一种南美星油藤快速繁殖的方法与流程

本发明属于细胞工程组织培养技术领域，具体涉及一种南美星油藤快速繁殖的方法。

背景技术：

南美星油藤(Plukenetia volubilis L.)又名南美油藤、印加果、印加花生等，印加语称Sacha Inchi，为大戟科多年生常绿木质藤本油料作物，原产于南美洲安第斯山脉的热带雨林地区。该植物当年种植当年即可开花结实，2～3年即进入丰产期，盛产期长达10年以上。从南美星油藤种子中榨取的油含有较高的不饱和脂肪酸(尤其是亚麻酸和亚油酸)、V_A和V_E，对调整人体血脂、预防心血管疾病、保养肌肤防衰老等作用明显，广泛用于食品、制药、保健和化妆品等领域，被誉为“植物脑黄金”。此外，南美星油藤还可作为退耕还林地区替代树种，是一种极具开发和推广利用前景的经济油料作物。

南美星油藤引入我国的时间较短，目前主要在云南西南部、贵州和海南少部分地区有种植。其种苗繁育主要为种子直接播种、嫁接和扦插繁殖等方式，种子播种虽在短时间内可获得大量幼苗，但因南美星油藤为异花授粉植物，种子播种遗传性状不稳定，难以保留亲本的优良性状；嫁接繁殖操作程序繁琐，技术要求高，不易掌握；扦插繁殖则需要大量枝条，且繁殖率较低，耗时较长，这在很大程度上影响了南美星油藤规模化、产业化的生产和市场化的要求。而植物组织培养技术具有繁殖系数高、繁殖时间短、改良植物品质、不受季节限制等优点，可有效地解决南美星油藤繁殖系数低、繁殖时间长等问题。

目前，关于南美星油藤组织培养的研究仅见于以种子播种获得的无菌苗为实验材料，以无菌苗的顶芽为外植体，通过芽的诱导、增殖、生根及移栽等方式达到微繁的目的，繁殖效果不理想。公开号为CN 104798684A的中国专利文献公开了一种南美星油藤的组织培养快繁方法，以南美星油藤带节茎段为外植体，通过不定芽诱导、增殖、生根、炼苗移栽等过程成功获得了南美星油藤离体再生植株。该方法虽成功地获得了南美星油藤离体再生植株，但是其不定芽的诱导率不高(92.7％)，也未对外植体进行愈伤组织的诱导及分化等研究。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种南美星油藤育苗的方法。

本发明提供的南美星油藤育苗的方法包括如下步骤：

(1)将南美星油藤的外植体在愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，得到愈伤组织；

(2)将所述愈伤组织在愈伤组织诱导分化培养基上进行诱导分化培养，得到不定芽；

(3)将所述不定芽在壮苗生根培养基上进行壮苗生根培养，得到南美星油藤幼苗。

上述方法中，

所述南美星油藤的外植体为南美星油藤枝条；所述南美星油藤枝条为当年生未木质化的南美星油藤枝条；

所述愈伤组织诱导培养基中的溶质包括IBA、6-BA和TDZ；

所述愈伤组织诱导分化培养基中的溶质包括IBA、CCC和TDZ；

所述壮苗生根培养基中的溶质包括IBA和AC；

所述愈伤组织诱导培养基中的IBA、6-BA和TDZ的质量比为1：(1-10)：(1-10)；

所述愈伤组织诱导分化培养基中的IBA、CCC和TDZ的质量比为1：(1-3)：(1-10)；

所述壮苗生根培养基中的IBA和AC的质量比为(0.1-1)：1。

上述方法中，

所述愈伤组织诱导培养基是将基础培养基、IBA、6-BA、TDZ、蔗糖和凝固剂混匀得到的培养基；

所述愈伤组织诱导分化培养基是将基础培养基、IBA、CCC、TDZ、蔗糖和凝固剂混匀得到的培养基；

所述壮苗生根培养基是将基础培养基、IBA、AC、蔗糖和凝固剂混匀得到的培养基。

上述方法中，

所述愈伤组织诱导培养基和所述愈伤组织诱导分化培养基中的基础培养基为MS培养基，其配方如下：NH₄NO₃ 1.65g/L,H₃BO₃ 6.2mg/L,CaCl₂ 332.2mg/L,CoCl₂﹒6H₂O 0.025mg/L,CuSO₄﹒5H₂O 0.025mg/L,EDTA二钠二水合物37.26mg/L,FeSO₄﹒7H₂O 27.8mg/L,MgSO₄ 180.7mg/L,MnSO₄﹒H₂O 16.9mg/L,Na₂MoO₄﹒2H₂O 0.25mg/L,KI 0.83mg/L,KNO₃ 1.9g/L,KH₂PO₄ 170mg/L,ZnSO₄﹒7H₂O 8.6mg/L。

