专利名称：温室白粉虱特异性scar标记、特异性引物及快速分子鉴定方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体地，涉及温室白粉虱特异性SCAR标记、特异性引物及快速分子鉴定方法。
背景技术：
温室白粉虱(Trialeurodes vaporariorum)是世界范围的灾害性害虫，已报道的寄主植物超过900种(Kirk等，2000)。其以成虫和若虫吸取寄主植物汁液，使叶片褪色、变黄、萎蔫，能分泌大量蜜露，污染果实和叶片。更为重要的是传播植物病毒病，如黄瓜黄化、 番茄褪绿等，严重时可引起叶片干枯、植株死亡等。20世界70年代中期在我国北方地区爆发，之后一直是我国北方地区的主要害虫(朱国仁等，中国蔬菜，2006 (6) :49-51)。特别是近几十年来，北方地区菜田生态系统发生了深刻变化，特别是加温温室和塑料大棚蔬菜生产的迅速发展，为本种害虫提供了冬季繁衍的良好环境，井形成虫源基地，使得原本在露地不能越冬的害虫有了大发生的可能；温室、大棚和露地蔬菜生产紧密衔接、相互交错，使温室白粉虱种群得以繁衍和周年发生，危害加重，在大型连栋温室果菜上常猖獗成灾。目前温室白粉虱仍是我国北方蔬菜生产的重要限制因子(时玉娟，张明欣，刘加娥，李晓英，2011， 中国果菜，(2) :26-28) ο在我国北方地区，温室白粉虱和烟粉虱寄主重叠、危害习性相似，生活史相近，且同域混合发生，外形相似而难以区分。虽然有文献提出其外部形态或显微镜检识别特征 (朱国仁等，中国蔬菜，2006(6) 49-51 ；褚栋等，昆虫知识，2008，45 (1):巧4_155)，但是这两种害虫的外部形态上的快速区分对于非粉虱研究专业人士来说仍旧比较困难，而且由于粉虱害虫的可塑性強，其形态特征会因环境条件、寄主植物差异等存在不同程度的变异，尤其是对于异地采集保存在酒精中的粉虱害虫或者是保存不完整的标本等，采用上面两种方法根本无法鉴別。而分子鉴定技术相对准确、快速，且对于样品的保存相对简单，与样本的完整与否无关，因此，有必要发展其快速分子鉴定技木。随着分子生物学的发展，近年来分子生物学技术发展迅速，利用分子标记技术只需要少量的DNA就可以快速准确地鉴定出昆虫种类，该类技术不仅可以检测成虫，对其它各虫态亦具有同样的检测效能。以前有研究者采用扩增测序mtCOI序列或者ITS2序列，并与已登录在GenBank上的该基因序列一起构建聚类树，由聚类分析得知分析样本与已知序列之间的亲缘关系远近，进而推断出该基因的所属种类(Hinomoto等，2007 ；Vera等，2007 ； Tselila等，2007)。但是该技术需要标本在PCR扩增之后进行测序，这样会耗费大量的财 カ和劳力。限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism，简称 RFLP)和单链构象多态性(Single-Mranded Confirmation Polymorphisms，简称 SSCP) 等技术也通常被用来进行昆虫种类的分子鉴定，但是其过程复杂，需要酶切、扩增或者扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染方法等，需要花费较长时间，费时费力。还有研究者扩增ITS区域片段结合限制性内切酶位点，酶切之后根据片段的长短来判断种的差异(Jeong等，2010, Molecular identincation οι two trιchogramma species (Hymenoptera Trichogrammatidae) in Korea. Journal ofAsia-Pacific Entomology, 13 :41-44) ,O=Liftft 方法尚需要两个操作步骤，且酶切结果受到多种因素影响而易出现切不开或者由于扩增错配导致的酶切位点改变等现象。