一种制备扇贝裙边活性肽的方法
【专利摘要】本发明涉及一种制备扇贝裙边活性肽的方法，包括清洗匀浆、中性蛋白酶和碱性蛋白酶复合酶解、高温瞬时加热灭酶、脉冲电场纯化、超滤、混合床脱盐、色谱分离、真空浓缩、真空冷冻干燥和载物、压片步骤。本发明的有益效果为：本方法通过对海洋贝类资源废弃物下脚料扇贝裙边的综合开发，变废为宝，可提高贝类产品的经济价值；通过本方法，扇贝裙边酶解效率显著提高、短肽获得率能够达到80%以上，操作简便，所得产品口感得到显著的改善，口服时生物活性能够得以保持。
【专利说明】一种制备扇贝裙边活性肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及食品加工领域，特别是涉及一种制备扇贝裙边活性肽的方法。
【背景技术】
[0002]扇贝(Scallop)是一种海产贝类，最传统的加工方式为干制，俗称干贝，富含牛磺酸等多种氨基酸、高度不饱和脂肪酸、微量元素和维生素。从古到今它都是一种深受欢迎的营养保健品，具有滋阴补肾调中的功效。扇贝经干制后其余的软体部分俗称为扇贝裙边，通常由于扇贝裙边感官性状差，加工利用程度较低，一般作饲料处理甚至被废弃。此种方式不仅使产品综合利用率低而且严重污染环境。
[0003]扇贝裙边含有丰富的蛋白质、碳水化合物、核黄素等多种营养成分和钙、铁、锌、硒、铜等微量元素，其营养价值毫不逊色于扇贝柱。山东省作为海洋大省，扇贝年产量上百万吨，尤其青岛扇贝向来闻名，其加工后的废弃物扇贝裙边也有几十万吨。如何充分合理地利用扇贝裙边是扇贝加工业急待解决的问题。经研究发现扇贝裙边含有大量的生理活性物质，具有降血脂、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老等多种生物功能。
[0004]现有生产方法通常采用单一的酶来酶解蛋白，如中性蛋白酶Neutrase、碱性蛋白酶Alcalase2.4L、复合蛋白酶Promatex、风味蛋白酶Flavourzyme、木瓜蛋白酶Papain或膜蛋白酶TryPsin，因单酶作用位点有限，故大大降低了酶解效率和短肽得率。
[0005]蛋白酶解过程中，为了使蛋白酶处于最适pH范围内，尽量维持其水解速度，必须不断加入一些碱或酸来调节水解体系的PH值，因此最后得到的蛋白水解物中含有一定量的盐分，这部分盐分可能会影响到产品的纯度和适用范围并对其功能活性带来负面影响，进而限制其在食品领域的应用，因此需要对短肽进行脱盐处理。传统的脱盐方法包括离子交换树脂脱盐法和大孔树脂法。离子交换树脂脱法要分别通过阴阳离子交换树脂，使得脱盐过程较为繁琐，且肽回收率较低。大孔树脂法则要经过吸附和洗脱过程，不仅操作繁琐，肽得率较低，而且洗脱时要使用有机溶剂，使得该法不易产业化操作。
[0006]国内肽类产品大多纯度有限，且由于其特殊的理化性质，最容易在人体胃肠体系降解，因胃酸的PH值为I~3，肽类在这种环境中的生物活性几乎完全丧失。同时，由于胃肠道中酶的降解作用，绝大多数的功能性肽类在胃肠道中被降解为由氨基酸或由2~6个氨基酸组成的小分子肽，故其口服活性无法在药物及食品体系保持。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种制备扇贝裙边活性肽的方法，以克服目前现有技术存在的上述不足。
[0008]本发明的目的是通过以下技术方案来实现:
一种制备扇贝裙边活性肽的方法，包括以下步骤:
Cl)匀浆:
将经验收合格的扇贝裙边清洗后打浆，之后放入匀浆机进行匀浆；(2)复合酶解:
先用中性蛋白酶对步骤(1)得到的原料进行水解，水解完成后再调节PH值用碱性蛋白酶水解；
(3)灭酶:
水解结束后，过滤，将滤液高温瞬时加热灭酶；
(4)脉冲电场纯化:
