))、Hanahan 法(Journalof Molecular Biology,第 166 卷，第 557 页(1983))、SEM 法(基因(Gene),第 96 卷，第23 页(1990)〕，Chung 等的方法(Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America,第 86 卷,第 2172 页(1989))、憐酸钙共沈降法、电穿孔(Potter，H.et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.81, 7161-7165 (1984))、脂质转染法(Feigner, P.L.et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.84, 7413-7417 (1984))等实施。应予说明，本发明的微生物可用于生产本发明的突变GO (参照后述突变酶的制备方法栏)。
[0199](突变GO的用途)
[0200]本发明的第3方式涉及突变GO的用途。在该方式中，首先提供了使用突变GO的葡萄糖测定法。在本发明的葡萄糖测定法中，利用由本酶所致的氧化还原反应，测定试样中的葡萄糖量。本发明例如用于血糖值的测定、食品(调味料、饮料等)中的葡萄糖浓度的测定等。此外，在发酵食品(例如食醋)或发酵饮料(例如啤酒、酒)的制造工序中为了研究发酵度，也可利用本发明。
[0201]本发明还提供了包含本酶的葡萄糖测定用试剂。该试剂用于上述本发明的葡萄糖测定法中。
[0202]本发明进一步提供了用于实施本发明的葡萄糖测定法的试剂盒(葡萄糖测定用试剂盒)。本发明的试剂盒除了包含本酶的葡萄糖测定用试剂以外，还包含反应用试剂、缓冲液、葡萄糖标准液等作为任意要素。此外，在本发明的葡萄糖测定试剂盒中通常附有使用说明书。
[0203]本发明作为进一步的用途，提供了通过使本发明的突变GO对工业制品(各种加工食品、点心类、清凉饮料水、醇饮料、营养辅助食品等食品；化妆材料等)或其原料等进行作用而使葡萄糖含量降低的方法及用于该用途的酶剂。例如，在将本发明突变GO应用于食品时，可通过降低葡萄糖含量而抑制美拉德反应。本发明的酶剂除了有效成分(突变G0)以外，还可含有赋形剂、缓冲剂、混悬剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等。作为赋形剂，可使用淀粉、糊精、麦芽糖、 海藻糖、乳糖、D-葡萄糖、山梨醇、D-甘露糖醇、白糖、甘油等。作为缓冲剂，可使用磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐等。作为稳定剂，可使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可使用苯酚、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可使用乙醇、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。
[0204](突变酶的设计方法)
[0205]本发明的另一方面涉及突变酶的设计方法。在本发明的设计方法中，实施以下步骤(i)及(ii)。
[0206]步骤(i):在来自微生物的葡萄糖氧化酶(来自微生物的G0)或来自微生物的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(来自微生物的FDA-GDH)即突变对象酶的氨基酸序列中，确定选自如下的一个或两个以上的氨基酸。
[0207](I)与序列号I所示的氨基酸序列的115位氨基酸对应的氨基酸
[0208](2)与序列号I所示的氨基酸序列的131位氨基酸对应的氨基酸
[0209](3)与序列号I所示的氨基酸序列的132位氨基酸对应的氨基酸
[0210](4)与序列号I所示的氨基酸序列的193位氨基酸对应的氨基酸
[0211](5)与序列号I所示的氨基酸序列的353位氨基酸对应的氨基酸
[0212](6)与序列号I所示的氨基酸序列的436位氨基酸对应的氨基酸
[0213](7)与序列号I所示的氨基酸序列的446位氨基酸对应的氨基酸
[0214](8)与序列号I所示的氨基酸序列的472位氨基酸对应的氨基酸
[0215](9)与序列号I所示的氨基酸序列的511位氨基酸对应的氨基酸[0216](10)与序列号I所示的氨基酸序列的535位氨基酸对应的氨基酸
[0217](11)与序列号I所示的氨基酸序列的537位氨基酸对应的氨基酸
[0218](12)与序列号I所示的氨基酸序列的582位氨基酸对应的氨基酸
[0219](13)与序列号I所示的氨基酸序列的583位氨基酸对应的氨基酸
[0220]上述取代对象氨基酸(I)~(13)是利用来自微生物的GO与多种来自微生物的FAD-GDH的比较而发现的。期待通过取代这些氨基酸而使酶的特性发生变化。若列举能够变化的特性的示例，则为GO活性、GDH活性、底物特异性、温度特性(最适温度、温度稳定性等)、pH特性(最适pH、pH稳定性)、辅酶特异性、与介质的反应性。
[0221]本发明设计方法中的突变对象酶为来自微生物的GO或来自微生物的FAD-GDH。突变对象酶典型地为野生型酶(天然发现的酶)。但是，并不妨碍以已经实施有某种突变乃至修饰的酶为突变对象酶。来自微生物的GO的示例为黑曲霉的GO及尼崎青霉的G0，来自微生物的FAD-GDH的示例为意大利青霉的FAD-GDH、薄刺青霉的FAD-GDH、米曲霉的FAD-GDH及土曲霉的FAD-GDH。作为在此例示的酶的氨基酸序列，在公共数据库中登记的序列如下所示。应予说明，在优选的一个方式中，以由其中的任意氨基酸序列所构成的酶作为突变对象酶。
