一种马铃薯茎段组织培养基及其培养方法与流程

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种马铃薯茎段组织培养基，还包括马铃薯试管苗茎段一步成苗培养方法。

背景技术：

马铃薯(solanumtuberosuml.)是茄科茄属一年生草本块茎植物，是重要的粮、菜、饲料和工业原料兼农作物，在我国农业生产中占有相当重要的地位。为了创新种质资源，组织培养技术被广泛的应用于马铃薯育种研究中，并取得了显著成果。

近年来,生物技术的迅猛发展为马铃薯的研究和生产带来了勃勃生机,通过组织培养和遗传转化进行马铃薯遗传改良，已成为马铃薯分子育种的重要方面。然而，无论是遗传转化体系的建立，还是突变体的筛选、优良种苗的快速繁殖及体细胞杂交等技术都有赖于组织培养再生环节。再生体系的建立是利用生活的植物细胞具有全能性的理论基础,通过愈伤组织再生形成新的植株,即通过对外植体进行愈伤组织诱导，再将愈伤组织转移到分化培养基上分化成苗来获得再生植株。目前马铃薯再生体系中采用的外植体主要有试管苗的叶片、茎段、叶柄、根等，主要采用外植体-愈伤组织(诱导培养)-分化幼苗(分化培养)-生根(生根培养)等多个培养程序。即将外植体进行愈伤组织培养，诱导出愈伤组织，再将愈伤组织转接到分化培养基中再生植株。经多步培养途径烦琐、再生率普遍较低且诱导时间较长，而且再生系统易受基因型、外植体种类、植物激素的种类及浓度、培养条件和操作技术水平等诸多因素影响，使马铃薯不同品种的再生系统存在较大差异。本专利针对这些问题研究提出了以茎段为外植体的一步成苗培养基，该培养基使马铃薯试管苗茎段组织培养一步成苗，具有再生周期短，繁殖系数和再生频率高，基因型适应性广谱，易操作，培养程序简单等优点，为马铃薯优良种苗快速繁殖、突变体筛选及品种改良提供一条有效途径。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于针对马铃薯再生体系研究中存在的再生频率低、诱导时间长，不同基因型之间诱导再生条件存在差异等问题，提供一种一步成苗的马铃薯茎段组织培养基及其培养方法。马铃薯试管苗茎段在形成愈伤组织后，不需要转移到分化培养基上，而是直接在原培养基上分化成苗，提高了马铃薯试管苗茎段愈伤组织的再生效率、缩短了培养时间、简化了操作步骤，且基因型适应性广谱，为马铃薯优良种苗快速繁殖、突变体筛选及品种改良提供一条有效途径。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为:

一种马铃薯茎段组织培养基及其培养方法，包括如下步骤：

a.培养基制备

每升ms培养基中添加1～3mg6-苄基氨基嘌呤、0.01～0.1mg萘乙酸、2.5～7.5mg赤霉素、50-100mg肌醇、25～30g食用白糖和3～4.5g琼脂；

ｂ.培养基处理

培养基加热至沸腾，加热过程中不断搅拌，待琼脂完全溶解后将ph值调整为5.8～6.0；分装后高压蒸汽灭菌，灭菌后的培养基静置降温凝固；

c.接种苗处理

选取苗龄20～30天的马铃薯无菌试管苗，无菌条件下，切取0.5cm～1cm不带腋芽的茎段，接种于步骤b的培养基；

d.接种苗培养

将步骤c接种茎段的培养基置于温度为21±2℃、光照强度3500～4000lx、光照时间16h/天的条件下培养；

e.分段培养

培养15天，茎段膨大，有愈伤组织形成，表面形成颗粒状物质或瘤状突起；培养25～30天，茎段愈伤组织分化丛生芽；培养28-35天，获得马铃薯再生植株。

所述步骤b中培养基加热至沸腾，加热过程中不断搅拌，待琼脂完全溶解后将ph值调整为5.8～6.0；分装后高压蒸汽灭菌，蒸汽温度120℃、压力1.5mpa条件下消毒15～20min，灭菌后的培养基静置降温凝固。