特征序列扩增区域(sequence characterized amplified regions, SCAR)标记技术是通过随机扩增多态性 DNA(random amplified polymorphic DNA, RAPD)技术筛选出靶标种的特异片段，然后将目标RAPD特异性片段进行克隆和测序， 并根据此目标片段两端的碱基序列设计特异性引物；然后以该对特异性引物对基因组DNA 片段再次进行PCR扩增，进而将与原RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来；SCAR标记为共显性遗传，待检DNA样品间的差异可通过扩增产物的有和无来显示(黎裕等，1999)。与上述其它分子标记方法相比，具有操作简便、灵敏度高等优点，可用于样品的大规模检测。以往田间与温室白粉虱同时发生的烟粉虱生物型仅为B型，然而目前，国内大多数地区发生危害的烟粉虱的优势生物型发生了变化，演替为Q型烟粉虱(Pan等，2011， Journal ofEconomic Entomology.)。但是，目前还未有能够同时鉴别B型、Q型烟粉虱和温室白粉虱的分子标记。因此，本发明通过RAPD扩增，找到温室白粉虱的特异性条带，进而转化为稳定的SCAR标记，来进行温室白粉虱的鉴定识別。使用本发明可快速、廉价地进行田间温室白粉虱的快速识别鉴定，对于其田间的针对性防治具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供ー种温室白粉虱特异性SCAR标记。本发明的另一目的是提供与上述温室白粉虱特异性SCAR标记部分或完全杂交的探针。本发明的另一目的是提供与上述温室白粉虱特异性SCAR标记退火的温室白粉虱特异性SCAR标记引物对。本发明的另ー目的是提供ー种温室白粉虱快速分子鉴定方法。本发明的另一目的是提供用于鉴定温室白粉虱的试剂盒。本发明的另一目的是提供上述温室白粉虱特异性SCAR标记在鉴定温室白粉虱中的应用。本发明的另一目的是提供上述探针和引物对在鉴定温室白粉虱中的应用。本发明以对多种粉虱的基因组DNA为模板，进行RAPD扩增，获得温室白粉虱的特异性SCAR标记，所述特异性SCAR标记的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示gaccgcttgttgacccacagacagagtagc caggaattcatttttctctctcttttccca60
t ししdcgtgtgtgaaaaagacagat gggggggggagggtatcacgtgactttagc120
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aatgaatttg ttcgaaaaat gaaagtgctc agtgagctga tgccagagat ggttttttca 600ttcattttgg acaagcggtc620该温室白粉虱的特异性SCAR标记的核苷酸片段为620bp。根据上述温室白粉虱特异性SCAR标记序列，本发明设计了与上述温室白粉虱特异性SCAR标记部分或完全杂交的探针，以用于特异性标记温室白粉虱。根据上述温室白粉虱特异性SCAR标记序列，本发明设计了温室白粉虱特异性 SCAR标记引物对，用于扩增上述的温室白粉虱特异性SCAR标记。其中，优选ー对特异性 SCAR标记引物，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示iv-F 5 -tgacccacag acagagta-3，。根据上述优选的温室白粉虱特异性SCAR标记引物，其下游引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 3 所示iv-R :5. -cgaaatcgct gactaaat-3，。本发明的温室白粉虱快速分子鉴定方法，其中，所述方法包括使用上述探针进行杂交或使用上述引物对进行PCR扩增的步骤。