[0222]黑曲霉(Aspergillus niger)的GO:序列号I的氨基酸序列
[0223]尼崎青霉(Penicillium amagasakiense)的GO:序列号2的氨基酸序列
[0224]意大利青霉(Penicillium italicum)的FAD-GDH:序列号3的氨基酸序列
[0225]薄刺青霉(PenicilliumIilacinoechinulatumMtJFAD-GDH:序列号 4 的氨基酸序列
[0226]米曲霉(Aspergillus oryzae)的FAD-GDH:序列号5的氨基酸序列
[0227]土曲霉(Aspergillus terreus)的FAD-GDH:序列号6的氨基酸序列
[0228]应予说明，对于以上例示的各酶，将属于上述(I)~(13)的氨基酸的氨基酸汇总不于图10的表中。
[0229]本发明中在步骤(i)后，进行以下步骤(ii)。
[0230]步骤(ii ):基于突变对象酶的氨基酸序列，构成在步骤(? )中确定的氨基酸序列被其它氨基酸取代的氨基酸序列。
[0231]取代后的氨基酸的种类没有特别限定。因此，可以为保守性氨基酸取代，也可以为非保守性氨基酸取代。这里的“保守性氨基酸取代”是指将某种氨基酸残基取代成具有同样性质的侧链的氨基酸残基。氨基酸残基根据其侧链可分成碱基性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、非带电极性侧链(例如天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)之类的若干族。保守性氨基酸取代优选为同一族内的氨基酸残基间的取代。
[0232](突变酶的制备方法)
[0233]本发明的另一方式涉及突变酶的制备方法。在本发明的突变酶制备方法的一个方式中，将本发明的发明人等成功取得的突变GO用基因工程学方法进行制备。在该方式的情况下，准备编码序列号7~10的任意氨基酸序列的核酸(步骤(1))。在此，“编码特定的氨基酸序列的核酸”是在使之表达的情况下可得到具有该氨基酸序列的多肽的核酸，当然可以是由与该氨基酸序列对应的碱基序列所构成的核酸，也可以在这样的核酸中添加多余的序列(可以为编码氨基酸序列的序列，也可以为不编码氨基酸序列的序列)。此外，还考虑到密码子的简并。“编码序列号7~10的任意氨基酸序列的核酸”为参考本说明书或所附序列表公开的序列信息，通过使用标准的基因工程学方法、分子生物学方法、生物化学方法等，可制备成分离状态。在此，序列号7~10的氨基酸序列均为对来自黑曲霉的GO的氨基酸序列实施突变而得的。因此，对于编码来自黑曲霉的GO的基因(序列号38)，通过施加必要的突变，也可得到编码序列号7~10中的任意氨基酸序列的核酸(基因)。用于位置特异性碱基序列取代的方法在该【技术领域】中已知有很多(例如，参照Molecular Cloning, ThirdEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York),可由其中选择使用恰当的方法。作为位置特异性突变导入法，可采用位置特异性氨基酸饱和突变法。位置特异性氨基酸饱和突变法为基于蛋白的立体结构，推定所要求的功能的关联位置，导入氨基酸饱和突变的“半推理半随机(Sem1-rational, sem1-random)” 方法(J.Mol.Biol.331, 585-592(2003))。例如，可使用 Quick change (Stratagene 公司)等试剂盒、Overlap extentionPCR (Nucleic Acid Res.16,7351-7367 (1988))而导入位置特异性氨基酸饱和突变。用于PCR的DNA聚合酶可使用Taq聚合酶等。但是，优选使用K0D-PLUS-(东洋纺社)、Pfu turbo(Stratagene公司)等精度高的DNA聚合酶。
[0234]在本发明的其它一方式中，基于利用本发明的设计方法设计的氨基酸序列而制备突变酶。在该方式的情况下，在步骤(1)中准备将利用本发明的设计方法而构建的氨基酸序列进行编码的核酸。例如，基于利用本发明的设计方法构建的氨基酸序列，对于编码突变对象酶的基因施加必要的突变(即，在表达产物即蛋白质中的特定位置的氨基酸的取代)，得到编码突变酶的核酸(基因)。
[0235]步骤(1)之后 ，使准备的核酸进行表达(步骤(II))。例如，首先，准备插入了上述核酸而得的表达载体，使用此表达载体转化宿主细胞。“表达载体”是指可将插入其中的核酸导入目标细胞(宿主细胞)内，且可在该细胞内使之表达的载体。表达载体通常包含对插入的核酸的表达必要的启动子序列、促进表达的增强子序列等。也可使用包含选择标记的表达载体。在使用该表达载体时，可利用选择标记而确认表达载体导入的有无(及其程度)。
[0236]接着，在产生表达产物即突变酶的条件下培养转化体。转化体的培养按照常规方法即可。作为用于培养基的碳源，只要是可同化的碳化合物即可，例如使用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、糖蜜、丙酮酸等。此外，作为氮源，只要是可利用的氮化合物即可，例如使用蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白水解物、大豆渣碱提取物等。除此以外，根据需要使用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、镁、钙、钾、铁、锰、锌等的盐类；特定的氨基酸；特定的维生素等。
[0237]另一方面，培养温度可设定在30°C~40°C的范围内(优选37°C附近)。培养时间可考虑培养对象的转化体的生长特性、突变型酶的产生特性等而进行设定。培养基的PH在生长转化体且产生酶的范围内调制。优选将培养基的pH设为6.0~9.0左右(优选pH7.0附近)。