所述每升ms培养基中添加3mg6-苄基氨基嘌呤、0.01mg萘乙酸、5mg赤霉素、100mg肌醇。

本发明的有益效果为：

本发明的基本培养基选用ms传统培养基，提供培养组织生长发育所需的无机营养元素和部分有机营养元素；6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、赤霉素是植物生长调节剂，具有促进培养组织形成丛生芽的作用；肌醇促进愈伤组织生长和芽形成；食用白糖提供培养组织生长发育所需的碳素营养；琼脂的主要作用是固化培养基，起支撑作用。本发明提供的培养基具有广谱性，适合多数马铃薯品种茎段组织培养一步成苗。本发明通过合理掌控激素用量及相互间的配比，以及其他辅料的添加，使茎段外植体在形成愈伤组织后，不需要转移到分化培养基上，而是直接在原培养基上分化成苗，缩短培养时间两个月左右，降低了经济成本；而且该培养基具有广谱性，适应于大多数品种。该培养基使马铃薯试管苗茎段组织培养一步成苗，具有再生周期短，繁殖系数和再生频率高，基因型适应性广谱，易操作，培养程序简单等优点，为马铃薯优良种苗快速繁殖、突变体筛选及品种改良提供一条有效途径。

附图说明

图1为本发明培养的丛生芽图；

图2为本发明培养的马铃薯植株图；

图3为本发明培养的马铃薯大西洋再生图；

图4为本发明培养的马铃薯陇薯12号再生图；

图5为本发明培养的马铃薯陇薯8号再生图；

图6为本发明培养的马铃薯陇薯7号再生图；

图7为本发明培养的马铃薯陇薯9号再生图；

图8为本发明培养的马铃薯lk99再生图；

图9为本发明培养的马铃薯陇薯11号再生图；

图10为本发明培养的马铃薯陇薯14号再生图；

图11为本发明培养的马铃薯陇薯4号再生图；

图12为本发明培养的马铃薯陇薯5号再生图；

图13为本发明培养的马铃薯陇薯3号再生图。

具体实施方式

一种马铃薯茎段组织培养基及其培养方法，其特征在于包括如下步骤：

a、培养基制备

每升ms培养基中添加1～3mg6-苄基氨基嘌呤、0.01～0.1mg萘乙酸、2.5～7.5mg赤霉素、50-100mg肌醇、25～30g食用白糖和3～4.5g琼脂；

ｂ、培养基处理

培养基加热至沸腾，加热过程中不断搅拌，待琼脂完全溶解后将ph值调整为5.8～6.0；分装后高压蒸汽灭菌，蒸汽温度120℃、压力1.5mpa条件下消毒15～20min，灭菌后的培养基静置降温凝固；

c、接种苗处理

选取苗龄20～30天的马铃薯无菌试管苗，无菌条件下，切取0.5cm～1cm不带腋芽的茎段，接种于步骤b的培养基；

d、接种苗培养

将步骤c接种茎段的培养基置于温度为21±2℃、光照强度3500～4000lx、光照时间16h/天的条件下培养；

e、分段培养

培养15天，茎段膨大，有愈伤组织形成，表面形成颗粒状物质或瘤状突起；培养25～30天，茎段愈伤组织分化丛生芽；培养28-35天，获得马铃薯再生植株。

优选的所述每升ms培养基中添加3mg6-苄基氨基嘌呤、0.01mg萘乙酸、5mg赤霉素、100mg肌醇。

以下实施例为本发明作详细阐述，图3至图13分别为各品种试管苗茎段一步再生苗。

试验材料选用马铃薯品种陇薯8号的脱毒试管苗，由甘肃省农科院马铃薯所提供。

以ms基本培养基作为对照，采用l16(4⁵)正交设计，在ms培养基中添加不同浓度和组合的6-苄基氨基嘌呤（6-ba）、萘乙酸（naa）、赤霉素（ga3）和肌醇，配制成16组不同的培养基。各组中含有的6-苄基氨基嘌呤、萘乙酸、赤霉素和肌醇的浓度和组合见表1。

