银耳菌种提取方法与流程

本发明涉及银耳培育领域，特别地，涉及一种银耳菌种提取方法。
背景技术：
：银耳含丰富的胶质、多种维生素和多种氨基酸及肝糖，具有极高的食用价值。栽培银耳要获得高产、优质的菌种是关键。传统的制种分离一直没能很好的解决菌种稳定性的问题，每次出现母本菌种异常，通常都会导致整批生产不良甚至绝收，给农户或者企业造成重大损失。并且银耳菌种基质分离过于繁锁，不易获取，并且质量不稳定。如银耳菌种制作普遍使用基质分离法提取纯银耳菌种，此方法每次分离都要30～45天风干。因为风干时间不足分离出菌种带有香灰菌丝，风干时间过长又影响银耳菌种的活性，减少银耳木屑种转接代数，因此每次转接试管的数量都要很多。技术实现要素：本发明提供了一种银耳菌种提取方法，以解决现有的菌种操作复杂、质量不稳定的技术问题。本发明采用的技术方案如下：一种银耳菌种提取方法，包括以下步骤：选取耳片消毒、漂洗、擦干后，置于55～65％的湿度条件下4～5小时风干，对耳片上的香灰菌丝灭活。在风干的耳片生长点切取薄耳片，并接种到培养基中，培养至接种点出现2～4毫米的浓白菌丝。将浓白菌丝转管培养，至形成白毛团，得到银耳菌种。进一步地，耳片风干的条件为：将耳片置于超净工作台，在柔风条件下放置4～5小时。进一步地，培养基包括土豆、葡萄糖、琼脂和水，培养基由土豆200g、葡萄糖20g、琼脂24～26g加入木屑培养基香灰菌丝煮水提取液定容1000ml，杀菌、冷却得到。进一步地，培养基由土豆200g、葡萄糖20g、琼脂25g加入木屑培养基香灰菌丝煮水提取液定容1000ml，杀菌、冷却得到。进一步地，薄耳片的大小为0.2mm×0.05mm，薄耳片的厚度为0.1～1毫米。进一步地，薄耳片接种到试管内的培养基中，每根试管接种2～4块。进一步地，薄耳片在22～25℃下培育15～17天，得到浓白菌丝。进一步地，将浓白菌丝分成2mm×3mm大小进行转管，培养7～12天得到白毛团。进一步地，耳片通过73～78％酒精消毒，并用73～78％酒精漂洗4～6S，再用无菌水漂洗两次，每次4～6S。本发明具有以下有益效果：上述银耳菌种提取方法，通过控制湿度对耳片的香灰菌丝灭活，同时以组织分离法进行银耳菌种提取，仅需进行一次转管，提纯时间短，操作简便；同时菌种性状遗传亲本，质量稳定。除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。附图说明构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：图1是本发明优选实施例的薄耳片接种到培养基第5天的图；图2是本发明优选实施例的薄耳片接种到培养基第10天的图图3是本发明优选实施例的薄耳片接种到培养基第15天的图；图4是本发明优选实施例的浓白菌丝转管后培养第6天的图。具体实施方式以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。本发明的优选实施例提供了一种银耳菌种提取方法，包括以下步骤：选取耳片消毒、漂洗、擦干后，置于55～65％的湿度条件下4～5小时风干，对耳片上的香灰菌丝灭活。在风干的耳片生长点切取薄耳片，并接种到培养基中，培养至接种点出现2～4毫米的浓白菌丝。将浓白菌丝转管培养，至形成白毛团，得到银耳菌种。挑选朵形圆正，叶片展开均匀，白色，生长快，直径3～5cm银耳做为分离种源，从中挑选3～5片生命力强的耳片进行银耳菌种提取。可对耳片进行常规消毒和漂洗，并擦干。擦干可采用无菌纱布。香灰菌丝为银耳的伴生菌丝，为获得纯的银耳菌种，需对其进行灭活。香灰菌丝需在较高的湿度条件下生存，当在55～65％的湿度条件下放置4～5小时风干后，香灰菌丝会干死，而银耳菌种并不会受影响。耳片外表已风干，取下耳片在生长点切小块，尽可能地切薄点。利用薄的耳片全面吸附在培养基上，吸收培育基营养，刺激菌丝萌发。