[0238]接着，回收表达产物(突变酶)(步骤(III))。可以将培养后的包含菌体的培养液直接作为酶溶液利用，或者经过浓缩、杂质的除去等后作为酶溶液利用，但是一般而言，将表达产物从培养液或菌体中暂时回收。若表达产物为分泌型蛋白质，则从培养液中回收，除此以外，可从菌体内回收。在从培养液中回收时，例如将培养上清进行过滤、离心处理而除去不溶物，然后将减压浓缩、膜浓缩、利用硫酸铵、硫酸钠的盐析、利用甲醇、乙醇或丙酮等的分步沉淀法、透析、加热处理、等电点处理、凝胶过滤、吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法等各种色谱法(例如，利用葡聚糖凝胶(GE Healthcare Bioscience公司)等的凝胶过滤，DEAE琼脂糖凝胶CL-6B (GE Healthcare Bioscience公司)，辛基琼脂糖凝胶CL-6B(GE Healthcare Bioscience 公司)，CM 琼脂糖凝胶 CL-6B (GE Healthcare Bioscience 公司))等组合而进行分离、纯化，从而得到突变酶的纯化品。另一方面，在从菌体内回收时，通过将培养液进行过滤、离心处理等，采集菌体，接着将菌体用加压处理、超声波处理等机械方法或者利用溶酶体等的酶法进行破坏后，与上述同样进行分离、纯化，从而可得到突变酶的纯化品。
[0239]也 可将如上所述得到的纯化酶例如利用冷冻干燥、真空干燥或者喷雾干燥等粉末化而进行提供。此时，可预先使纯化酶预溶解于磷酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、tris盐酸缓冲液、GOOD的缓冲液中。可优选使用磷酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液。应予说明，在此，作为GOOD的缓冲液，可举出PIPES、MES或MOPS。
[0240]通常，如上所述利用适当的宿主-载体系而进行基因的表达~表达产物(突变酶)的回收，但是也可利用无细胞合成系统。在此，“无细胞合成系统(无细胞转录系统、无细胞转录/翻译系统)”是指不使用活细胞，而是使用来自活细胞的(或者用基因工程学方法得至1J)核糖体、转录翻译因子等，从模板核酸(DNA、mRNA)体外合成其编码的mRNA、蛋白质。在无细胞合成系统中一般使用将细胞破碎液根据需要进行纯化而得的细胞提取液。在细胞提取液中一般包含对蛋白质合成必要的核糖体、起始因子等各种因子、tRNA等各种酶。在进行蛋白质的合成时，在该细胞提取液中添加各种氨基酸、ATP、GTP等能量源、肌酸磷酸等对蛋白质的合成必要的其它物质。当然，在合成蛋白质时，可根据需要补充另行准备的核糖体、各种因子、和/或各种酶等。
[0241]也报告了再构成对蛋白质合成必要的各分子(因子)的转录/翻译系统的开发(Shimizu, Y.et al.:Nature Biotech.，19，751-755，2001 )。在该合成系中，将构成细菌的蛋白质合成系统的3种起始因子、3种类的伸长因子、参与终止的4种因子、使各氨基酸与tRNA结合的20种氨基酸酰基tRNA合成酶，及由甲硫氨酰tRNA甲酰化转移酶构成的31种因子的基因从大肠菌基因组进行扩增，使用这些，体外再构成蛋白质合成系统。在本发明中可利用这样的再构成合成系统。
[0242]用语“无细胞转录/翻译系统”可与无细胞蛋白质合成系统、体外翻译系统或体外转录/翻译系统交换使用。在体外翻译系中，RNA被用作模板而合成蛋白质。作为模板RNA，使用总RNA、mRNA、体外转录产物等。在另外的体外转录/翻译系统中DNA被用作模板。模板DNA应当包含核糖体结合区域，此外优选包含恰当的终止序列。应予说明，在体外转录/翻译系统中，以转录反应及翻译反应连续进行的方式，设定对各反应必要的因子被添加的条件。
[0243]在创造实用性高的GDH这样的目标下，摸索出代替以往的方法(将现有的GDH进行修饰的方法、以筛选为中心的方法)的新方法。首先着眼于没有FAD-GDH特有的问题(针对木糖的反应性比较高，最适温度高)的葡萄糖氧化酶(G0)。已知GO与FAD-GDH的氨基酸序列的同源性比较高。采用如下新方法:重视该同源性，对GO赋予GDH活性，即，利用修饰将GO进行⑶H化。
[0244]1.GO与FAD-GDH的比对比较
[0245]从来自黑曲霉的GO与来自目前氨基酸序列已知的米曲霉、土曲霉、意大利青霉、薄刺青霉的FAD-GDH的比对比较，以及立体结构明确的来自黑曲霉的GO的立体结构来看，在处于GO的活性中心附近的氨基酸中，在FAD-GDH间保守(共同性高)，但是在GO与FAD-GDH之间检索出不同的氨基酸(图2、3)。应予说明，在比对比较中，设有在ClustalW2(EMBL (European Molecular Biology Laboratory) -EBI (European BioinformaticsInstitute)的主页内专用的位点。使用 http://www.eb1.ac.uk/Tools/clustalw2/index,html)。
[0246]以利用检索确定的13 个的氨基酸(L115、G131、T132、V193、T353、F436、D446、Y472、I511、P535、Y537、V582、M583)为突变导入对象。
[0247]2.GO基因的取得、突变导入及平板测定法
[0248]对于GO基因，过去没有在大肠菌中表达的报告，因此决定在pYES2 (Invitrogen公司)的HindII1-XhoII部分中插入GO基因，以酿酒酵母(S.cerevisiae)为宿主，使之进行表达。
[0249]从黑曲霉G0-1号菌(天野酶公司拥有)用Gen Elute Plant Genomic DNA kit(Sigma公司)提取基因组DNA后，利用PCR取得GO基因。以下，表示PCR的条件。
