本发明属于生物领域，具体涉及一种利用三七愈伤组织产生紫色素的方法。
背景技术：
：三七为五加科人参属植物，有“金不换”、“南国神草”、“参中之王”等美誉，是云南特有的名贵中药材，也是我国中医药中一颗璀璨的明珠。三七紫色素为一种存在于三七植株茎、叶、花及根的细胞液中的化合物，使植株呈现出红、紫红、兰等不同颜色。三七紫色素的本质为花色苷，花色苷是类黄酮--以黄酮核为基础的一类物质中能呈现红色的一族化合物。由于它具有独特的功能性，而被应用于清除体内自由基、增殖叶黄素、抗肿瘤、抗癌、抗炎、抑制脂质过氧化和血小板凝集、预防糖尿病、减肥、保护视力等。花色苷作为一种天然色素，安全、无毒，且对人体具有许多保健功能，已被应用于食品、保健品、化妆品、医药等行业。然而，目前并无关于三七紫色素的利用与开发的相关文献及报道。技术实现要素：本发明的目的是提供一种通过组织培养手段培养出富含紫色素的三七愈伤组织，并利用其提取紫色素。本发明提供的技术方案：一种利用三七愈伤组织产生紫色素的方法，以三七植株幼嫩的茎、叶、花或花药作为外植体，经过灭菌、接种、诱导培养产生愈伤组织，对愈伤组织进行二次灭菌、接种及继代培养得到传代愈伤组织，并从传代愈伤组织中提取所述紫色素；其中所述的诱导培养中的光照控制为4～8小时光照条件和4～8小时黑暗条件交替进行；所述继代培养的光照控制为10～15小时光照条件和10～15小时黑暗条件交替进行。进一步的，所述愈伤组织诱导培养的培养基为：MS+0.1～2mg/L2,4-D+0.1～2mg/LBA+0.002～1mg/LTDZ+30～60g/L蔗糖(即：在每一升的MS培养基中添加0.1～2mg2,4-D、0.1～2mgBA、0.002～1mgTDZ和30～60g蔗糖)；或MS+0.1～2mg/LNAA+0.1～2mg/LBA+0.002～1mg/LTDZ+30～60g/L蔗糖(即：在每一升的MS培养基中添加0.1～2mgNAA、0.1～2mgBA、0.002～1mgTDZ和30～60g蔗糖)。所述MS为MS培养基，NAA为萘乙酸，2，4-D为2,4-二氯苯氧乙酸，BA为苄氨基腺嘌呤，TDZ为噻苯隆。进一步的，所述愈伤组织继代培养的培养基为：MS+0.1～2mg/LNAA+0.1～2mg/LBA+0.002～4mg/LTDZ(即：在每一升的MS培养基中添加0.1～2mgNAA、0.1～2mgBA和0.002～1mgTDZ)。进一步的，所述诱导培养的光照强度为1500—2000lx。进一步的，所述继代培养的光照强度为1000—1500lx。进一步的，所述的愈伤组织的大小为直径1～2cm。进一步的，所述紫色素的提取方法包括溶剂提取、超声提取、超临界流体萃取、微波提取中的一种或多种。进一步的，还包括对所述紫色素的纯化处理。进一步的，所述的纯化处理包括萃取、重结晶、柱层析分离，大孔树脂分离、离子树脂分离中的一种或多种组合。本发明的有益效果：本发明通过对光照时间、培养基、湿度、温度等条件控制，培养出富含紫色素、诱导率高的愈伤组织。本发明通过缩短光照与黑暗的交替时间的方法有效的提高了三七紫色素的含量，并在培养基中加入TDZ及与其他植物激素的搭配，使三七愈伤组织的诱导率明显提高，并有利于紫色素的形成。同时本发明也对愈伤组织进行诱导培养，使诱导出的愈伤组织避免分化，形成大量增殖的愈伤组织，并对继代培养的培养基及环境控制、对光照时间、湿度、温度等条件控制，培养出富含紫色素、增殖率高的愈伤组织。本发明诱导培养的三七愈伤组织紫色素含量高，诱导率高，增殖率高。本发明利用组织培养繁殖效率高、生长周期短的优点，建立适合三七紫色素愈伤组织生长的组培条件，从而提供大量的优质的富含紫色素的愈伤组织，为从三七愈伤组织中提取紫色素提供物质基础，有利于自动化、规模化生产,提高生产效率。具体实施方式实施例1一种利用三七愈伤组织产生紫色素的方法，包括以下步骤：选取健康的三七植株幼嫩的茎、叶、花作为外植体，用清水冲洗5次，先用70％的酒精灭菌10s，用无菌水冲洗3次后，再将冲洗后的外植体置于浓度为0.1％的升汞中，浸泡灭菌，无菌去离子水冲洗6次，备用。