一种香鳞毛蕨的工厂化育苗与人工栽培方法与流程

本发明涉及一种香鳞毛蕨的工厂化育苗与人工栽培方法，属于香鳞毛蕨栽培技术领域。

背景技术：

香鳞毛蕨(dryopterisfragrans(l.)schott)是一种野生多年生蕨类植物，系鳞毛蕨科鳞毛蕨属，新鲜叶片揉碎具有香味，也称香叶鳞毛蕨。与绝大部分喜湿与高温环境下生长的蕨类植物截然不同，香鳞毛蕨的生长环境极其特殊，生于火山喷发后形成的滑石坡、熔岩缝隙和火山岩浆缝中。在世界范围内，香鳞毛蕨分布于中国、日本、朝鲜、蒙古、俄罗斯和北美，海拔约为1000～1700m的高寒地带。在中国，香鳞毛蕨主要分布于黑龙江省的五大连池地区。

香鳞毛蕨可耐低温，在-20℃条件下仍能存活，但是香鳞毛蕨生长缓慢，通常具有较长的生长期，需要经过多年培养才能形成成熟孢子体。近年来，香鳞毛蕨对牛皮癣、青少年痤疮、银屑病等皮肤病的治疗有很好的疗效而受到广泛的关注，具有良好的发展前景。但是由于生态环境遭到破坏和人类对其药用价值的发掘，野生香鳞毛蕨资源受到严重的影响。通过普通的组织培养和土壤培养诱导孢子体的过程周期较长，且野生的香鳞毛蕨在诱导过程中容易死亡，因此，如何利用人工栽培技术高产栽培香鳞毛蕨成为现有技术中的技术难题，现有技术中也未有相关报道。

技术实现要素：

为了实现香鳞毛蕨的人工土壤栽培，获得大量的成熟香鳞毛蕨孢子体植株,本发明提供了一种香鳞毛蕨的工厂化育苗与人工栽培方法，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种香鳞毛蕨的工厂化育苗与人工栽培方法，该方法为组培方法，包括以下步骤：

步骤一：将香鳞毛蕨的成熟孢子制备成无菌孢子悬浮液，将无菌孢子悬浮液接种于培养基中先黑暗处理同步萌发后进行培养，待长至配子体阶段将其接种于固体培养基中继续进行培养，获得生长状况良好的香鳞毛蕨配子体；

步骤二：将步骤一获得的香鳞毛蕨配子体移出洗净后移入到栽培有水蕨配子体的土壤基质中进行培养，获得成熟的香鳞毛蕨孢子体。

本发明步骤一所述液体培养基为改良的knop′s液体培养基，该培养基中含有0.25gnah2po4，0.25gkno3，0.25gmgso4，1.0gca(no3)2和蒸馏水1000ml，ph为5.7-5.8。

本发明步骤一所述固体培养基为1/2ms+蔗糖+琼脂固体培养基，该培养基中含有1/2ms、3.0％蔗糖(质量)、0.7％～0.8％琼脂(质量)，ph为5.7-5.8。

本发明步骤一和步骤二所述的培养的条件为22℃±5℃，光照12h-16h，黑暗8h-12h，光强150μmol·m-2·s-1-180μmol·m-2·s-1。

作为本发明进一步优选方案，步骤一和步骤二所述的培养的条件为25℃，光照16h，黑暗8h，光强150μmol·m-2·s-1-180μmol·m-2·s-1。

本发明步骤二所述土壤基质是由草炭土和蛭石按照体积比为3：1配置而成的。

本发明步骤二所述水蕨配子体的数目为1株～5株。优选方案为1株～3株。

优选地，步骤二所述洗净使用22℃±5℃的清水洗净。

本发明的另一目的是提供另外一种香鳞毛蕨的工厂化育苗与人工栽培方法，该方法为土培方法，包括以下步骤：

步骤一：将香鳞毛蕨的成熟孢子制备成无菌孢子悬浮液，将无菌孢子悬浮液接种于盛装有土壤基质的容器中，向土壤基质中浇水后用塑料薄膜覆盖整个容器保湿，于22℃±5℃进行培养，获得生长状况良好的香鳞毛蕨配子体；

