本发明涉及农业生态学技术领域，具体涉及一种基于阿魏酸含量评定水稻化感作用诱导效率的方法。
背景技术：
植物化感作用（Allelopathy）是指一个活体植物（供体）通过向环境中释放次生代谢物质，从而影响周围植物（受体）生长和发育的化学生态学现象。这些次生代谢物质被称为化感物质（Allelochemical）。1985年美国遗传育种学家Dilday等在研究水稻对除草剂甲草胺的抗性评价中，首次在田间试验中发现了对水生杂草ducksalad具有明显抑草作用的水稻品种，这些品种被称为化感水稻品种。此研究结果引起了世界各国政府和研究机构的高度重视，人们寄希望于利用水稻自身的化感抑草作用来控制农田杂草，减少对化学除草剂的依赖。稗草是大田水稻最常见的伴生杂草，本实验室前期研究已经表明稗草种植液可以诱导提高水稻的化感作用。通过植物的诱导作用来提高水稻化感作用，从而减少除草剂的使用，保护农田生态环境，具有更加重要的科学意义和应用潜力。
目前，尚无评价水稻化感作用诱导效率的方法，但我们可以借鉴水稻化感品种的筛选方法。筛选方法主要在实验室、温室和田间进行。室内筛选在水稻化感潜力筛选初期是一种实用和必须的方法，其中生测是最简单、方便和有效的筛选方法，其通过测定水稻对受体植株根长或者株高的抑制率来评价其化感潜力。通常，生测的指示受体有莴苣（Lactuca sativa L.），萝卜（Raphanus sativus）和水芹（Lepidium sativum L.）等。研究者可以在有限的空间和时间内对不同的水稻品种完成筛选工作。其它一些室内筛选方法，如HPLC、GC-MS通过对化感水稻的酚酸类或者萜类化感物质的含量进行测定来评价水稻的化感潜力，通常需要对多种物质的含量进行分析，测定所需的经费比较昂贵。其他的温室或者田间筛选方法都是以间种的稗草、散播的稗草或者指定区域自然生长的杂草等作为指示受体进行筛选化感潜力水稻品种，但由于无法降低在大田环境下植株之间的竞争作用，而且耗时较长，因此其通常作为水稻化感潜力筛选晚期的验证方法。
当前评价水稻化感潜力的最普遍方法是室内生测法，但是由于研究者所采用的不同生物测试方法在供体植物与受体植物的植株数量、共培时间、培养载体、培养条件等方面存在明显的差异,导致同一个作物品种在不同的测试方法中的化感作用潜力表现不尽相同,给准确评价一个特定品种的化感作用潜力带来困难。如果用这种方法来评价水稻化感作用诱导效率的话，需要对诱导后的水稻叶片浸提液或者水稻种植液对受体生长的抑制情况进行分析，所需的样品用量很大，同时其实验时间一般在3-7天，需要耗费大量的时间和精力，而且结果重复性较差。因此，需要寻找一种能够快速、简便、准确的评价水稻化感作用诱导效率的方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种基于阿魏酸含量评定水稻化感作用诱导效率的方法，其通过建立化感水稻叶片浸提液对莴苣根长抑制率与叶片浸提液中阿魏酸的含量的关系式，实现了通过对叶片浸提液中阿魏酸含量的测定而达到快速评价水稻化感作用诱导效率的目的，可有效解决目前采用生测法评定水稻化感作用诱导效率费时费力且结果重复性较差的问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于阿魏酸含量评定水稻化感作用诱导效率的方法，其步骤如下：
1）稗草种植液的收集：挑选颗粒饱满的稗草种子，用0.5wt%的次氯酸钠溶液消毒处理10min后，用蒸馏水冲洗干净，再将种子平铺到沙盘中，加水并加盖保鲜膜后于30 ℃进行催芽，待稗草长至一叶期时，挑取120株长势均一的稗草，将其转移到装有10 L霍格兰全营养液的塑料盆中，于25℃-35℃室外自然种植，每周补足水分和营养；种植25d至稗草长到5叶后，收集盆中的营养液，用2层滤纸过滤，再经0.45 μm滤膜过滤，40℃旋转蒸发浓缩至120 mL，即得稗草种植液，-20 ℃储藏备用；
2）水稻幼苗：将化感水稻PI312777的种子用自来水浸泡，去除漂浮、不饱满的种子，然后用蒸馏水冲洗3遍后，用0.5wt%的次氯酸钠溶液消毒处理10min，并用蒸馏水冲洗5遍后，用蒸馏水浸泡24h，每12h换一次水，再用蒸馏水冲洗3遍后，将种子平铺到烧杯壁上，盖好保鲜膜，上面扎孔，30℃黑暗放置24h；待种子冒芽后，把种子冲洗3遍后放到纱网上，将纱网固定到小塑料盆上，加蒸馏水至将种子浸没，30℃下培养至水稻长至一叶一芯；