在无菌环境中将经过灭菌的茎、叶、花切割为0.5cm2的块状外植体；在无菌的条件下，在酒精灯火焰附近打开组培瓶，瓶口在火焰上灼烧一下，将切好的外植体接种到培养基上，每瓶培养基接种3～5块外植体。在MS+0.1mg/L2,4-D+0.1mg/LBA+0.002mg/LTDZ+30g/L蔗糖的培养基中进行诱导培养，培养周期为4—5周。其中，光照控制为4小时光照条件和4小时黑暗条件交替进行，光照强度为1500lx；温度：22℃；空气相对湿度：50％。选取生长至直径1cm的三七愈伤组织，在无菌环境中将三七愈伤组织分割成0.5mm2的方型小块，在无菌的条件下，在酒精灯火焰附近打开组培瓶，瓶口在火焰上灼烧一下，将切好的愈伤组织接种到继代培养基上，其中，继代培养的培养基为MS+0.1mg/LNAA+0.1mg/LBA+0.002mg/LTDZ，培养4周，得到传代愈伤组织。其中，光照控制为10小时光照、10小时黑暗，交替进行，光照控制的光强度为1000lx。继代培养的温度为22℃；空气相对湿度：50％。将培养得到的传代愈伤组织用有机溶剂乙醇进行溶剂提取和超声提取，并进行萃取、重结晶纯化得到紫色素。实施例2一种利用三七愈伤组织产生紫色素的方法，包括以下步骤：选取健康的三七植株幼嫩的茎、叶、花作为外植体，用清水冲洗6次，先用70％的酒精灭菌10s，用无菌水冲洗3次后，再将冲洗后的外植体置于浓度为0.1％的升汞中，浸泡灭菌，无菌去离子水冲洗8次，备用。在无菌环境中将经过灭菌的茎、叶、花切割为0.5cm2的块状外植体；在无菌的条件下，在酒精灯火焰附近打开组培瓶，瓶口在火焰上灼烧一下，将切好的外植体接种到培养基上，每瓶培养基接种5块外植体。其中的诱导培养基为MS+2mg/L2,4-D+2mg/LBA+1mg/LTDZ+60g/L蔗糖。其中，光照控制为8小时光照条件和8小时黑暗条件交替进行,光照强度为2000lx；温度：25℃；空气相对湿度：80％；培养周期为5周。选取生长至直径1-2cm的三七愈伤组织，在无菌环境中将三七愈伤组织分割成0.5mm2的方型小块，在无菌的条件下，在酒精灯火焰附近打开组培瓶，瓶口在火焰上灼烧一下，将切好的愈伤组织接种到继代培养基上，其中，继代培养的培养基为MS+2mg/LNAA+2mg/LBA+4mg/LTDZ,培养5周。其中，光照控制为15小时光照、15小时黑暗，交替进行，光照控制的光强度为1500lx。继代培养的温度为25℃；空气相对湿度：80％。将培养得到的传代愈伤组织进行超声提取，并用柱层析分离的方法纯化得到紫色素。实施例3一种利用三七愈伤组织产生紫色素的方法，包括以下步骤：选取健康的三七的花药作为外植体，将三七花清水冲洗5次，先用70％的酒精灭菌10s，再将冲洗后的外植体置于浓度为0.1％的升汞中，浸泡灭菌，无菌去离子水冲洗6次，备用。在无菌滤纸上剥取花药；在无菌的条件下，在酒精灯火焰附近打开组培瓶，瓶口在火焰上灼烧一下，将花药接种到组培瓶中，每瓶15粒；在MS+0.1mg/LNAA+0.1mg/LBA+0.002mg/LTDZ+30g/L蔗糖，的培养基中进行诱导培养。其中，光照控制为6小时光照条件和6小时黑暗条件交替进行，光照强度为1600lx；温度：22℃；空气相对湿度：50％，培养周期为6周。选取生长至直径2cm的三七愈伤组织，在无菌环境中将三七愈伤组织分割成0.5mm2的方型小块，在无菌的条件下，在酒精灯火焰附近打开组培瓶，瓶口在火焰上灼烧一下，将切好的愈伤组织接种到继代培养基上，其中，继代培养的培养基为MS+1mg/LNAA+1.2mg/LBA+0.08mg/LTDZ，培养4周。其中，光照控制为12小时光照、12小时黑暗，交替进行，光照控制的光强度为1200lx。继代培养的温度为23℃；空气相对湿度：60％。将培养得到的传代愈伤组织进行超临界流体萃取方法提取，并用大孔树脂及柱层析分离的方法纯化得到紫色素。实施例4一种利用三七愈伤组织产生紫色素的方法，包括以下步骤：选取健康的三七的花药作为外植体，将三七花清水冲洗6次，先用70％的酒精灭菌10s，再将冲洗后的外植体置于浓度为0.1％的升汞中，浸泡灭菌，无菌去离子水冲洗8次，备用。