[0250](反应液的组成)
[0251]10 X LA 缓冲液(Takara-bio 株式会社)5 μ L
[0252]2.5mM dNTPs (Takara-bio 株式会社)8 μ L
[0253]25mM MgCl2 (Takara-bio 株式会社)5 μ L
[0254]正向引物(50μ M) IyL
[0255]反向引物(50μ M) IyL
[0256]模板I μ L
[0257]LA Taq (Takara-bio 株式会社)0.5 μ L
[0258]StH2O 28.5 μ L
[0259](引物序列)
[0260]正向引物:GATCAGAAGCTTAAAAAAATGTCTACTCTCCTTGTGAGCTCG (序列号 39)
[0261 ]反向引物:GATCAGCTCGAGTCACTGCATGGAAGCATAATC (序列号 40 )
[0262](反应条件)
[0263]于94°C反应2分钟后，将于94°C反应30秒、于52°C反应30秒、于72°C反应2分钟的反应循环重复35次，然后于72°C反应7分钟，最后于4°C放置。
[0264]将PCR后的扩增产物插入pYES2，制成pYES-GO-K-P-2质粒，确认了插入物的序列(图4)。由于序列中没有发现问题，因此以构建的pYES-GO-K-P-2质粒为模板，基于以将L115、G131、T132、V193、T353、F436、D446、Y472、1511、P535、Y537、V582、M583 分别取代成多种氨基酸的方式进行设计的下述合成寡聚核苷酸及与其互补的合成寡聚核苷酸，使用QuikChange Site-Directed Mutagensesis Kit (Stratagene 公司)，按照所附方案进行突变操作，构建具有突变葡萄糖氧化酶的质粒。
[0265]G0-L115-突变用引物:CCACCAACAATCAGACTGCGNNNATC CGCTCCGGAAATGG (序列号41)
[0266]GO-Gl31-突变用引物:GCTCTACCCTCGTCAACGGTNNNACC TGGACTCGCCCC (序列号 42)
[0267]G0-T132-突变用引物:CTCGTCAACGGTGGCNNNTGGACTCG CCCCCAC (序列号 43)
[0268]G0-V193-突变用引物:CATGGTATCAATGGTACTNNNCACGC CGGACCCCGCG (序列号 44)
[0269]G0-T353-突变用引物:CAACCTTCAGGACCAGACCNNNTCTA CCGTCCGCTCAC (序列号 45)
[0270]G0-F436-突变用引物:GTCGCATACTCGGAACTCNNNCTCGA CACGGCCGGAG (序列号 46)
[0271]G0-D446-突变用引物:GCCGGAGTGGCCAGTTTCNNNGTGTG GGATCTTCTGC (序列号 47)
[0272]G0-Y472-突变用引物:CATCCTCCGCCATTTCGCANNNGACC CTCAGTACTTTCTCAAC (序列号48)
[0273]G0-1551-突变用引物:CTTATTTCGCTGGAGAGACTNNNCCCG GTGACAACCTCGC (序列号
49)
[0274]G0-P535-突变用引物:CCCGTACAACTTCCGCNNNAACTACC ATGGTGTGGGTACTTG(序列号
50)
[0275]G0-Y537-突变 用引物:GTACAACTTCCGCCCTAACNNNCATG GTGTGGGTACTTGCTC(序列号
51)
[0276]G0-V582-突变用引物:CTACGCAAATGTCGTCCCATNNNATG ACGGTCTTTTATGCCATGG (序列号52)
[0277]G0-M583-突变用引物:CTACGCAAATGTCGTCCCATGTTNNN ACGGTCTTTTATGCCATGG (序列号53)
[0278]将突变导入后的质粒转化到大肠菌DH5CI中后，进行质粒提取，制作突变文库。将所得文库转化到酿酒酵母INVScKlnvitrogen公司)中，将生长的菌落复制到表达平板后，用平板测定法确认表达及突变导入(图5)。对于F436，无法确认突变酶转化株的生长。应予说明，实验操作参考PYES2的手册。
[0279]平板测定方法
[0280]将各发色液浸溃于80mm的滤纸后，载置于平板上，确认发色。
[0281]〈G0 测定〉
[0282]50mM PIPES-NaOH (cont.0.l%Triton X-100) pH7.0 20mL
[0283]10% 葡萄糖 5mL
[0284]25u/mL PO “Amano”3 (天野酶公司)5mL
[0285]邻联茴香胺(o-7 二 'y' >) 5mg
[0286]〈⑶H测定〉
[0287]50mM PIPES-NaOH (cont.0.l%Triton X-100) pH7.0 23mL
[0288]10% 葡萄糖 5mL
[0289]3mmol/Ll-甲氧基 PMS ImL
[0290]6.6mmol/L NTB ImL
[0291]3.液体培养的活性确认
[0292]对于能够用平板测定法确认的阳性菌落(用GO测定不发色，用GDH测定发色)，进行液体培养，研究GO活性及GDH活性。应予说明，实验操作参考PYES2的手册。
[0293]〈G0测定用试剂〉[0294]含苯酚的磷酸缓冲液19mL
[0295]10% 葡萄糖 5mL
[0296]25u/mL P0”Amano”3 (天野酶公司)5mL
[0297]0.4g/dL4_氨基安替比林ImL
[0298]〈⑶H测定用试剂〉