3）稗草种植液诱导：将水稻幼苗转移到5组装有5L霍格兰全营养液的塑料盆上分别进行培养，每盆种50株水稻，间距4cm×5cm；待水稻长至3叶期时，倒去营养液，分别加入5L含稗草种植液浓度依次为0、0.5、1.0、1.5、2.0 vol%的霍格兰全营养液，诱导培养2d后收集各组水稻叶片；
4）叶片浸提液的制备：将所得水稻叶片剪成1cm的小段，按1g叶片加10mL蒸馏水，20℃浸提24h，经0.45μm滤膜过滤，得叶片浸提液；
5）阿魏酸含量的检测：取叶片浸提液20mL，用磷酸调节pH到4.00，然后加入1.6g NaCl，溶解后得叶片提取液；将叶片提取液加入到预处理好的Cleanert PEP固相萃取小柱中，当溶液流完后加入2mL蒸馏水冲洗，然后加入6mL甲醇洗脱，并收集洗脱液，所得洗脱液冷冻干燥后，采用HPLC法测定其中阿魏酸含量；
测定条件为：色谱柱为C18柱，规格为4.6 mm×250 mm，ID 5μm；流动相：甲醇与体积浓度为0.1 %的磷酸溶液的混合溶液；洗脱条件：0-10min，甲醇27%；10-20min，甲醇50%；20-25min，甲醇73%；检测波长为280 nm；流速为1.3 mL/min；进样量10μL；柱温为30℃；
6）叶片浸提液对莴苣根长抑制率的测定：另取4mL叶片浸提液和1mL蒸馏水混合后加入到垫有滤纸的组培瓶中，并将5颗刚冒白的莴苣种子播在滤纸上，盖好盖子，于25℃培养箱中培养3d后测定莴苣的根长，并计算根长抑制率；
7）回归方程的制备：根据所测定阿魏酸含量与根长抑制率的关系建立回归方程，其所得回归方程为：Y=90.6979X-55.2929，其中Y为根长抑制率，X为阿魏酸含量；
8）水稻化感作用诱导效率的评定：按步骤4）、5）制备经稗草种植液诱导后的待测水稻样品的叶片浸提液，并测定其中阿魏酸含量，然后根据所得回归方程判定该水稻化感作用诱导效率。
PEP固相萃取小柱的预处理方法为：依次用8mL蒸馏水、8mL甲醇、6mL蒸馏水浸润，淋洗，活化后去除残余甲醇。
本发明的显著优点在于：本发明建立了一种基于阿魏酸含量评定水稻化感作用诱导效率的方法，其先利用一系列浓度稗草种植液诱导化感水稻化感作用后，通过分别测定所得水稻叶片浸提液对莴苣根长的抑制率与其中阿魏酸含量，获得两者关系的回归方程式，再利用该回归方程式判定水稻化感作用诱导效率，以实现通过对叶片浸提液中阿魏酸含量的测定而达到快速评价水稻化感作用诱导效率的目的，其可有效解决目前采用生测法评定水稻化感作用诱导效率费时费力的问题，具有良好推广前景。
附图说明
图1为不同剂量稗草种植液诱导后所得水稻叶片浸提液对莴苣根长生长抑制情况的变化图。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
所用稗草（Echinochloa crusgalli (L.) Beauv）种子收集于福建农林大学田间实验田并保存一年。
所用化感水稻PI312777引自美国，在福建省武夷山扩繁。
所用原儿茶酸、丁香酸、阿魏酸、肉桂酸、香草酸、对香豆酸、水杨酸、对羟基苯甲酸标准品均自购于阿拉丁公司。
所用Cleanert PEP固相萃取小柱的规格为：平均粒径40-60μm、，平均孔径70 Å，比表面积600m2/g。
1 材料与方法
1.1 稗草种植液的收集
挑选颗粒饱满的稗草种子，用0.5wt%的次氯酸钠溶液消毒处理10min后，用蒸馏水冲洗干净，再将种子平铺到沙盘中（沙子预先于65℃消毒30min，冷却后反复3次），加适量蒸馏水后盖上保鲜膜，并用镊子在保鲜膜上戳一些小孔，放入恒温培养箱中于30℃进行催芽，待稗草长至一叶期时，挑取长势均一的稗草（高4cm左右），将其转移到装有10L霍格兰全营养液的塑料盆中（塑料盆规格：长45cm×宽35cm×高15cm），每盆120株，将盆放于25℃-35℃室外自然种植，每周补足水分和营养（直接补水至10L，营养按7天完全消耗计算，补回原来营养物质浓度）；种植25d至稗草长到5叶后，分别收集各盆中营养液，将其用2层滤纸过滤后，再经0.45μm滤膜过滤，40℃旋转蒸发浓缩至120mL（每1mL即等于一株稗草的分泌液），得稗草种植液，-20℃储藏备用。
1.2 水稻种植与稗草诱导液诱导