将培养基灭菌后，选取苗龄20～30天的陇薯8号无菌试管苗，无菌条件下，切取0.5cm～1cm不带腋芽的茎段，接种于上述培养基上。将接种好的培养瓶置于灯光培养架上培养，温度为21±2℃、光照强度3500lx、光照时间16h/d。培养30d左右统计芽分化率（分化率%=分化外植体数/总外植体数），结果见表2。

注：同列中的不同小写字母表示差异显著，p<0.05；大写字母表示差异极显著，p<0.01

分析表2所得的实验数据可知，4种成分对陇薯8号诱导芽分化的能力由强到弱依次为：6-ba>肌醇>ga3>naa，可看出，6-ba的存在对不定芽的形成影响最大，肌醇的影响次之，ga3和naa的影响较弱。为寻求最佳浓度的激素组合，进行方差分析，结果表明，组合6、8、16之间无极显著差异，但均极显著大于其他组合，其中组合6与8无显著差异，6与16差异显著，8与16无显著差异；组合8、16、9和14之间，16、9、14和11之间，9、14、11和10之间，10、13和4之间，13、4、15和5之间，4、15、5、2和12之间均无极显著差异，但差异显著，而组合2、12和7之间以及7、1、3之间既无极显著差异也无显著差异。综上说明组合6和8均是促进不定芽形成的最优组合，而从丛生芽的长势来看，组合8诱导的丛生芽数量较多且生长势较强。

综上可知，能够使马铃薯茎段离体培养一步成苗的培养基组分为：以ms培养基为基础培养基，并在1lms培养基中，还需补加的组分及各组分的终浓度为：

赤霉素2.5～7.5mg/l；

6-苄基氨基嘌呤1～3mg/l；

萘乙酸0.01～0.1mg/l；

肌醇50-100mg/l。

再结合表2分析第8组所对应的培养基中的各成分的浓度和组合，可知，最佳的马铃薯一步成苗培养基的组分为：1lms培养基中，含有终浓度为5mg/l赤霉素、3mg/l6-苄基氨基嘌呤、100mg/l肌醇和0.01mg/l萘乙酸。

实施例2

利用所述的马铃薯一步成苗培养基，使马铃薯茎段组织培养一步成苗，包括如下步骤：(1)、每升ms培养基中添加1mg6-苄基氨基嘌呤、0.01mg萘乙酸、2.5mg赤霉素、50mg肌醇、25g食用白糖和3g琼脂；ph值调整为5.8；分装后高压蒸汽灭菌。灭菌后的培养基放入接种室内静置，让其降温后凝固。

（2）选取苗龄20～30天的马铃薯品种大西洋无菌试管苗，无菌条件下，切取0.5cm～1cm不带腋芽的茎段，接种于上述培养基上。将接种好的培养瓶置于灯光培养架上培养，温度为21±2℃、光照强度3500lx、光照时间16h/d。

（3）培养28d，得马铃薯再生植株。

实施例3

每升ms培养基中添加3mg6-苄基氨基嘌呤、0.1mg萘乙酸、7.5mg赤霉素、100mg肌醇、30g食用白糖和4.5g琼脂；培养基加热至沸腾，加热过程中不断搅拌，待琼脂完全溶解后将ph值调整为6.0；分装后高压蒸汽灭菌，蒸汽温度120℃、压力1.5mpa条件下消毒15～20min，灭菌后的培养基静置降温凝固；无菌条件下，切取0.5cm～1cm不带腋芽的茎段，接种于步骤b的培养基；将步骤c接种茎段的培养基置于温度为21±2℃、光照强度4000lx、光照时间16h/天的条件下培养；选取苗龄20～30天的马铃薯品种lk99，一步成苗培养基配制及培养方法同上，培养40d，得马铃薯再生植株。