[0299]50mM PIPES-NaOH (cont.0.l%Triton X-100) ρΗ7.0 2ImL
[0300]10% 葡萄糖 5mL
[0301]3mmol/L PMS 3mL
[0302]6.BmmoI /T, NTB ImL
[0303]向各试剂200 μ L中添加20 μ L的培养上清，于37°C使之反应。在反应开始后10分钟与60分钟时测定吸光度，由吸光度差求出GO活性及GDH活性。对于各突变酶转化株，算出⑶H活性与GO活性之比(⑶H活性/GO活性)，进行比较(图6、7)。应予说明，以具有未突变GO的转化株(图6、7中表示为pYES-GO)、用插入GO基因前的质粒转化而得的转化株(图 6、7 中表示为 pYES-2)、G0”Amano”2 (图 6、7 中表示为 GO)、⑶H” Amano”8 (图 6、7 中表示为FAD-GDH)为比 较对象(对照)。
[0304]针对认定GDH/G0活性比变化大的突变酶转化株，确认突变导入点的氨基酸序列(图8)。基于图6~8所示的结果，确定有效突变。首先，对于T132，与具有T132V(从苏氨酸到缬氨酸的取代)的突变酶转化株相比，具有T132A (从苏氨酸到丙氨酸的取代)的突变酶转化株的⑶H/G0活性比高，因此以T132A为有效突变。对于T353，在突变酶转化株(5-1-5)中认定了两种突变T353A及T353H，但是由于存在单独具有T353A的突变酶转化株(5-1-9,5-1-44)，因此推测5-1-5株为两种株的混合，以T353A为有效突变。对于D446，也基于同样的推测，以D446H为有效突变。此外，突变酶转化株12-1-49具有的突变V582S也为有效突变。应予说明，单独或组合具有以上4种突变的GO的氨基酸序列及对应的碱基序列(基因序列)列举如下。
[0305]突变:氨基酸序列:碱基序列
[0306]T132A:序列号7:序列号22
[0307]T353A:序列号8:序列号23
[0308]D446H:序列号9:序列号24
[0309]V582S:序列号10:序列号25
[0310]T132A 及 T353A:序列号 11:序列号 26
[0311]T132A 及 D446H:序列号 12:序列号 27
[0312]T132A 及 V582S:序列号 13:序列号 28
[0313]T353A 及 D446H:序列号 14:序列号 29
[0314]T353A 及 V582S:序列号 15:序列号 30
[0315]D446H 及 V582S:序列号 16:序列号 31
[0316]T132A, T353A 及 D446H:序列号 17:序列号 32
[0317]T132A, T353A 及 V582S:序列号 18:序列号 33
[0318]T132A, D446H 及 V582S:序列号 19:序列号 34
[0319]T353A, D446H 及 V582S:序列号 20:序列号 35[0320]T132A, T353A, D446H 及 V582S:序列号 21:序列号 36
[0321]4.突变型GO的底物特异性的确认
[0322] 对于具有有效突变的酶(突变型G0)，研究GDH活性中的底物特异性。
[0323]〈⑶H测定用试剂〉
[0324]50mM PIPES-NaOH (cont.0.l%Triton X-100) pH7.0 2ImL
[0325]10% 底物 5mL
[0326]3mmol/L PMS ImL
[0327]6.BmmoI /T, NTB 3mL
[0328]向各试剂200 μ L 中添加突变酶转化株(3-1-26、3-2-26、5-1-5、5-1-9、5-1-44、7-1-7、7-2-17、7-2-30、7-2-42、12-1-49)的培养上清20 μ L，于37°C进行反应。反应开始后10分钟和60分钟时测定吸光度，从吸光度差求出GDH活性。将在使用各底物时的GDH活性以相对于以葡萄糖为底物时的GDH活性(100%)的比率进行表示。应予说明，以具有未突变GO的转化株(图9中表示为pYES-GO)为对照。
[0329]如图9所示，突变酶转化株中确认了底物特异性变化。在突变酶转化株5-1-5、5-1-9、7-1-7、7-2-17、7-2-30、7-2-42、12-1-49中没有对木糖的反应性。这些转化株具有的突变型GO在没有显示出对木糖的反应性方面可以说比现有的FAD-GDH优异。这样，利用氨基酸取代，成功地将GO进行GDH化，同时解决了现有的FAD-GDH中特有的问题。应予说明，由针对T132的突变而导致产生对木糖的反应性，因此启示了 FAD-GDH中与该突变对应的部位参与对木糖的反应性的可能性。
[0330]5.突变组合的效果的确认
[0331]对于认为是有效突变的基因突变的组合，验证了效果。为了简略后面的纯化，利用PCR反应而制作对来自黑曲霉GO-1号菌的葡萄糖氧化酶基因的C末端添加了组氨酸标签的GO基因(G0-3)，将其插入pYES2中，构建pYES-GO-3质粒。
[0332](反应液的组成)
[0333]10 X LA 缓冲液(Takara-bio 株式会社)5 μ L
[0334]2.5mM dNTPs (Takara-bio 株式会社)8 μ L
[0335]25mM MgC12 (Takara-bio 株式会社)5 μ L
[0336]正向引物(50μ Μ) IyL
[0337]反向引物(50μ Μ) IyL
[0338]模板I μ L
[0339]LA Taq (Takara-bio 株式会社)0.5 μ L
[0340]stH20 28.5 μ L
[0341](引物的序列)
[0342]正向引物:GATCAGAAGCTTAAAAAAATGTCTACTCTCCTTGTGAGCTCG (序列号 39)
[0343]反向引物:GATCAGCTCGAGTCAATGGTGATGGTGATGATGCTGCATGGAAGCATAATC (序列号54)