将步骤(3)得到的原料放入强脉冲电场中进行纯化；
(5)超滤: 将步骤(4)得到的原料进行超滤；
(6)混合床脱盐:
将步骤(5)得到的超滤酶解液进行混合床脱盐；
(7)色谱分离:
将步骤(6)得到的原料进行色谱分离纯化；
(8)真空浓缩:
将步骤(7)得到的色谱分离物在8(T90°C下进行真空浓缩；
(9)真空冷冻干燥:
将步骤(8)得到的真空浓缩物进行真空冷冻干燥；
(10)载物、压片:
取经纯化、冷冻干燥后的壳聚糖和壳聚糖/明胶水凝胶，与步骤(8)得到的真空冷冻干燥物充分混匀，用压片机制成成品。
[0009]优选的，所述步骤(1)中的匀浆操作后匀浆液颗粒粒度小于3um。
[0010]优选的，所述步骤(2)中的中性蛋白酶为N120P、碱性蛋白酶为Alcalase。
[0011]优选的，所述步骤(3)中的高温瞬时加热条件为95~100°C，加热时间2分钟。
[0012]优选的，所述步骤(4)中的脉冲电场强度为5~15KV/cm，脉冲频率为2500-3500Ηζ，处理时间为20(T400us。
[0013]优选的，所述步骤(5)中选用MWCO为IKD的超滤膜。
[0014]优选的，所述步骤(6)中混合床脱盐技术条件为阴离子:阳离子=3:2，过柱速度:5倍柱体积Λ，水解液pH值4.5。
[0015]优选的，所述步骤(7)中色谱分离条件为:色谱柱，PheedaClS柱；上样量:lmL ；流速:4mL/min ;检测波长:280nm 和 220nm ;洗脱条件:(T3min，100%A ;3~50min，0%~50%B ；50~52min，50%~100%B ;52~58min，100%B ;58~60min，100%B~100%A，所述 A 为 5% 乙腈和 0.05%三氟乙酸，所述B为80%乙腈和0.05%三氟乙酸。
[0016]优选的，所述步骤(8)中真空浓缩温度为80~90°C。
[0017]优选的，所述步骤(9)中真空冷冻干燥温度为_30°C。
[0018]本发明的有益效果为:本方法通过对海洋贝类资源废弃物下脚料扇贝裙边的综合开发，变废为宝，可提高贝类产品的经济价值；通过本方法，扇贝裙边酶解效率显著提高、短肽获得率能够达到80%以上，操作简便，所得产品口感得到显著的改善，口服时生物活性能够得以保持。【专利附图】
【附图说明】
[0019]下面根据附图对本发明作进一步详细说明。
[0020]图1是现有技术中扇贝裙边活性肽制取方法流程图；
图2是本发明实施例所述的扇贝裙边活性肽制取方法流程图。
【具体实施方式】
[0021]实施例1
如图1-2所示，本发明实施例所述的一种制备扇贝裙边活性肽的方法，将经验收合格的扇贝裙边清洗后打浆，之后放入匀浆机进行匀浆，控制匀浆液的颗粒粒度小于3um ;然后用中性蛋白酶N120P在40°C，PH7.0，酶-底物浓度比(W/W)为5%的条件下水解匀浆液2小时，水解完成后用0.5%的NaOH溶液调节PH至8.8，温度升至55°C，加入碱性蛋白酶(Alcalase)水解2 h，此条件下肽得率在80%以上；之后，过滤酶解液，弃去残渣，将滤液用高温瞬时加热法加热，温度为95°C，加热2 min后迅速冷却至室温；将灭酶液放入脉冲电场强度为5Kv/cm，脉冲频率为3500Hz，处理时间400us ;选用MWCO为IKD的超滤膜，采用Millipore杯式超滤器，对纯化酶解液进行超滤处理；将超滤酶解液在阴离子:阳离子=3:2，过柱速度:5倍柱体积/h，水解液pH值4.5的条件下进行混合床脱盐；将脱盐酶解液在HPLC系统进行分离纯化。色谱条件:色谱柱，PheedaC18柱；上样量:lmL ;流速:4mL/min ;检测波长:280nm 和 220nm ;洗脱条件:0~3min，100%A ;3~50min，0%~50%B ;50~52min，50%~100%B ;52~58min，100%B ;58~60min，100%B~100%A ；所述 A 为 5% 乙腈和 0.05% 三氟乙酸；B为80%乙腈和0.05%三氟乙酸；将色谱分离物在80°C下进行真空浓缩；将真空浓缩物于-30°C下冷冻干燥24h ;取经纯化、冷冻干燥后的壳聚糖和壳聚糖/明胶水凝胶，与真空冷冻干燥物充分混匀，用压片机制成成品。