所述壮苗生根培养基中的基础培养基可以是上述MS培养基，也可以是MS _vit培养基，所述MS _vit培养基的配方如下：NH₄NO₃ 1.65g/L,H₃BO₃ 6.2mg/L,CaCl₂ 332.2mg/L,CoCl₂﹒6H₂O 0.025mg/L,CuSO₄﹒5H₂O 0.025mg/L,EDTA二钠二水合物37.26mg/L,FeSO₄﹒7H₂O 27.8mg/L,甘氨酸2mg/L,MgSO₄ 180.7mg/L,MnSO₄﹒H₂O 16.9mg/L,Na₂MoO₄﹒2H₂O 0.25mg/L,肌醇100mg/L,尼克酸0.5mg/L,KI 0.83mg/L,KNO₃ 1.9g/L,KH₂PO₄ 170mg/L,盐酸吡哆醇0.5mg/L,盐酸硫胺素0.1mg/L,ZnSO₄﹒7H₂O 8.6mg/L。

上述方法中，

所述IBA在所述愈伤组织诱导培养基中的浓度为0-1.0mg/L；

所述6-BA在所述愈伤组织诱导培养基中的浓度为0-1.0mg/L；

所述TDZ在所述愈伤组织诱导培养基中的浓度为0.5-2.0mg/L；

所述IBA在所述愈伤组织诱导分化培养基中的浓度为0-2.0mg/L；

所述CCC在所述愈伤组织诱导分化培养基中的浓度为0-1.0mg/L；

所述TDZ在所述愈伤组织诱导分化培养基中的浓度为0-1.0mg/L；

所述IBA在所述壮苗生根培养基中的浓度为0-2.0mg/L；

所述AC在所述壮苗生根培养基中的浓度为0-1.0mg/L。

上述方法中，

所述凝固剂为琼脂；

所述IBA在所述愈伤组织诱导培养基中的浓度为0.5mg/L；

所述6-BA在所述愈伤组织诱导培养基中的浓度为1.0mg/L；

所述TDZ在所述愈伤组织诱导培养基中的浓度为0.5mg/L；

所述IBA在所述愈伤组织诱导分化培养基中的浓度为0.1mg/L；

所述CCC在所述愈伤组织诱导分化培养基中的浓度为0.1mg/L；

所述TDZ在所述愈伤组织诱导分化培养基中的浓度为0.1mg/L；

所述蔗糖在所述愈伤组织诱导培养基和所述愈伤组织诱导分化培养基中的浓度均为30g/L；

所述琼脂在所述愈伤组织诱导培养基、所述愈伤组织诱导分化培养基和所述壮苗生根培养基中的浓度均为8g/L；

所述IBA在所述壮苗生根培养基中的浓度为0.1mg/L；

所述AC在所述壮苗生根培养基中的浓度为1g/L；

所述蔗糖在所述壮苗生根培养基中的浓度为40g/L。

上述方法中，

所述培养基的pH均为5.8-6.0。

上述方法中，

所述培养的条件均为：温度23-27℃，相对湿度55-60％，光照强度40μmol m^-2·s^-1，光照时间12h/d。

上述方法中，

所述在愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养前还包括消毒的步骤；

所述壮苗生根培养后还包括炼苗移栽的步骤。

本发明的另一个目的是提供上述愈伤组织诱导培养基或上述愈伤组织诱导分化培养基或上述壮苗生根培养基。

本发明还有一个目的是提供一种用于南美星油藤育苗的试剂盒。

本发明提供的用于南美星油藤育苗的试剂盒包括上述愈伤组织诱导培养基和/或上述愈伤组织诱导分化培养基和/或上述壮苗生根培养基。

本发明的最后一个目的是提供上述方法或上述愈伤组织诱导培养基或上述愈伤组织诱导分化培养基或上述壮苗生根培养基或上述试剂盒的新用途。