[0344](反应条件)
[0345]在于94°C反应2分钟后，将于94°C反应30秒，于52°C反应30秒、于72°C反应2分钟的反应循环重复35次后，于72°C反应7分钟，最后于4°C放置。[0346]将PCR后的扩增产物插入pYES2，制成pYES-G0_3质粒，确认插入物的序列。对序列没有发现问题，因此以构建的pYES-GO-3质粒为模板，基于设计成对T132A、T353A、D446H、V582S进行取代的下述合成寡聚核苷酸及与其互补的合成寡聚核苷酸，使用QuikChangeSite-Directed Mutagensesis Kit (Stratagene公司),按照所附方案进行突变操作，构建
出具有多重突变葡萄糖氧化酶的质粒。
[0347]G0-T132A-1:CTCGTCAACGGTGGCGCTTGGACTCGCCCCC AC (序列号 55)
[0348]G0-T353A-1:CCTTCAGGACCAGACCGCTTCTACCGTCCGC TCAC (序列号 56)
[0349]G0-D446H-1:GGAGTGGCCAGTTTCCATGTGTGGGATCTTC TGC (序列号 57 )
[0350]G0-V582S-1:CGCAAATGTCGTCCCATTCTATGACGGTCTTT TATGCCATGG (序列号 58)
[0351]将突变导入后的质粒在大肠菌DH5CI中转化后，进行质粒提取，制作突变文库。将所得文库转化到酿酒酵母INVScl (Invitrogen公司)中，对于生长的菌落，进行液体培养，研究GO活性及GDH活性。应予说明，实验操作参考PYES2的手册。
[0352]〈G0测定用试剂〉
[0353]含苯酚的磷酸缓冲液19mL
[0354]10% 葡萄糖 5mL
[0355]25u/mL P0-3 5mL
[0356]0.4g/dL4-A.A ImL
[0357]〈⑶H测定用试剂〉
[0358]50mM PIPES-NaOH (cont.0.l%Triton X-100) pH7.0 2ImL
[0359]10% 葡萄糖 5mL
[0360]3mmol/L PMS 3mL
[0361]6.BmmoI /T, NTB ImL
[0362]向各试剂200 μ L中添加20 μ L的培养上清，于37°C使之反应。反应开始后10分钟与30分钟时测定吸光度，从吸光度差求出GO活性及GDH活性。对于各突变酶转化株，算出⑶H活性与GO活性的比(⑶H活性/GO活性)，进行比较。应予说明，以具有插入组氨酸标签的未突变GO的转化株(表示为pYES-GO-3)、用插入GO基因前的质粒转化而成的转化株(表示为pYES-2)、G0 “Amano”2 (表示为G0)，⑶H”Amano”8 (表示为FAD-GDH)为比较对象(对照)。
[0363]结果如图11 所示。用 T132A 及 V582S (pYES_G0_M7)、D446H 及 V582S(pYES-G0-M10)、T132A、D446H及V582S (pYES_G0_M13)的多重突变酶分别与单独的突变酶或突变导入前的野生酶(pYES-GO-3)进行比较，确认⑶H/G0活性比变化大。
[0364]6.纯化多重突变型酶的比活性及底物特异性的确认
[0365]接着，对于确认了效果的T132A、D446H、V582S的组合(T132A及D446H、T132A及V582S、D446H及V582S、T132A、D446H及V582S)，进行转化株的液体培养，用N1-琼脂糖凝胶进行纯化后，研究比活性及底物特异性。应予说明，在液体培养中的表达参考PYES2的手
ΠΠ
/ttr O
[0366]〈⑶H测定用试剂〉
[0367]50mM PIPES-NaOH (cont.0.l%Triton X-100) pH7.0 2ImL
[0368]10% 葡萄糖 5mL[0369]3mmol/L PMS 3mL
[0370]6.6mmol/L NTB ImL
[0371]向各试剂200 μ L中添加20 μ L的纯化酶溶液或标准酶溶液，然后于37°C使之反应，求出从反应开始5分钟与10分钟时的吸光度差。由用标准酶求出的校正曲线求出活性值，与用Bradford法求出的蛋白量一起算出比活性。结果如图12所示。所得纯化酶的比活性为约3~8u/mg (蛋白质)。
[0372]对于具有有效突变的酶，使用纯化酶，研究GDH活性中底物特异性。
[0373]〈⑶H测定用试剂〉
[0374]50mM PIPES-NaOH (cont.0.l%Triton X-100) pH7.0 2ImL
[0375]10% 底物 5mL
[0376]3mmol/L PMS 3mL
[0377]6.BmmoI /T, NTB ImL
[0378]对于各试剂200 μ L，添加突变酶转化株(M6、M7、M10、M13)的培养上清20 μ L，于37°C使之反应。反应开始后5分钟与10分钟时测定吸光度，由吸光度差求出⑶H活性。将使用各底物时的GDH活性用相对于以葡萄糖为底物时的GDH活性(100%)的比率进行表示。应予说明，以⑶H “Amano”8 (表示为FAD-GDH)为对照。 [0379]结果如图13所示。突变酶转化株中确认底物特异性变化。特别是，在D446H及V582S (pYES-GO-MIO)中没有对木糖的反应性。本转化株具有的突变型GO在没有显示出对木糖的反应性方面可以说比现有的FAD-GDH优异。这样利用氨基酸取代，在将GO进行GDH化的同时成功地解决了现有的FAD-GDH中特有的问题。
[0380]7.D446及V582多重突变酶的最优氨基酸的研究