步骤二：将步骤一获得的香鳞毛蕨配子体移入到栽培有水蕨配子体的土壤基质中进行培养，获得成熟的香鳞毛蕨孢子体。

作为本发明优选方案步骤一所述土壤基质和步骤二所述的土壤基质均是由草炭土和蛭石按照体积比3：1配置而成的。

本发明步骤二所述水蕨配子体的数目为1株～5株。优选方案为1株～3株。

本发明步骤一和步骤二所述的培养的条件为22℃±5℃，光照12h-16h，黑暗8h-12h，光强150μmol·m-2·s-1-180μmol·m-2·s-1。

作为本发明进一步优选方案，步骤一和步骤二所述的培养的条件为25℃，光照16h，黑暗8h，光强150μmol·m-2·s-1-180μmol·m-2·s-1。

本发明利用生态学原理，通过主栽植物与一年生水生粗梗水蕨(ceratopteristhalictroides)共同播种联生，水蕨根系与香鳞毛蕨根系共同生长。水蕨根系固定土壤中的水分，使得土壤保持潮湿，水分得到充分地吸收利用。另外，土壤水分也有利于精子和卵细胞的结合形成孢子体，能够提高香鳞毛蕨孢子体的成活率。地上部分增加塑料薄膜覆盖，将土壤中的无效蒸腾转变为植物的有效利用，提高香鳞毛蕨的生长速率，形成一种快速获得大量成熟香鳞毛蕨孢子体的植株生长模式，以达到实现香鳞毛蕨工厂化育苗的目的。

本发明有益效果：

1、本发明通过对香鳞毛蕨孢子体的诱导和培养模式进行研究，首次建立了香鳞毛蕨的高产人工栽培方法，本发明在保持正常土壤条件的情况下，植入能够充分固定并利用水分的一年生水生粗梗水蕨，通过将香鳞毛蕨与一年生水生粗梗水蕨(ceratopteristhalictroides)共同播种联生，使水蕨根系与香鳞毛蕨根系共同生长。其中水蕨能够增加通气量，充分固定水分，使得土壤保持潮湿，水分得到充分的吸收利用，减少土壤无效蒸腾的作用，能够加速香鳞毛蕨孢子体的形成，并提高了香鳞毛蕨孢子体的诱导率，同时，地上部分增加塑料薄膜覆盖，将土壤中的无效蒸腾转变为植物的有效利用，进一步提高香鳞毛蕨的生长速率，最终形成一种快速获得大量成熟香鳞毛蕨孢子体的植株生长模式，以达到实现香鳞毛蕨孢子体工厂化生产的目的，为实现香鳞毛蕨孢子体的大规模生产提供了有力的技术支持，同时为香鳞毛蕨植物资源的可持续利用奠定了基础。

2、本发明方法克服了通过组织培养和土壤培养诱导孢子体的过程周期较长，且野生的香鳞毛蕨在诱导过程中容易死亡的问题，本发明的方法大大缩短了香鳞毛蕨的生长周期，而利用本发明的方法培养香鳞毛蕨成熟的孢子形成孢子体，培养周期仅需90天。通常在自然条件下形成香鳞毛蕨成熟孢子到形成孢子体非常困难，孢子萌发率约为0％～7％，本发明的方法还大大提高了香鳞毛蕨孢子体的诱导率，组培法香鳞毛蕨孢子体诱导率高达66.67％，土培法香鳞毛蕨孢子体诱导率高达86.67％。

3、本发明将香鳞毛蕨和水蕨科植物间作，二者产生了伴生作用，本发明首次提供了一条生物措施促进香鳞毛蕨孢子体的成熟，并为实现香鳞毛蕨孢子体的大规模生产提供了有力的技术支持。同时生产成本低、栽培管理难度低和成本，易于实现香鳞毛蕨孢子体的工厂化生产。