本发明提供了上述方法或上述愈伤组织诱导培养基或上述愈伤组织诱导分化培养基或上述壮苗生根培养基或上述试剂盒在如下(1)-(4)中任一种中的应用：

(1)提高南美星油藤的愈伤组织诱导率；

(2)提高南美星油藤愈伤组织分化出的不定芽数；

(3)提高南美星油藤不定芽的生根数；

(4)提高南美星油藤的植株成活率。

本发明的突出优点在于：

(1)本发明对南美星油藤进行愈伤组织的诱导和分化试验，通过选取生长健壮、当年生未木质化的南美星油藤枝条为外植体，进行愈伤组织的诱导分化，在短时间内培育出大量长势优良的南美星油藤幼苗，为其工厂化生产提供了技术参考。

(2)本发明涉及IBA、CCC、TDZ和6-BA等植物激素可显著提高愈伤组织的诱导率和分化形成不定芽的能力；其中，TDZ(噻苯隆)能快速诱导外植体从愈伤组织的形成到不定芽的分化，AC等可抑制培养过程中外植体及愈伤组织的褐化。

(3)采用本发明所述的培养方法培养20d左右愈伤组织诱导率达100％，产生的愈伤组织呈浅绿色，质地较疏松，健康；继续培养15～20d，约98％以上愈伤组织可诱导分化形成不定芽，且不定芽的平均发芽数达12.83个，长势较好。

本发明提供了一种通过植物组织培养方法短时间内获得大量优质的南美星油藤种苗的方法。以南美星油藤当年生未木质化的枝条为外植体，经过外植体表面消毒、外植体培养诱导愈伤组织、愈伤组织诱导芽的分化和伸长、壮苗生根、炼苗移栽等步骤获得再生植株的一种方法，整个过程在可控条件下进行，不受季节限制，还大大缩短了繁殖周期，增加了繁殖倍数，为满足对南美星油藤优质种苗的需求、加速南美星油藤良种的推广具有重要的现实意义。另外，大多数的遗传转化方法都是建立在细胞和组织能够再生成完整植株的基础之上，本方法以南美星油藤当年生未木质化的枝条为外植体，进行愈伤组织的诱导和分化获得再生植株，由此可筛选出高产、优质、抗病、抗逆性较强的优良植株，可成为以后快速获得大量优质种苗和基因改良的一种高效可行的技术手段。通过实验证明：本发明的方法可大大加快其繁殖速率、增加繁殖倍数、缩短育种年限，为以后南美星油藤的大面积推广和规模化种植提供理论依据和技术参考，同时还可为以后南美星油藤的基因改良、遗传转化等研究奠定基础。

附图说明

图1为外植体培养诱导愈伤组织效果图。

图2为愈伤组织诱导分化形成不定芽效果图。

图3为诱导分化形成芽的伸长效果图。

图4为壮苗生根培养效果图。

图5为炼苗移栽效果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的愈伤组织诱导培养基和愈伤组织诱导分化培养基中所用的MS为Murashige&Skoog基础盐，购自海南微氪生物科技有限公司，产品目录号为MSP01-50LT，具体配方如下：NH₄NO₃ 1.65g/L,H₃BO₃ 6.2mg/L,CaCl₂ 332.2mg/L,CoCl₂﹒6H₂O 0.025mg/L,CuSO₄﹒5H₂O 0.025mg/L,EDTA二钠二水合物37.26mg/L,FeSO₄﹒7H₂O 27.8mg/L,MgSO₄180.7mg/L,MnSO₄﹒H₂O 16.9mg/L,Na₂MoO₄﹒2H₂O 0.25mg/L,KI 0.83mg/L,KNO₃ 1.9g/L,KH₂PO₄ 170mg/L,ZnSO₄﹒7H₂O 8.6mg/L。