在无菌滤纸上剥取花药；在无菌的条件下，在酒精灯火焰附近打开组培瓶，瓶口在火焰上灼烧一下，将花药接种到组培瓶中，每瓶20粒；在MS+2mg/LNAA+2mg/LBA+1mg/LTDZ+60g/L蔗糖的培养基中进行诱导培养。其中，光照控制为5小时光照条件和5小时黑暗条件交替进行，光照强度为1700lx；温度:25℃；空气相对湿度:80％，培养周期为7周。选取生长至直径2cm的三七愈伤组织，在无菌环境中将三七愈伤组织分割成0.5mm2的方型小块，在无菌的条件下，在酒精灯火焰附近打开组培瓶，瓶口在火焰上灼烧一下，将切好的愈伤组织接种到继代培养基上，其中，继代培养的培养基为MS+0.8mg/LNAA+0.5mg/LBA+2mg/LTDZ，培养4周。其中，光照控制为13小时光照、13小时黑暗，交替进行，光照控制的光强度为1400lx。继代培养的温度为23℃；空气相对湿度：60％。将培养得到的传代愈伤组织进行微波方法提取，并用离子树脂的方法纯化得到紫色素。不同植物激素对三七愈伤组织的诱导率及紫色素含量的影响试验：选取4组健康的三七植株幼嫩的茎作为外植体，经过相同的灭菌处理，分别接种于4组诱导培养基：(1)MS+0.1mg/L2,4-D+0.1mg/LBA+30g/L蔗糖、(2)MS+0.1mg/LNAA+0.1mg/LBA+30g/L蔗糖、(3)MS+0.1mg/L2,4-D+0.1mg/LBA+0.1mg/LTDZ+30g/L蔗糖、(4)MS+0.1mg/LNAA+0.1mg/LBA+0.1mg/LTDZ+30g/L蔗糖。在相同的环境下进行培养，其中光照控制为8小时光照条件和8小时黑暗条件交替进行,光照强度为2000lx；温度：25℃；空气相对湿度：80％；培养5周后对其诱导率及紫色素的含量进行测试。表1，不同植物激素对三七愈伤组织的诱导率及紫色素含量编号2,4-DNAABATDZ诱导率紫色素含量10.100.108％1％200.10.106％2％30.100.10.148％18％400.10.10.151％19％从表1的结果可以看出，TDZ的添加能明显提高三七的诱导愈伤组织的诱导率，有利于愈伤组织的增殖及富含紫色素愈伤组织的诱导，使其紫色素的含量明显提高。不同植物激素对三七愈伤组织的继代培养增殖率及紫色素含量的影响试验：选取3组相同的三七愈伤组织进行继代培养，在无菌环境中将三七愈伤组织分割成0.5mm2的方型小块，在无菌的条件下，在酒精灯火焰附近打开组培瓶，瓶口在火焰上灼烧一下，分别将切好的愈伤组织接种到3组不同的继代培养基上，其中，继代培养基分别为：(1)MS+0.1mg/LTDZ、(2)MS+0.1mg/LNAA+0.1mg/LBA及(3)MS+0.1mg/LNAA+0.1mg/LBA+0.1mg/LTDZ。在相同的环境下进行培养，其中光照控制为12小时光照条件和12小时黑暗条件交替进行,光照强度为1000lx；温度：25℃；空气相对湿度：80％；培养5周后对其增殖率及紫色素的含量进行测试。表2，不同植物激素对三七愈伤组织的继代培养的增殖率及紫色素含量编号NAABATDZ增殖率紫色素含量1000.112％8％20.10.1042％1％30.10.10.172％19％从表2的结果可以看出，TDZ的添加能明显有利于三七的愈伤组织的继代培养，能明显提高愈伤组织的增殖率及愈伤组织中紫色素的含量，获得高增殖率及紫色素含量高的愈伤组织。TDZ与NAA和BA的协同作用有利于愈伤组织的增殖与生长，及紫色素的产生。不同光照条件对愈伤组织的诱导率及紫色素含量的影响试验：选取6组健康的三七植株幼嫩的茎作为外植体，经过相同的灭菌处理，接种于相同的诱导培养基MS+0.1mg/L2,4-D+0.1mg/LBA+0.1mg/LTDZ+30g/L蔗糖中。对其进行不同的光照处理，分别为(1)4小时光照条件和4小时黑暗条件交替进行,(2)6小时光照条件和6小时黑暗条件交替进行,(3)8小时光照条件和8小时黑暗条件交替进行,(4)12小时光照条件和12小时黑暗条件交替进行,(5)24小时光照条件和24小时黑暗条件交替进行,(6)36小时光照条件和36小时黑暗条件交替进行。