[0381]对于D446及V582的突变组合，以各个氨基酸成为最优的氨基酸组合的方式，以pYES-G0-K-P-2质粒为模板,基于序列号47及序列号52的合成寡聚核苷酸及与其互补的合成寡聚核苷酸，使用 QuikChange Site-Directed Mutagensesis Kit (Stratagene 公司)，按照所附方案，进行突变操作，构建具有突变葡萄糖氧化酶的质粒。将突变导入后的质粒转化到大肠菌DH5ci中后，进行质粒提取，制作D446及V582多重突变文库。将所得文库在酿酒酵母INVScl (Invitrogen公司)中进行转化,对于所得转化体,使用96孔深孔板,进行液体培养，以实施研究前的组合即D446H及V582S为对照，取得了⑶H活性及⑶H/G0活性比提高的转化体。应予说明，实验操作参考PYES2的手册。
[0382]结果如图14所示。在D446H及V582R、D446H及V582L、D446H及V582P的组合中，与实施研究前的组合D446H及V582S相比，⑶H活性及⑶H/G0活性比提高。其中，D446H及V582P的GO活性在检测限以下，利用氨基酸取代，成功地完全⑶H化。
[0383]8.D446H及V582P多重突变酶的性质研究
[0384](I)培养及纯化
[0385]液体培养中的表达如下进行:参考pYES2的手册，由保存板接种到在500mL摇瓶(坂口 7 7 ^ 中制成的IOOmL含有0.67%的不含氨基酸酵母氮源(Nippon BectonDickinson株式会社制)、2%葡萄糖的培养基(pH5.4)中，进行30°C、140转/分钟、20小时
的预培养。
[0386]预培养结束后，将菌体离心回收，再次以成为0D660=0.4的方式接种到在500mL摇瓶中制成的IOOmL的含有0.67%不含氨基酸酵母氮源(Nippon Becton Dickinson株式会社制)、2%半乳糖及1%蜜三糖的培养基(pH5.4)中，进行30°C、140转/分钟、5小时的本培养。
[0387]培养结束后，利用超滤膜(商品名MICR0ZA，分组分子量6000，旭化成社制)进行脱盐浓缩，对于上述脱盐浓缩液，使之在用20mM磷酸缓冲液(pH7.0)平衡化的阴离子交换树月旨(商品名HiTrap DEAE FF,GE Healthcare Japan公司制)柱中进行吸附，用上述缓冲液进行清洗。清洗后，使用含有NaCl的30mM MOPS缓冲液(pH7.0)，利用NaCl浓度O~1.0M的Liner gradient法进行溶出。可得到由如上所述的纯化方法部分纯化的突变型G0(D446H,V582P多重突变酶)。
[0388](2)底物特异性的确认
[0389]对于突变型GO部分纯化酶(D446H、V582P多重突变酶)，研究⑶H活性中的底物特异性。
[0390]〈⑶H测定用试剂〉
[0391]50mM PIPES-NaOH (cont.0.l%Triton X-100) pH7.0 2ImL
[0392]10% 底物 5mL
[0393]3mmol/L PMS 3mL
[0394]6.BmmoI /T, NTB ImL
[0395]对于各试剂200μ L，添加突变型GO部分纯化酶(D446H、V582P多重突变酶)20μ L，于37°C使之反应。反应开始后10分钟与30分钟时测定吸光度，由吸光度差求出⑶H活性。将使用各底物时的GDH活性用相对于以葡萄糖为底物时的GDH活性(100%)的比率进行表示。应予说明，以⑶H “Amano”8 (图6、7中表示为FAD-GDH)为对照。
[0396]结果如图15所示。突变型GO部分纯化酶(D446H、V582P多重突变酶)未显示出对木糖的反应性，与⑶H “Amano”8相比，底物特异性格外优异。
[0397]产业上的利用可能性
[0398]本发明提供的突变GO在试样中的葡萄糖量的检测、定量中有用。另一方面，本发明的设计方法、制备方法作为取得特性提高的GDH或GO取得的方法得到利用。特别是，期待作为用于取得GDH化的GO或GO化的GDH的方法来利用。
[0399]本发明并不限定于任何上述发明实施方式及实施例的说明。在不脱离本发明所要保护的范围的情况下，本领域技术人员可容易想到的范围内的各种变型方式也包含在本发明中。
[0400]本说明书中明示的论文、公开专利公报、及专利公报等内容通过援引其全部内容而得到引用。
[0401]另附序列表文本
[0402]序列号39~40，54:人工序列的说明:PCR用引物
[0403]序列号41~53，55~58:人工序列的说明:突变导入用引物。
【权利要求】
1.一种突变酶，由在来自微生物的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列中选自以下(I)~(13)中的一个或两个以上的氨基酸被其它氨基酸取代而得的氨基酸序列所构成: (O与序列号I所示的氨基酸序列的115位氨基酸对应的氨基酸； (2)与序列号I所示的氨基酸序列的131位氨基酸对应的氨基酸； (3)与序列号I所示的氨基酸序列的132位氨基酸对应的氨基酸； (4)与序列号I所示的氨基酸序列的193位氨基酸对应的氨基酸； (5)与序列号I所示的氨基酸序列的353位氨基酸对应的氨基酸； (6)与序列号I所示的氨基酸序列的436位氨基酸对应的氨基酸； (7)与序列号I所示的氨基酸序列的446位氨基酸对应的氨基酸； (8)与序列号I所示的氨基酸序列的472位氨基酸对应的氨基酸； (9)与序列号I 所示的氨基酸序列的511位氨基酸对应的氨基酸； (10)与序列号I所示的氨基酸序列的535位氨基酸对应的氨基酸； (11)与序列号I所示的氨基酸序列的537位氨基酸对应的氨基酸； (12)与序列号I所示的氨基酸序列的582位氨基酸对应的氨基酸； (13)与序列号I所示的氨基酸序列的583位氨基酸对应的氨基酸。