下述实施例中的壮苗生根培养基中所用的MS _vit为含有维他命的Murashige&Skoog基础盐，购自海南微氪生物科技有限公司，产品目录号为MSP09-50LT，具体配方如下：NH₄NO₃ 1.65g/L,H₃BO₃ 6.2mg/L,CaCl₂ 332.2mg/L,CoCl₂﹒6H₂O 0.025mg/L,CuSO₄﹒5H₂O 0.025mg/L,EDTA二钠二水合物37.26mg/L,FeSO₄﹒7H₂O 27.8mg/L,甘氨酸2mg/L,MgSO₄180.7mg/L,MnSO₄﹒H₂O 16.9mg/L,Na₂MoO₄﹒2H₂O 0.25mg/L,肌醇100mg/L,尼克酸0.5mg/L,KI 0.83mg/L,KNO₃ 1.9g/L,KH₂PO₄ 170mg/L,盐酸吡哆醇0.5mg/L,盐酸硫胺素0.1mg/L,ZnSO₄﹒7H₂O 8.6mg/L。

下述实施例中的IBA(吲哚丁酸)，购置于济南普朗特生物科技有限公司，产品目录号：PLT-02。

下述实施例中的6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)，购置于济南普朗特生物科技有限公司，产品目录号：PLT-02。

下述实施例中的TDZ(噻苯隆)，购置于济南普朗特生物科技有限公司，产品目录号：51707-55-2。

下述实施例中的CCC(矮壮素)，购置于济南普朗特生物科技有限公司，产品目录号：724C032。

下述实施例中的AC(抗坏血酸)，购置于济南普朗特生物科技有限公司，产品目录号：20150501-1。

下述实施例中的NAA(a-萘乙酸)，购置于国药集团化学试剂有限公司，产品目录号：F 20110613。

实施例1、一种南美星油藤育苗的方法

一、外植体采集与表面消毒

剪取生长健壮的当年生未木质化的南美星油藤枝条于封口袋中带回，并将采集的新鲜枝条进行表面消毒。具体步骤如下：

1、将枝条切成约为1.5cm长的茎段，置于200ml烧杯中，先用适量洗洁剂(雕牌洗洁剂，购自家乐福超市；产品目录号GB9985-2000)浸泡30min，期间每3-5min轻轻摇晃烧杯，浸泡后在流水下冲洗30min后置于超净工作台上，得到浸泡后的外植体；

2、用70％乙醇对浸泡后的外植体消毒30s，用无菌水清洗5次；再用2％NaCl消毒8min，无菌水清洗5次，无菌滤纸吸干表面的水珠，得到消毒处理后的外植体，备用。

二、外植体培养诱导愈伤组织

用手术刀将步骤一获得的消毒处理后的外植体的茎段两端切掉，按照培养基中溶质浓度的不同分别接种到如下a)、b)和c)所示的愈伤组织诱导培养基及愈伤组织诱导对照培养基上进行愈伤组织诱导培养：

a)MS+0.1mg/L IBA+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L TDZ+30g/L蔗糖+8g/L琼脂(pH＝5.8)。

b)MS+0.5mg/L IBA+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L TDZ+30g/L蔗糖+8g/L琼脂(pH＝5.8)。

c)MS+1.0mg/L IBA+0.5mg/L 6-BA+1.0mg/L TDZ+30g/L蔗糖+8g/L琼脂(pH＝5.8)。

愈伤组织诱导对照培养基：MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂(pH＝5.8)。

培养条件：温度25±2℃，光照强度40μmol m^-2·s^-1，光照时间12h/d。

外植体培养30天后，除对照培养基外，所有培养基均可通过外植体诱导形成愈伤组织，差别在于愈伤组织的诱导率和疏松程度不同。外植体在各个愈伤组织诱导培养基中诱导培养的结果具体如下：

a)所示的培养基中培养7-10天时形成浅黄绿色愈伤组织，继续培养15-25天，愈伤组织膨大，浅绿色，较疏松，诱导率达100％。

b)所示的培养基中培养7-10天时形成浅黄绿色或浅绿色愈伤组织，继续培养15-20天，愈伤组织膨大，浅绿色，较疏松，健康，诱导率达100％。b)所示的培养基中诱导培养的外植体如图1所示。

c)所示的培养基中培养7-10天时形成浅黄绿色愈伤组织，继续培养15-30天，愈伤组织膨大，疏松，且部分愈伤组织不同程度褐化，诱导率达95％。

由上述培养结果可知，不同愈伤组织诱导培养基对南美星油藤愈伤组织的诱导效果不同，差异较显著。南美星油藤愈伤组织诱导培养基配方优选为b)所示的培养基(MS+0.5mg/L IBA+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L TDZ+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8)，其诱导产生的愈伤组织较疏松、健康，诱导率达100％。