用无菌接种钩把薄耳片快速放入试管中，把切口面紧贴在培养基表面。其中培养基可为培养银耳菌种常用的培养基，如PAD培养基。参照图1，图1为薄耳片接种至培养基第5天的实物图。试管菌种通常培育15～17天，接种点中间为胶状体，四周长有浓白菌丝2～4mm时转管。该方法提取试管包括长出银耳菌丝与不长银耳菌丝两种情况。参照图2和图3。图2和图3清楚表示了薄耳片萌发银耳菌丝的过程。培养第15天时，大部分薄耳片萌发银耳菌丝，小部分薄耳片仅自身生长，长大长厚，而并未萌发银耳菌丝。统计长有银耳菌丝试验管90.25％以上，因此只需从生长浓白菌丝的试管中提取菌丝转管即可。而传统基质块提纯方法菌种生长情况复杂有些试管只长香灰菌丝，有些试管长香灰菌丝与银耳菌丝，有此试管只长银耳菌丝，有些试管长有杂菌，有些试管不生长任何菌丝。因此需要在大量试管中挑选出浓白纯银耳菌丝，并且纯度不容易保证。可从生长浓白菌丝的试管中挑选银耳菌丝生长浓密，粗壮，生长快的进行转管，切取胶质块周围菌丝体2mm×3mm左右转接到培养容器，如试管或三角瓶内，菌丝第二天长出小毛团，参照图4，转管第6天，银耳菌丝继续生长。转管7～12天后可使用，此时得到白毛团(纯银耳菌种)圆正，饱满，浓密，洁白。本发明具有以下有益效果：上述银耳菌种提取方法，通过控制湿度对耳片的香灰菌丝灭活，同时以组织分离法进行银耳菌种提取，仅需进行一次转管，提纯时间短，操作简便；同时菌种性状遗传亲本，质量稳定。可选地，耳片风干的条件为：将耳片置于超净工作台，在柔风条件下放置4～5小时。超净工作台中不易感染杂菌，在柔风的条件下，耳片风干速度合适，且可有效的对香灰菌丝灭活。可选地，培养基中包括土豆、葡萄糖、琼脂和水，培养基由土豆200g、葡萄糖20g、琼脂24～26g加入木屑培养基香灰菌丝煮水提取液定容1000ml，杀菌、冷却得到。培养基为PAD培养基，其组分和配制方法与一般的PAD培养基基本相同。区别在于，本发明中采用的水为木屑培养基香灰菌丝的煮水提取液。即在培养银耳的木屑培养基上培养香灰菌丝至布满整个培养基，将香灰菌丝连同木屑培养基共同煮水，作为配制PAD培养基定容用水。在上述量的PAD培养基中，木屑培养基香灰菌丝用量为2瓶，瓶子大小为750ml，即每瓶木屑培养基(质量百分数计，木屑68％，麦皮30％，糖1％，石膏1％，)香灰菌丝的质量为320g左右，将其加入2000ML水煮30分钟得到提取液。定容后可在121℃灭菌30分钟，摆斜面，冷却后3天使用。银耳菌丝必须混合银耳菌丝才能萌发，申请人发现木屑培养基香灰菌丝煮水得到提取液可为银耳菌丝提供生长的营养成分。因此操作更为方便。可选地，培养基由土豆200g、葡萄糖20g、琼脂25g加入木屑培养基香灰菌丝煮水提取液定容1000ml，杀菌、冷却得到。可选地，薄耳片的大小为0.2mm×0.05mm，薄耳片的厚度为0.1～1毫米。该大小和厚度的薄耳片可最大限度吸收培育基营养，刺激菌丝萌发。可选地，薄耳片接种到试管内的培养基中，每根试管几种2～4块。该条件下，薄耳片的分布密度合适，生长速度较快。可选地，薄耳片在22～25℃下培育15～17天，得到浓白菌丝。在该条件下，菌丝萌发和生长速度快，节省了制种时间。可选地，将浓白菌丝分成2mm×3mm大小进行转管，培养7～12天得到白毛团。在该条件下，浓白菌丝生长速度快，节省了制种时间。可选地，耳片通过73～78％酒精消毒，并用73～78％酒精漂洗4～6S，再用无菌水漂洗两次，每次4～6S。采用73～78％酒精消毒可杀死其他杂菌，保证银耳菌种的纯度。优选为75％的酒精。用73～78％酒精漂洗4～6S，再用无菌水漂洗两次，每次4～6S，清除多余的酒精。实施例11、制作生物PDA培养基PDA为土豆200g，葡萄糖20g，琼脂25g，另加木屑培养基香灰菌丝2瓶煮水提取液定容1000ml，121℃灭菌30分钟，摆斜面，冷却后3天使用。2、银耳种源处理A挑选朵形圆正，叶片展开均匀，白色，生长快，直径3～5cm银耳做为分离种源。