本发明使用上述优选的温室白粉虱特异性SCAR标记引物对，扩增出412bp温室白粉虱特异性SCAR标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示TGACCCACAGACAGAGTAGCCAGGAATTCATTTTTCTCTCTCTTTTCCCATTCAAACACACGTGTGTGA AAAAGACAGATGGGGGGGGGAGGGTATCACGTGACTTTAGCTCCTGTATATCTGTCATTTCCTAACACAGATGATCA AATGGGTAATGAGAGAGAAAGACGAACTCCTGGATATAGCTATATGCCGACAGCTGTCTTAAAGTCGTTAAGGTGAA TCCGCCGTCGAGGGAACAGTTATAGGTGATTTCGGAACAGACGTTGGAATCGGAATTGGGATAACAATGACCCATTT CTTTTGGTCACATCTTTCGTTTGCGTAGAGATGGAGGGGTCCCTCCAAAACTCCACAAGACTCGATCACTCAAATCA ATCGTTTGATGAAGCAGATTTAGTCAGCGATTTCG本发明获得的620bp的SCAR标记是属于温室白粉虱的特异性序列片段，可以据此设计其它特异性引物对，经过PCR扩增后标记成为具有对温室白粉虱高度种特异性的放射性或者非放射性探针，采用该探针对温室白粉虱的基因组DNA进行杂交，温室白粉虱将表现出较强的杂交信号，其它物种则均无杂交信号，根据杂交信号的有或者无来鉴别出温室白粉虱。或者基于该SCAR标记的序列，设计合成特异性的TaqMan荧光探针及与其配套的特异性引物对，采用荧光定量PCR技术则可检测到温室白粉虱的荧光信号，而对其他种类则不具备检测能力，同时还可定量检测靶标DNA片段的拷贝数。本发明的用于鉴定温室白粉虱的试剂盒，其中，所述试剂盒包括与上述温室白粉虱特异性SCAR标记部分或完全杂交的探针和/或上述温室白粉虱特异性SCAR标记引物对。本发明还提供了上述温室白粉虱特异性SCAR标记在鉴定温室白粉虱中的应用。本发明还提供了上述探针和弓I物对在鉴定温室白粉虱中的应用。本发明通过RAPD扩增，筛选出温室白粉虱的特异性片段，回收测序之后转化为稳定的SCAR分子标记，来进行温室白粉虱的鉴定识別。该SCAR分子标记具有重复性好、特异性强、灵敏度高等优点，能够快速准确地鉴定温室白粉風，且费用低廉。本发明可快速、廉价地进行田间温室白粉虱的快速识别鉴定，对于其田间的针对性防治具有重要意义。
图1引物OPA-17对不同粉虱类害虫的扩增图谱，M :200bp Marke r ； 1-5 温室白粉虱；6-10 =B型烟粉虱；11-15 =Q型烟粉虱；16 空白对照。图2温室白粉虱SCAR引物特异性验证，M 泳道1_7 分别为温室白粉虱、B型烟粉虱、Q型烟粉虱、ZH-2型烟粉虱、黑刺粉虱、柑桔粉虱、螺旋粉虱；8 阴性对照。图3云南、山西、山东和吉林的温室白粉虱种群的SCAR引物扩增結果，M 泳道 1-3 云南昆明温室白粉虱；4-6 山西运城温室白粉虱；7-9 山东济南温室白粉虱；10-12 吉林地区温室白粉虱；13泳道空白对照；每个地区的温室白粉虱种群分别扩增20头，此处图示仅显示3头。图4单头温室白粉虱成虫DNA不同稀释倍数下对SCAR引物的扩增灵敏度检测结果，M :1-8泳道分別为单头温室白粉虱基因组DNA原液、稀释IOiUO2UO3UO4UO5UO6UO7 倍时的SCAR扩增結果。
具体实施例方式试验材料和试剂试虫温室白粉虱试虫由中国农业科学院植物保护研究所提供，寄主植物为甘蓝。B型畑粉虱和Q型烟粉虱饲养于中国农业科学院蔬菜花卉研究所，寄主植物分別为甘蓝和棉花， 期间不使用任何农药。其他对照试虫样品，如柑橘粉虱2011年10月份采集于中国农业科学院院内菊花寄主上，螺旋粉虱和黑刺粉虱于2011年10月25日分別采集于海南儋州的番石榴寄主和海ロ大坡镇福昌村的酸桔寄主上。ZJ-2型烟粉虱样品由中国农业科学院植物保护研究所提供。供试试剂随机引物采用Operon公司的RAPD通用引物系列，采用0PA、0PB、0PC系列，每个系列包含20条引物。随机引物和特异性引物分別由上海英竣生物工程公司合成和北京擎科生物工程公司合成。序列测序由北京擎科生物工程有限公司进行。