三、愈伤组织诱导芽的分化和伸长

将步骤二中b)所示的培养基诱导培养获得的愈伤组织按照培养基中溶质浓度的不同分别接种到如下d)、e)和f)所示的愈伤组织诱导分化培养基和愈伤组织诱导分化对照培养基上进行愈伤组织分化培养：

d)MS+0.1mg/L IBA+0.1mg/L CCC+0.1mg/L TDZ+30g/L蔗糖+8g/L琼脂(pH＝5.8)。

e)MS+0.5mg/L IBA+0.2mg/L CCC+1.0mg/L TDZ+30g/L蔗糖+8g/L琼脂(pH＝5.8)。

f)MS+1.0mg/L IBA+0.3mg/L CCC+0.5mg/L TDZ+30g/L蔗糖+8g/L琼脂(pH＝5.8)。

愈伤组织诱导分化对照培养基：MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂(pH＝5.8)。

培养条件：温度25±2℃，光照强度40μmol m^-2·s^-1，光照时间12h/d。

外植体培养45天后，外植体在各个愈伤组织诱导分化培养基中诱导培养的结果具体如下：

d)培养15-20天，约98％以上的愈伤组织分化出不定芽，继续培养45天后，诱导分化产生的不定芽长势较好，平均发芽数为12.83个，平均芽长为6.64mm。d)所示的培养基中愈伤组织分化出不定芽如图2和图3所示。

e)培养15-30天，约90％以上的愈伤组织分化形成不定芽，继续培养45天后，平均发芽数为9.33个，平均芽长为12.34mm。

f)培养15-30天，约70％以上的愈伤组织分化形成不定芽，继续培养45天后，小部分愈伤组织褐化，少许芽萎蔫，长势一般，平均发芽数为7.67个，平均芽长为5.74mm。

在愈伤组织诱导分化对照培养基中未发现愈伤组织的产生。

由上述培养结果可知，南美星油藤愈伤组织诱导分化培养基配方优选为d)所示的培养基(MS+0.1mg/L IBA+0.1mg/L CCC+0.1mg/L TDZ+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8)其诱导分化出芽长势较为健康，芽数最多，达12.83个，远高于专利号CN 104798684 A中外植体诱导分化形成的不定芽数。

四、壮苗生根培养

将步骤三中d)所示的培养基诱导分化获得的高度约2.5-4cm的小芽分切下，并按照培养基中溶质及其浓度的不同分别接种到g)、h)和i)所示的壮苗生根培养基上进行壮苗生根培养：

g)MS _vit+0.1mg/L IBA+1g/L AC+40g/L蔗糖+8g/L琼脂。

h)MS _vit+0.5mg/L IBA+0.5mg/L NAA+0.1mg/L 6-BA+1g/L AC+40g/L蔗糖+8g/L琼脂。

i)MS _vit+1.0mg/L IBA+1.0mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+1g/L AC+40g/L蔗糖+8g/L琼脂。

培养条件为：温度25±2℃，光照强度40μmol m^-2·s^-1，光照时间12h/d。

培养60天后，各小芽在各个壮苗生根培养基中培养的结果具体如下：

g)培养15天左右开始生根，生根率为100％，继续培养60天后，平均生根数达10.6条，平均根长为85.6mm，长势较好。g)所示的培养基中不定芽的幼苗如图4所示。

h)培养30天左右开始长根，继续培养60天后，生根数量较少，但根较为粗壮。

i)培养60天后有少许长根，生根效果较差，芽叶片逐渐黄化。

由上述培养结果可知，南美星油藤壮苗生根培养基配方优选为g)所示的培养基(MS _vit+0.1mg/L IBA+1g/L AC+40g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8)，其诱导产生的平均生根数较多，平均根长较长，植株长势较好。

五、炼苗移栽

将步骤四中g)所示的培养基培养获得的高约4-6cm、生长健壮、根系粗壮、叶色浓绿的生根试管苗置于大棚中，温度保持在25℃左右，打开瓶盖在自然光照下炼苗15天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基并用多菌灵溶液中浸泡10s，将其移栽到消毒的栽培基质(栽培基质的配比为泥炭土：椰糠：珍珠岩＝3:2:1)中培养得到再生植株，定期浇水，保持透光度为70-80％，相对湿度80％以上。再生植株成活率达85％以上，再生植株如图5所示。