B挑选3片生命力强的耳片，经过73％酒精消毒放入超净工作台。C用75％酒精漂洗4S，再用无菌水漂洗两次，每次4S。D取出用无菌纱布吸干耳片表面水份。E用挂钩把耳片悬挂在超净工作台内，开启柔风4H后，把耳片表面香灰菌丝干死。3、接种A耳片外表已风干，取下耳片在生长点切成0.2mmX0.05mm大小，厚度为1毫米。B用无菌接种钩把薄耳片快速放入试管中，把切口面紧贴在培养基表面。每根试管接3块。4、培育试管菌种放在22℃下培育17天，接种点中间为胶状体，四周长有浓白菌丝2～4mm时转管。5、转管挑选浓白菌丝生长浓密，粗壮，生长快进行转管，切取胶质块周围菌丝体2mmX3mm大小转接到试管或三角瓶内，菌丝第二天长出小毛团，7天得到白毛团，即纯银耳菌种。实施例2实施例2和实施例1的区别在于薄耳片的厚度为0.8毫米。培育步骤中的温度为24℃，培育时间为16天。转管步骤中的培育时间为9天。实施例3实施例2和实施例1的区别在于薄耳片的厚度为0.5毫米。培育步骤中的温度为25℃，培育时间为15天。转管步骤中的培育时间为7天。对比例1PDA为土豆200g，葡萄糖20g，琼脂18g，所用水为普通无菌水。121℃灭菌30分钟，摆斜面，冷却后3天使用。挑选朵形圆正，叶片展开均匀，白色，生长快的银耳，去掉银耳子实体，用接种铲铲出银耳基质块，用解剖刀将基质块切去周围松软的香灰菌丝，露出白色硬化的银耳菌丝团块，将基质块切成2-3厘米的正方体型，放在室温下的小风机风口处吹干35-45天。将干燥的基质块放入75％酒精中浸泡30秒，并用无菌纱布吸去表层多余酒精，在超净工作台中用无菌解剖刀将基质块切开，再用接种针挑取中间部位的0.1-0.2立方毫米基质块接种到PDA培养基上面。然后在室温22-25摄氏度条件下培养5-6天，即可有洁白的银耳菌丝萌发。当银耳纯菌丝萌发后在试管中PDA培养基上生长开时。观察时光中菌体生长情况。有些试管只长香灰菌丝，有些试管长香灰菌丝与银耳菌丝，有此试管只长银耳菌丝，有些试管长有杂菌，有些试管不生长任何菌丝。从只长银耳菌丝的试管中取菌丝尖端重新接种到新的试管中的培养基上面，如此反复操作2次或以上，完成对新分离的银耳菌丝纯化。对比例2PDA为土豆200g，葡萄糖20g，琼脂18g，，所用水为普通无菌水。每三角瓶装15ml，121℃灭菌30分钟。烧杯4只，以及不锈钢钩、接种针、剪刀、镊子、无菌水、无菌纱布、酒精灯、0.l％的升汞溶液，连同装有马铃薯琼脂培养基的三角瓶、种耳等放入超净工作台消毒30分钟。先将3只烧杯用酒精消毒后，各倒入无菌水若干，另只烧杯倒入0.1％的升汞溶液，用剪刀剪数片肉厚、片大的耳瓣，在升汞溶液中浸5-10秒钟，迅速依次放人3只无菌水烧杯中，各浸洗1分钟，再用无菌纱布将水吸干，用钢钩迅速挂于三角瓶内，塞上棉塞。为防杂菌感染，耳片距培养基约3厘米左右。置于恒温箱，温度保持在23-25℃，培养24小时，可在培养基表层看到雾状的孢子卵。这时可在超净工作台，取出钢钩及耳片，塞好棉塞，继续培养2-3天后，培养基表面可看到白色糊状，边缘光滑，中间凸起的菌落，这就是银耳孢子。若无杂菌可采取多次划线法或稀释法，获得纯芽孢后再进行转管扩大。实施例1～3、对比例1、对比例2的区别如下表所示。项目本发明提纯基质块提纯孢子提纯提纯转管次数(次)1≥1≥3提取操作难度简易一般高稳定情况遗传亲本遗传不稳定易变异提取纯度高一般海选提纯时间(天)22-2945-60≥35应用马上使用马上使用通过试产稳定带有杂菌机率很小一般高本发明的银耳菌种提取方法，操作方便，遗传形状稳定，银耳菌种纯度高，提纯时间短，并且杂菌机率机率很小。通过控制湿度对耳片的香灰菌丝灭活，同时以组织分离法进行银耳菌种提取，仅需进行一次转管，提纯时间短，操作简便；同时菌种性状遗传亲本，质量稳定。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3