PCR扩增中使用的聚合酶为2XTaq 10MASTER Mix(0. IU TaqE/ μ 1)购自北京奥赛博科技发展有限公司。试虫的基因组DNA提取试剂盒和克隆试剂盒分别购自北京百泰克生物技术有限公司和北京全式金生物技术有限公司。说明以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均參照《分子克隆实验指南》(第三版)J-萨姆布鲁克ー书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。实施例1单头粉虱害虫DNA提取基因组DNA的提取采用百泰克科技有限公司的基因组提取试剂盒，具体操作如下(1)将单头粉虱置于滴有 ο μ L裂解液中的ParafiIm膜上，以0. 2mL的PCR管底部作为勻浆器充分研磨，用另20 μ L的裂解液清洗勻浆器2次，合并混勻；(2)以微量移液器移入 1. 5mL离心管内，加入2 μ L蛋白酶K，混勻，55°C下水浴4小时或者过夜；(3)离心几秒钟，加入RNase 2. 5 μ L，置于37°C烘箱15-30min ； (4)取出上述样品，晾至室温，加入蛋白沉淀液 25 μ L，漩涡振荡器上高速震荡25s ； (5)冰浴5min，沉淀蛋白；室温离心，13000r/min，离心5min;小心吸取上清液到另ー个新管中(不要吸入沉淀)；(6)加入等体积的异丙醇50 μ L， 颠倒混勻30次；(7)室温下12000r/min离心lOmin，弃上清，加入ImL 70%乙醇颠倒漂洗 DNA沉淀，室温下12000r/min离心2min，弃上清；(8)加入ImL无水乙醇颠倒漂洗DNA沉淀， 室温12000r/min离心2min，弃上清；(9)加入20 μ L DNA溶解液，65°C下水浴60min，溶解 DNA，然后置-20°C保存备用。实施例2RAPD扩增以上述材料与方法中的供试样品的基因组DNA为模板，采用60条随机引物分别进行随机扩增，记录筛选出来的特异条带以及相应扩增引物，并对这些条带进行标记。扩增总体积为 20 μ L,分别包含 10 μ L2 XMix,DNA 模板 1 μ L、RAPD 引物(IOmM) 3 μ L 禾ロ 6 μ Ldd H2O0 PCR反应程序为首先进行94°C预变性％iin，之后进行40个循环，包括94°C lmin，37°C退火50s，72°C延伸lmin 35s，最后72°C延伸lOmin。分別取各样品的PCR扩增产物6 μ L上样电泳。RAPD随机扩增中，发现0ΡΑ-17引物扩增时，对于温室白粉虱表现出很强的种的特异性，一条620bp的DNA条带在温室白粉虱中出现，且该特异性条带很亮，且在检测的M头个体中均稳定出现，而在其他烟粉虱生物型或者其它粉虱种类中均未出现，见图1。实施例3特异性扩增产物的回收克隆、SCAR引物设计及PCR扩增对RAPD扩增结果中发现温室白粉虱样品中的特异性条带进行标记。在琼脂糖凝胶电泳上回收该特异性条带，采用DNA纯化试剂盒(百泰克，北京)进行纯化，把该纯化片段连接到PEASY-Tl载体(全式金，北京)上，转化到TOPlO感受态细胞上，37°C条件下倒置培养过夜，挑取白色阳性克隆，加入LB液体培养基中37°C过夜振荡培养，最后采用北京百泰克生物技术有限公司的质粒提取试剂盒提取质粒，阳性质粒采用通用引物M13正向和反向引物扩增验证后，送北京交擎科生物工程有限公司进行测序。测序结果如SEQ ID NO. 1所示
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温室白粉虱的特异性扩增片段为620bp，该基因序列在NCBI网站上进行BLAST I
对，未发现任何和该基因片段具有较高相似性的序列，说明该片段特异性很強。