2.根据权利要求1所述的突变酶，其中，来自微生物的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列为序列号I或2的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的突变酶，其中，被取代的氨基酸为(3)的氨基酸、(5)的氨基酸、(7)的氨基酸或(12)的氨基酸、或者选自它们中的两个以上的氨基酸的组合。
4.根据权利要求3所述的突变酶，其中，对于(3)的氨基酸，取代后的氨基酸为丙氨酸，对于(5)的氨基酸，取代后的氨基酸为丙氨酸，对于(7)的氨基酸，取代后的氨基酸为组氨酸，对于(12)的氨基酸，取代后的氨基酸为丝氨酸、精氨酸、亮氨酸或脯氨酸。
5.根据权利要求1或2所述的突变酶，其中，被取代的氨基酸为(3)的氨基酸、(7)的氨基酸或(12)的氨基酸、或者选自它们中的两个以上的氨基酸的组合。
6.根据权利要求5所述的突变酶，其中，对于(3)的氨基酸，取代后的氨基酸为丙氨酸，对于(7)的氨基酸，取代后的氨基酸为组氨酸，对于(12)的氨基酸，取代后的氨基酸为丝氨酸、精氨酸、亮氨酸或脯氨酸。
7.根据权利要求1或2所述的突变酶，其中，被取代的氨基酸为(7)的氨基酸及(12)的氨基酸。
8.根据权利要求7所述的突变酶，其中，对于(7)的氨基酸，取代后的氨基酸为组氨酸，对于(12)的氨基酸，取代后的氨基酸为丝氨酸、精氨酸、亮氨酸或脯氨酸。
9.根据权利要求1所述的突变酶，其中，由序列号7~21、59~61中的任一氨基酸序列所构成。
10.一种基因，编码权利要求1~9中任一项所述的突变酶。
11.根据权利要求10所述的基因,其中，包含序列号22~36、62~64中的任一碱基序列。
12.—种重组DNA，包含权利要求10或11所述的基因。
13.一种微生物，具有权利要求12所述的重组DNA。
14.一种葡萄糖测定法，其特征在于，使用权利要求1~9中任一项所述的突变酶，测定试样中的葡萄糖。
15.一种葡萄糖测定用试剂，其特征在于，包含权利要求1~9中任一项所述的突变酶。
16.一种葡萄糖测定用试剂盒，包含权利要求15所述的葡萄糖测定用试剂。
17.一种方法，其特征在于，使用权利要求1~9中任一项所述的突变酶，降低工业制品或其原料中的葡萄糖量。
18.—种酶剂,含有权利要求1~9中任一项所述的突变酶。
19.一种突变酶的设计方法，包括以下步骤(i)和(ii): (1)在突变对象酶的氨基酸序列中，确定选自以下(I)~(13)中的一个或两个以上的氨基酸的步骤，所述突变对象酶为来自微生物的葡萄糖氧化酶或来自微生物的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶: (O与序列号I所示的氨基酸序列的115位氨基酸对应的氨基酸； (2)与序列号I所示的氨基酸序列的131位氨基酸对应的氨基酸； (3)与序列号I所示的氨基酸序列的132位氨基酸对应的氨基酸； (4)与序列号I所示的氨基酸序列的193位氨基酸对应的氨基酸； (5)与序列号I所示的氨基酸序列的353位氨基酸对应的氨基酸； (6)与序列号I所示的氨基酸序列的436位氨基酸对应的氨基酸； (7)与序列号I所示的氨基酸序列的446位氨基酸对应的氨基酸； (8)与序列号I所示的氨基酸序列的472位氨基酸对应的氨基酸； (9)与序列号I所示的氨基酸序列的511位氨基酸对应的氨基酸； (10)与序列号I所示的氨基酸序列的535位氨基酸对应的氨基酸； (11)与序列号I所示的氨基酸序列的537位氨基酸对应的氨基酸； (12)与序列号I所示的氨基酸序列的582位氨基酸对应的氨基酸； (13)与序列号I所示的氨基酸序列的583位氨基酸对应的氨基酸； (ii)基于突变对象酶的氨基酸序列，构建在步骤(i)中确定的氨基酸序列被其它氨基酸取代而得的氨基酸序列的步骤。
20.根据权利要求19所述的设计方法，其中，突变对象酶为来自微生物的葡萄糖氧化酶，在步骤(i)中被取代的氨基酸为(3)的氨基酸、(5)的氨基酸、(7)的氨基酸或(12)的氨基酸、或者选自它们中的两个以上的氨基酸的组合。
21.根据权利要求19所述的设计方法，其中，突变对象酶为来自微生物的葡萄糖氧化酶，在步骤(i)中被取代的氨基酸为(3)的氨基酸、(7)的氨基酸或(12)的氨基酸、或者选自它们中的两个以上的氨基酸的组合。
22.根据权利要求19所述的设计方法，其中，突变对象酶为来自微生物的葡萄糖氧化酶，在步骤(i)中被取代的氨基酸为(7)的氨基酸及(12)的氨基酸。
23.根据权利要求20~22中任一项所述的设计方法，其中，来自微生物的葡萄糖氧化酶为黑曲霉或尼崎青霉的葡萄糖氧化酶。
24.根据权利要求23所述的设计方法，其中，葡萄糖氧化酶的氨基酸序列为序列号I或2的氨基酸序列。
25.根据权利要求19所述的设计方法，其中，突变对象酶为意大利青霉、薄刺青霉、米曲霉或土曲霉的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶。
26.根据权利要求25所述的设计方法，其中，黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列为序列号3~6中的任一氨基酸序列。
27.一种突变酶的制备方法，包括以下步骤(1)~(III): (I)准备将序列号7~21、59~61中的任一氨基酸序列、或由权利要求19~26中任一项所述的设计方法构建的氨基酸序列进行编码的核酸的步骤； (II)使所述核酸进行表达的步骤，及 (III)回收表达产物的步骤。
【文档编号】C12Q1/26GK103981158SQ201410145393
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2010年11月22日 优先权日:2009年12月5日
【发明者】西尾享一, 小池田聪 申请人:天野酶株式会社