附图说明

图1为通过香鳞毛蕨配子体诱导的香鳞毛蕨幼苗。

图2为组培香鳞毛蕨配子体诱导的香鳞毛蕨幼苗。

图3为土培香鳞毛蕨配子体诱导的香鳞毛蕨幼苗。

图4为大量培养香鳞毛蕨孢子体。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例中的材料方法如下：

1试验材料

蕨类植物香鳞毛蕨采自黑龙江省五大连池市火山熔岩的岩缝间。

2培养条件

基本培养基为改良的knop′s配方(nah2po40.25g、kno30.25g、mgso40.25g、ca(no3)21.0g、蒸馏水1000ml)。配子体生长培养基为1/2ms+蔗糖+琼脂的固体培养基，其中包含ms(含有大量元素、微量元素及有机成分)，再添加3.0％的蔗糖和0.7-0.8％的琼脂。

培养基在高压灭菌前用氢氧化钠或盐酸调整ph值为5.7-5.8；

培养温度22℃±5℃(优选为25℃)，光照12h-16h(优选为16h)，黑暗8h-12h(优选为8h)，光强约为150μmol·m-2·s-1-180μmol·m-2·s-1，培养过程中始终保持潮湿。

实施例1：

本实施例提供了一种香鳞毛蕨的工厂化育苗与人工栽培方法(组培法)，具体验方法如下：1、配子体的生长

取成熟的香鳞毛蕨的孢子置于1.5ml离心管内，滴入无菌水，充分振荡使成悬浮液，4000r/min离心1min，使孢子全部沉淀，弃去上清液。离心管内再滴入约1.0ml的0.1％hgcl2溶液，灭菌1min，无菌水冲洗4～5次，用上述离心方法获得无菌的孢子悬浮液。

固体培养基采用1/2ms，蔗糖浓度为3.0％，琼脂浓度为0.7％-0.8％。培养基分装三角瓶中，高压灭菌(121℃、20min)后备用。

液体培养基培养是将改良knop′s液体培养基直接分装在三角瓶中，高压灭菌(121℃、20min)后备用。

土壤基质是已高压灭菌(121℃、20min)的草炭土和蛭石以体积比3：1的比例配制而成，分装在塑料钵中备用。

将获得的无菌孢子悬浮液接种于改良的knop′s培养基中先黑暗处理同步萌发后进行培养，待配子体阶段将其接种于1/2ms+3.0％蔗糖+0.8％琼脂的培养基中进行培养15d。

2、孢子体的诱导

将获得的组培香鳞毛蕨配子体用镊子小心地从瓶中移出,并将附着的培养基用22℃±5℃的清水洗净,移入到盛有土壤基质的塑料钵(编号为a0-a6)中培养60d。土壤基质为草炭土和蛭石以3：1的比例配制而成。实验采用单因素随机区组设计,设6个处理：a0塑料钵中栽有3株组培香鳞毛蕨配子体，无水蕨配子体。a1塑料钵中栽有3株组培香鳞毛蕨配子体和1株水蕨配子体。a2塑料钵中栽有3株组培香鳞毛蕨配子体和2株水蕨配子体。a3塑料钵中栽有3株组培香鳞毛蕨配子体和3株水蕨配子体。a4塑料钵中栽有3株组培香鳞毛蕨配子体和4株水蕨配子体。a5塑料钵中栽有3株组培香鳞毛蕨配子体和5株水蕨配子体。每个处理做3次重复，用蒸馏水浇透基质,塑料薄膜罩住保湿,于22℃±5℃内培养。统计香鳞毛蕨孢子体诱导率，如表1所示。通过香鳞毛蕨配子体诱导的香鳞毛蕨幼苗如图1所示，组培香鳞毛蕨配子体诱导的香鳞毛蕨幼苗如图2所示，大量培养香鳞毛蕨孢子体如图4所示。