基于特异性片段的序列测定结果，采用ft~imer 5软件设计ー对SCAR特异性引物，上游和下游引物序列分别为=Tv-F :5，-tgacccacag acagagta-3，和Tv-R 5，-cgaaatcgctgactaaat_3，(序列中下划线部分)，反应体系设定为20 μ L，其中2 X ES Mix为10 μ L，上游引物和下游引物分别为1 μ L，DNA模板为1 μ L，ddH20是7 μし反应程序如下94 °C预变性;Min，之后进行;35个循环(94°C变性lmin，59°C退火45sec，72°C延伸Imin 50sec)，最后72°C延伸lOmin。预期扩增片段大小为507bp。实施例5引物特异性和灵敏性检验采用B型烟粉虱、Q型烟粉虱、黑刺粉虱、螺旋粉虱、柑橘粉虱及ZJ-2型烟粉虱作为对照种，通过PCR扩增验证温室白粉虱SCAR引物的特异性。将单头温室白粉虱成虫的基因组DNA提取之后，依次进行10倍梯度稀释，检验该SCAR引物扩增的灵敏性。采用特异性SCAR 引物 M:Tv-F(5，-tgacccacagacagagta-3，)· Tv-R(5‘-cgaaatcgctgactaaat-3‘)来对温室白粉虱种群进行PCR扩增，以其它烟粉虱不同生物型或者其它粉虱种类作为对照种群，发现仅在温室白粉虱中出现一条412bp的特异性条带，且该条带在回收克隆测序后发现与原来的RAPD特异性条带中的对应片段的序列完全一致。而在作为对照的其它粉虱种类或烟粉虱生物型中均未出现任何条帯，见图2，说明该特异性引物对于温室白粉虱存在着种的特异性。另外，对采集自云南和山西田间的温室白粉虱种群进行形态鉴定之后，采用该SACR引物进行扩增检验，结果表明在每头试虫中均出现了预期的412bp的DNA片段(SEQ ID. 4，图3)。将单头温室白粉虱的基因组DNA依次梯度稀释之后，发现DNA模板稀释到IO7时未见扩增条帯，见图4，表明该SCAR引物对具有很高的扩增灵敏度。
权利要求
1.ー种温室白粉虱特异性SCAR标记，其特征在干，所述特异性SCAR标记的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
2.与权利要求1所述的温室白粉虱特异性SCAR标记部分或完全杂交的探针。
3.与权利要求1所述的温室白粉虱特异性SCAR标记退火的温室白粉虱特异性SCAR标记引物对。
4.根据权利要求3所述的温室白粉虱特异性SCAR标记引物对，其特征在干，所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示的引物。
5.ー种温室白粉虱快速分子鉴定方法，其特征在干，所述方法包括使用权利要求2所述探针进行杂交或权利要求3所述引物对进行PCR扩增的步骤。
6.ー种用于鉴定温室白粉虱的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述探针和/或权利要求3所述引物对。
7.权利要求1所述温室白粉虱特异性SCAR标记在鉴定温室白粉虱中的应用。
8.权利要求2所述探针或权利要求3所述引物对在鉴定温室白粉虱中的应用。
全文摘要
本发明涉及分子生物学领域，具体地，涉及温室白粉虱特异性SCAR标记、特异性引物及快速分子鉴定方法。本发明的温室白粉虱特异性SCAR标记，所述特异性SCAR标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还包括与上述温室白粉虱特异性SCAR标记杂交的探针或与其退火的标记引物对。本发明的温室白粉虱快速分子鉴定方法，包括使用上述温室白粉虱特异性SCAR标记探针进行杂交或与其退火的特异性引物进行PCR扩增的步骤。本发明的SCAR分子标记具有重复性好、特异性强、灵敏度高等优点，能够快速准确地鉴定温室白粉虱，且费用低廉。本发明可快速、廉价地进行田间温室白粉虱的快速识别鉴定，对于其田间的针对性防治具有重要意义。
文档编号C12Q1/68GK102534007SQ201210011448
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月14日 优先权日2012年1月14日
发明者吴青君, 张友军, 王少丽, 王金娜, 谢文, 闫文茜 申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所