将化感水稻PI312777种子先用自来水浸泡，去除漂浮、不饱满的水稻种子，用蒸馏水冲洗3遍后用0.5wt%的次氯酸钠溶液消毒处理10min，然后用蒸馏水冲洗5遍后，再用蒸馏水浸泡24h，每12h换一次水，然后用蒸馏水冲洗3遍后，将种子平铺到烧杯壁上，盖好保鲜膜，上面扎孔，30℃黑暗放置24h；待种子冒芽后，把种子冲洗3遍后放到纱网（2mm）上，将纱网固定到小塑料盆（长28cm×宽19cm×高8cm）上，加蒸馏水至将种子浸没，30℃下培养至水稻长至一叶一芯后，转移到装5L霍格兰全营养液的另一塑料盆（长45cm×宽35cm×高15cm）上，每盆种50株水稻，间距4cm×5cm，待水稻长至3叶期时，倒去种植液，分别加入按表1配方配制的5组诱导液进行诱导实验，每个处理重复3次；诱导处理2d后，分别收集各组水稻叶片和水稻种植液，将水稻叶片剪成1cm的小段，按1g叶片加10mL蒸馏水，20℃浸提24h，浸提液经0.45μm滤膜过滤，得水稻叶片提取液；水稻种植液过滤后于40℃减压蒸馏浓缩，过0.45μm滤膜过滤后定容至250mL，得水稻种植液。
表1 稗草种植液诱导化感水稻PI312777实验配方表
1.3 水稻叶片浸提液的生物测试
取4mL水稻叶片浸提液和1mL蒸馏水混合后加到垫有滤纸的组培瓶中，然后将5颗刚冒白的莴苣种子播在滤纸上，盖好盖子，对照组采用5mL蒸馏水。实验重复4次，组培瓶放在25℃培养箱（12h光照，12小时黑暗）中培养3天，然后测量莴苣的根长。
1.4 水稻叶片提取液中酚酸类物质含量的测定
取Cleanert PEP固相萃取小柱，分别经蒸馏水-甲醇-蒸馏水（8 mL-8 mL-6 mL）浸润和淋洗活化后，去除残余甲醇备用；
取水稻叶片提取液20mL，用磷酸调节pH到4.00，后加入1.6g NaCl，溶解后将所得溶液加到已经活化的固相萃取小柱中，当溶液都流完后，加入2mL的蒸馏水冲洗，再加入6mL的甲醇洗脱，并收集洗脱液冷冻干燥，4℃保存备用；
采用HPLC法测定其中原儿茶酸、丁香酸、阿魏酸、肉桂酸、香草酸、对香豆酸、水杨酸、对羟基苯甲酸的含量，测定条件为：HPLC为Waters e2695，色谱柱为SunFireTW-C18（4.6 mm×250 mm，ID 5μm）；流动相：A-甲醇（色谱纯）和B-0.1 %磷酸溶液（分析纯）；洗脱条件：0-10min，A:B=27:73，10-20min A:B=50:50，20-25min A:B=73:37，检测波长为280 nm；流速为1.3 mL/min；进样量10μL；柱温为30℃。
1.5 数据分析
采用SigmaPlot 11.0软件绘制，抑制率计算按公式：IR=（1-TR/CK）×100 %计算，其中，IR：抑制率，TR：处理组生长指标，CK：对照组生长指标。数据采用DPS2000软件进行统计分析、相关性分析和回归分析，采用LSD法进行显著性差异分析。
2 结果与分析
2.1 水稻叶片浸提液的生测效果
图1为不同剂量稗草种植液诱导后所得水稻叶片浸提液对莴苣根长生长抑制情况的变化图（其中，abc表示5%显著水平）。由图1可见，化感水稻叶片浸提液对莴苣根长的抑制率在诱导剂量为25-50mL时与无诱导时无显著差异，当稗草诱导液剂量达到75mL时，抑制率显著提高，达到75.11%，但与100mL剂量间无显著差异，由此表明在稗草种植液的诱导下可以提高化感水稻PI312777对莴苣根长的抑制作用。
2.2 水稻叶片浸提液中酚酸类物质含量测定
表2 不同剂量稗草种植液诱导后水稻叶片浸提液中阿魏酸含量的测定结果
由表2可见，不同剂量稗草种植液诱导化感水稻PI312777后，水稻叶片中的酚酸类物质含量随着诱导剂量的增大而增加。当诱导剂量提高到75mL时，水稻叶片合成酚酸类物质的总量显著提高。但在单一酚酸的量的变化上看，不是所有酚酸的含量都是随着诱导剂量的增加而增大，而是呈现出不规律的变化。仅阿魏酸的含量随诱导剂量显著增长，在诱导剂量为25mL时，水稻叶片中阿魏酸含量是未诱导时的2.21倍，随着诱导剂量的增加，阿魏酸的含量也随之增加，而当在诱导剂量为75mL时，水稻叶片中的阿魏酸含量是未加入诱导剂时的5.14倍。
2.3 水稻叶片浸提液对莴苣根长抑制率和阿魏酸含量的相关性
表3 水稻叶片浸提液对莴苣根长抑制率和阿魏酸含量回归方程方差分析
由表3可见，水稻叶片浸提液对莴苣根长的抑制率和叶片中阿魏酸含量相关系数达r=0.976，根据相关性的关系0.8≤r＜1称为高度相关，说明两者为高度相关，而且p=0.0043<0.01，差异达到极显著水平。回归方程的斜率为90.70>0，证明稗草种植液诱导后化感水稻PI312777化感作用诱导效率的增强与叶片中阿魏酸的含量高度相关。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。