表1组培苗长成孢子体的对比

从表1可以看出，本发明方法采用不同数量的水蕨配子体同香鳞毛蕨组培配子体伴生，均长出孢子体。发现1-3株水蕨配子体对香鳞毛蕨孢子体的形成效果显著，诱导率高达66.67％。其中2株水蕨配子体与香鳞毛蕨组培配子体伴生时，孢子体生长数量最多，没有水蕨配子体伴生的孢子体生长数量最少，实验组与对照组结果对比明显，表明水蕨对香鳞毛蕨孢子体的生长起到一定的促进作用。香鳞毛蕨与水蕨共同培养的实验组和对照组相比，诱导时间缩短了30d，诱导数目增加1倍，生长速率提高25.00％。

实施例2

本实施例提供了一种香鳞毛蕨的工厂化育苗与人工栽培方法(土培法)，具体验方法如下：1、配子体的生长

取成熟的香鳞毛蕨的孢子置于1.5ml离心管内，滴入无菌水，充分振荡使成悬浮液，4000r/min离心1min，使孢子全部沉淀，弃去上清液。离心管内再滴入约1.0ml的0.1％hgcl2溶液，灭菌1min，无菌水冲洗4～5次，用上述离心方法获得无菌的孢子悬浮液。

土壤基质是已高压灭菌(121℃、20min)的草炭土和蛭石以体积比3：1的比例配制而成，分装在塑料钵中备用。

将获得的孢子悬浮液接种于盛有土壤基质的塑料钵中进行培养，向土壤基质中浇水至土壤潮湿，塑料薄膜盖住整个容器保湿，于22℃±5℃培养45d。获得成熟的香鳞毛蕨配子体。3、孢子体的诱导

将获得的香鳞毛蕨配子体移入盛有移栽基质的软塑料钵中，采用单因素随机区组设计，同样也设计6个处理：b0塑料钵中栽有3株土培香鳞毛蕨配子体，无水蕨配子体。b1塑料钵中栽有3株土培香鳞毛蕨配子体和1株水蕨配子体。b2塑料钵中栽有3株土培香鳞毛蕨配子体和2株水蕨配子体。b3塑料钵中栽有3株土培香鳞毛蕨配子体和3株水蕨配子体。b4塑料钵中栽有3株土培香鳞毛蕨配子体和4株水蕨配子体。b5塑料钵中栽有3株土培香鳞毛蕨配子体和5株水蕨配子体。每个处理做3次重复，用蒸馏水浇透基质,塑料薄膜罩住保湿,于22℃±5℃培养。统计香鳞毛蕨孢子体诱导率。结果如表2所示。通过香鳞毛蕨配子体诱导的香鳞毛蕨幼苗如图1所示，土培香鳞毛蕨配子体诱导的香鳞毛蕨幼苗如图3所示，大量培养香鳞毛蕨孢子体如图4所示。

表2土培苗长成孢子体的对比

从表2可以看出，本发明方法采用不同数量的水蕨配子体同香鳞毛蕨土培配子体伴生，均长出孢子体。发现1-3株水蕨配子体对香鳞毛蕨孢子体的形成效果显著，诱导率高达86.67％。其中3株水蕨配子体与香鳞毛蕨组培配子体伴生时，孢子体生长数量最多，5株水蕨配子体伴生的孢子体生长数量最少，表明过多的水蕨会影响香鳞毛蕨孢子体的形成，优选1-3株水蕨与香鳞毛蕨伴生。实验组与对照组结果对比明显，表明水蕨对香鳞毛蕨孢子体的生长起到一定的促进作用。香鳞毛蕨与水蕨共同培养的实验组和对照组相比，诱导时间缩短了30d，诱导数目增加1倍，生长速率提高25.00％。

本发明方法克服了通过组织培养和土壤培养诱导孢子体的过程周期较长，且野生的香鳞毛蕨在诱导过程中容易死亡的问题，实现香鳞毛蕨孢子体的工厂化生产，并为实现香鳞毛蕨孢子体的大规模生产提供了有力的技术支持。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。