[0022]实施例2
本发明实施例所述的一种制备扇贝裙边活性肽的方法，将经验收合格的扇贝裙边清洗后打浆，之后放入匀浆机进行匀浆，控制匀浆液的颗粒粒度小于3um ;然后用中性蛋白酶N120P在40°C，PH7.0，酶-底物浓度比(W/W)为5%的条件下水解匀浆液2小时，水解完成后用0.5%的NaOH溶液调节PH至8.8，温度升至55°C，加入碱性蛋白酶(Alcalase)水解2 h，此条件下肽得率在80%以上；之后，过滤酶解液，弃去残渣，将滤液加热，一来，可以加热灭菌，二来可以使酶失去活性，本项目采用高温瞬时加热法，即97°C，加热2 min后迅速冷却至室温；将灭酶液放入脉冲电场强度为lOKv/cm，脉冲频率为3000Hz，处理时间300us ;选用MWCO为IKD的超滤膜，采用Millipore杯式超滤器，对纯化酶解液进行超滤处理；将超滤酶解液在阴离子:阳离子=3:2，过柱速度:5倍柱体积/h，水解液pH值4.5的条件下进行混合床脱盐；将脱盐酶解液在HPLC系统进行分离纯化。色谱条件:色谱柱，PheedaClS柱；上样量:lmL ;流速:4mT,/miη ;检测波长:280nm 和 220nm ;洗脱条件:0~3min, 100%A ;3~50min,0%~50%B ;5(T52min，50%~100%B ;52~58min，100%B ;58~60min，100%B~100%A ;所述 A 为 5% 乙腈和0.05%三氟乙酸；B为80%乙腈和0.05%三氟乙酸；将色谱分离物在85°C下进行真空浓缩；将真空浓缩物于_30°C下冷冻干燥24h ;取经纯化、冷冻干燥后的壳聚糖和壳聚糖/明胶水凝胶，与真空冷冻干燥物充分混匀，用压片机制成成品。
[0023]实施例3本发明实施例所述的一种制备扇贝裙边活性肽的方法，将经验收合格的扇贝裙边清洗后打浆，之后放入匀浆机进行匀浆，控制匀浆液的颗粒粒度小于3um ;然后用中性蛋白酶N120P在40°C，PH7.0，酶-底物浓度比(W/W)为5%的条件下水解匀浆液2小时，水解完成后用0.5%的NaOH溶液调节PH至8.8，温度升至55°C，加入碱性蛋白酶(Alcalase)水解2 h，此条件下肽得率在80%以上；之后，过滤酶解液，弃去残渣，将滤液加热，一来，可以加热灭菌，二来可以使酶失去活性，本项目采用高温瞬时加热法，即100°C，加热2 min后迅速冷却至室温；将灭酶液放入脉冲电场强度为15Kv/cm，脉冲频率为2500Hz，处理时间200us ;选用MWCO为IKD的超滤膜，采用Millipore杯式超滤器，对纯化酶解液进行超滤处理；将超滤酶解液在阴离子:阳离子=3:2，过柱速度:5倍柱体积/h，水解液pH值4.5的条件下进行混合床脱盐；将脱盐酶解液在HPLC系统进行分离纯化。色谱条件:色谱柱，PheedaClS柱；上样量:lmL ;流速:4mT,/miη ;检测波长:280nm 和 220nm ;洗脱条件:0~3min, 100%A ;3~50min,0%~50%B ;5(T52min，50%~100%B ;52~58min，100%B ;58~60min，100%B~100%A ;所述 A 为 5% 乙腈和0.05%三氟乙酸；B为80%乙腈和0.05%三氟乙酸；将色谱分离物在90°C下进行真空浓缩；将真空浓缩物于_30°C下冷冻干燥24h ;取经纯化、冷冻干燥后的壳聚糖和壳聚糖/明胶水凝胶，与真空冷冻干燥物充分混匀，用压片机制成成品。