实施例4

每升ms培养基中添加3mg6-苄基氨基嘌呤、0.01mg萘乙酸、5mg赤霉素、100mg肌醇30g食用白糖和4.5g琼脂；培养基加热至沸腾，加热过程中不断搅拌，待琼脂完全溶解后将ph值调整为6.0；分装后高压蒸汽灭菌，蒸汽温度120℃、压力1.5mpa条件下消毒15～20min，灭菌后的培养基静置降温凝固；无菌条件下，切取0.5cm～1cm不带腋芽的茎段，接种于步骤b的培养基；将步骤c接种茎段的培养基置于温度为21±2℃、光照强度4000lx、光照时间16h/天的条件下培养；

选取苗龄20～30天的马铃薯品种陇薯7号，一步成苗培养基配制及培养方法同上，培养32d，得马铃薯再生植株。

实施例5

每升ms培养基中添加2mg6-苄基氨基嘌呤、0.05mg萘乙酸、5mg赤霉素、70mg肌醇、26g食用白糖和4g琼脂；培养基加热至沸腾，加热过程中不断搅拌，待琼脂完全溶解后将ph值调整为6.0；分装后高压蒸汽灭菌，蒸汽温度120℃、压力1.5mpa条件下消毒15～20min，灭菌后的培养基静置降温凝固；无菌条件下，切取0.5cm～1cm不带腋芽的茎段，接种于步骤b的培养基；将步骤c接种茎段的培养基置于温度为21±2℃、光照强度3800lx、光照时间16h/天的条件下培养；选取苗龄20～30天的马铃薯品种陇薯12号，一步成苗培养基配制及培养方法同上，培养30d，得马铃薯再生植株。

实施例6

每升ms培养基中添加3mg6-苄基氨基嘌呤、0.01mg萘乙酸、5mg赤霉素、100mg肌醇30g食用白糖和4.5g琼脂；培养基加热至沸腾，加热过程中不断搅拌，待琼脂完全溶解后将ph值调整为6.0；分装后高压蒸汽灭菌，蒸汽温度120℃、压力1.5mpa条件下消毒15～20min，灭菌后的培养基静置降温凝固；无菌条件下，切取0.5cm～1cm不带腋芽的茎段，接种于步骤b的培养基；将步骤c接种茎段的培养基置于温度为21±2℃、光照强度4000lx、光照时间16h/天的条件下培养；

选取苗龄20～30天的马铃薯品种陇薯9号，一步成苗培养基配制及培养方法同上，培养30d，得马铃薯再生植株。

实施例7

每升ms培养基中添加3mg6-苄基氨基嘌呤、0.01mg萘乙酸、5mg赤霉素、100mg肌醇30g食用白糖和4.5g琼脂；培养基加热至沸腾，加热过程中不断搅拌，待琼脂完全溶解后将ph值调整为6.0；分装后高压蒸汽灭菌，蒸汽温度120℃、压力1.5mpa条件下消毒15～20min，灭菌后的培养基静置降温凝固；无菌条件下，切取0.5cm～1cm不带腋芽的茎段，接种于步骤b的培养基；将步骤c接种茎段的培养基置于温度为21±2℃、光照强度4000lx、光照时间16h/天的条件下培养；

选取苗龄20～30天的马铃薯品种陇薯5号，一步成苗培养基配制及培养方法同上，培养40d，得马铃薯再生植株。

实施例8

每升ms培养基中添加3mg6-苄基氨基嘌呤、0.01mg萘乙酸、5mg赤霉素、100mg肌醇30g食用白糖和4.5g琼脂；培养基加热至沸腾，加热过程中不断搅拌，待琼脂完全溶解后将ph值调整为6.0；分装后高压蒸汽灭菌，蒸汽温度120℃、压力1.5mpa条件下消毒15～20min，灭菌后的培养基静置降温凝固；无菌条件下，切取0.5cm～1cm不带腋芽的茎段，接种于步骤b的培养基；将步骤c接种茎段的培养基置于温度为21±2℃、光照强度4000lx、光照时间16h/天的条件下培养；

选取苗龄20～30天的马铃薯品种陇薯3号、陇薯4号、陇薯11号、陇薯14号，一步成苗培养基配制及培养方法同上，培养35d，得马铃薯再生植株。