6组的光照强度为2000lx；温度：25℃；空气相对湿度：80％；培养5周后对其诱导率及紫色素的含量进行测试。表3，不同光照条件对三七愈伤组织的诱导率及紫色素含量光照交替时间468122436诱导率32％48％39％24％20％18％紫色素含量14％18％12％5％1％1％从表3的结果可以看出，使用光照与黑暗交替的光照条件能有效提高三七愈伤组织中紫色素的形成，其中缩短光照与黑暗的交替时间与愈伤组织中紫色素的含量成正比。不同光照条件对愈伤组织的继代培养的增殖率及紫色素含量的影响试验：选取6组相同的三七愈伤组织进行继代培养，在无菌环境中将三七愈伤组织分割成0.5mm2的方型小块，在无菌的条件下，在酒精灯火焰附近打开组培瓶，瓶口在火焰上灼烧一下，将切好的愈伤组织接种到MS+0.1mg/LNAA+0.1mg/LBA+0.1mg/LTDZ的继代培养基上，对其进行不同的光照处理，分别为(1)5小时光照条件和5小时黑暗条件交替进行,(2)10小时光照条件和10小时黑暗条件交替进行,(3)12小时光照条件和12小时黑暗条件交替进行,(4)15小时光照条件和15小时黑暗条件交替进行,(5)20小时光照条件和20小时黑暗条件交替进行,(6)30小时光照条件和30小时黑暗条件交替进行。6组的光照强度为1000lx；温度：25℃；空气相对湿度：80％；培养5周后对其增殖率及紫色素的含量进行测试。表4，不同光照条件对三七愈伤组织的继代培养的增殖率及紫色素含量光照交替时间51012152030增殖率36％48％70％62％36％30％紫色素含量8％18％19％13％5％3％从表4的结果可以看出，使用光照与黑暗交替的光照条件与三七愈伤组织中紫色素的形成有影响，其中12小时光照条件和12小时黑暗条件最有利于紫色素的形成，紫色素的含量最高，同时还提高了三七愈伤组织继代培养的增殖率。不同光照强度对愈伤组织的诱导率及紫色素含量的影响试验：选取5组健康的三七植株幼嫩的茎作为外植体，经过相同的灭菌处理，接种于相同的诱导培养基中：MS+0.1mg/L2,4-D+0.1mg/LBA+0.1mg/LTDZ+30g/L蔗糖，置于温度：25℃；空气相对湿度：80％；6小时光照条件和6小时黑暗条件交替进行的环境中,。其中，5组的光照强度分别为800lx，1500lx，2000lx，2500lx；培养5周后对其诱导率及紫色素的含量进行测试。表5，不同光照强度对三七愈伤组织的诱导率及紫色素含量光照强度8001500200025003000诱导率9％48％51％24％12％紫色素含量3％18％19％2％1％从表5的结果可以看出，光照强度为1500lx，2000lx的条件下有利于提高三七愈伤组织中紫色素的形成。不同光照强度对愈伤组织的继代培养的增殖率及紫色素含量的影响试验：选取5组相同的三七愈伤组织进行继代培养，在无菌环境中将三七愈伤组织分割成0.5mm2的方型小块，在无菌的条件下，在酒精灯火焰附近打开组培瓶，瓶口在火焰上灼烧一下，将切好的愈伤组织接种到MS+0.1mg/LNAA+0.1mg/LBA+0.1mg/LTDZ的继代培养基上，其中，5组的光照强度分别为800lx，1000lx，1500lx，2000lx，2500lx；培养5周后对其增殖率及紫色素的含量进行测试。表6，不同光照强度对三七愈伤组织的继代培养的增殖率及紫色素含量光照强度80010001500200025003000增殖率52％70％72％42％32％12％紫色素含量3％18％19％5％2％0.5％从表6的结果可以看出，不同光照强度与三七愈伤组织中紫色素的形成有明显的影响，其中1000lx～1500lx的光照强度最有利于紫色素的形成，紫色素的含量最高，同时还提高了三七愈伤组织继代培养的增殖率。当前第1页1 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