[0024]按照本发明实施例所述的方法生产的扇贝裙边活性肽纯度高、安全性好、无毒副作用、人体吸收快、可控释。
[0025]以下为按照本发明实施例所述方法生产的扇贝裙边活性肽的感官和理化检测效果:
感官效果:
【权利要求】
1.一种制备扇贝裙边活性肽的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)匀浆: 将经验收合格的扇贝裙边清洗后打浆，之后放入匀浆机进行匀浆； (2)复合酶解: 先用中性蛋白酶对步骤(1)得到的原料进行水解，水解完成后再调节PH值用碱性蛋白酶水解； (3)灭酶: 水解结束后，过滤，将滤液高温瞬时加热灭酶； (4)脉冲电场纯化: 将步骤(3)得到的原料放入强脉冲电场中进行纯化； (5)超滤: 将步骤(4)得到的原料进行超滤； (6)混合床脱盐: 将步骤(5)得到的超滤酶解液进行混合床脱盐； (7)色谱分离: 将步骤(6)得到的原料进行色谱分离纯化； (8)真空浓缩: 将步骤(7)得到的色谱分离物在8(T90°C下进行真空浓缩； (9)真空冷冻干燥: 将步骤(8)得到的真空浓缩物进行真空冷冻干燥； (10)载物、压片: 取经纯化、冷冻干燥后的壳聚糖和壳聚糖/明胶水凝胶，与步骤(8)得到的真空冷冻干燥物充分混匀，用压片机制成成品。
2.根据权利要求1所述的一种制备扇贝裙边活性肽的方法，其特征在于:所述步骤(1)中的匀浆操作后匀浆液颗粒粒度小于3um。
3.根据权利要求2所述的一种制备扇贝裙边活性肽的方法，其特征在于:所述步骤(2)中的中性蛋白酶为N120P、碱性蛋白酶为Alcalase。
4.根据权利要求3所述的一种制备扇贝裙边活性肽的方法，其特征在于:所述步骤(3)中的高温瞬时加热条件为95~100°C，加热时间2分钟。
5.根据权利要求4所述的一种制备扇贝裙边活性肽的方法，其特征在于:所述步骤(4)中的脉冲电场强度为5~15Kv/cm，脉冲频率为2500-3500ΗZ，处理时间为20(T400us。
6.根据权利要求5所述的一种制备扇贝裙边活性肽的方法，其特征在于:所述步骤(5)中选用MWCO为IKD的超滤膜。
7.根据权利要求6所述的一种制备扇贝裙边活性肽的方法，其特征在于:所述步骤(6)中混合床脱盐技术条件为阴离子:阳离子=3:2，过柱速度:5倍柱体积/小时，水解液pH值4.5。
8.根据权利要求7所述的一种制备扇贝裙边活性肽的方法，其特征在于:所述步骤(7)中色谱分离条件为:色谱柱，PheedaC18柱；上样量:lmL ;流速:4mL/min ;检测波长:280nm和 220nm ;洗脱条件:0~3min，100%A ;3~50min，0%~50%B ;50~52min，50%~100%B ;52~58 分钟，100%B ;58~60分钟，100%B~100%A，所述A为5%乙腈和0.05%三氟乙酸，所述B为80%乙腈和0.05%三氟乙酸。
9.根据权利要求8所述的一种制备扇贝裙边活性肽的方法，其特征在于:所述步骤(8)中真空浓缩温度为80~90°C。
10.根据权利要求9所 述的一种制备扇贝裙边活性肽的方法，其特征在于:所述步骤(9)中真空冷冻干燥温度为_30°C。
【文档编号】C12P21/06GK103911416SQ201410145196
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年4月11日 优先权日:2014年4月11日
【发明者】王清光 申请人:青岛老三东食品股份有限公司