本发明属于生物农药领域，具体涉及防治核桃树腐烂病的生物农药，还涉及该农药的制备方法和应用。
背景技术：
：核桃树腐烂病菌(CytosporamandshuricaMiura)属于子囊菌纲，座囊菌目，囊抱菌属。核桃树腐烂病俗称水烂病、烂果病、烂皮病，该病在美国、加拿大、日本和我国均有发生，我国尤以辽宁、山东、河北发病严重。腐烂病菌寄生范围很广，除苹果外还能为害梨、桃、李、杏等多种果树。核桃树腐烂病菌主要危害果实。发病初期在果面部分出现圆形、黑至黑褐色小斑，逐渐扩大成轮纹状。随着症状的进一步发展，病斑呈淡褐至黑褐色，整个果实即变为水渍状软化腐烂。发病后期在病斑表面形成黑色小粒点状的分生抱子器，偶尔从抱子器中溢出白色线头状抱子角。核桃树腐烂病菌不仅侵染田间生长的苹果，引起20％-30％的烂果，由于其潜伏侵染特性，还可引起苹果采后腐烂，成为贮藏期的重要病害，严重影响果实的产质量，给果农造成了很大的经济损失。目前核桃树腐烂病在生产上主要以化学药剂防治为主，而化学农药的广泛应用使公众越来越担心其安全性和对环境造成的污染问题；同时化学防治容易引起抗药性产生，大量使用时会造成农药残留物超标，危害人类及其他生物的生存，引起环境污染，破坏生态平衡。随着人们环保意识的增强和对绿色无公害农产品需求的扩大，使得植物病害的生物防治越来越受到人们的关注，生物防治因其具有对环境、生态和人类健康安全的优点，在世界各国得到了厂泛的重视并发挥着越来越重要的作用。利用生物农药防治植物病害是当今植病界十分活跃的研究领域之一，并已显示出良好的应用前景。生物农药是公认的很有前途的生防因子。生物农药以其种类和数量众多、分布广泛、作用方式多样、对非靶标生物安全及不污染环境等优点而倍受重视。在国内外的研究中，利用生物农药防治植物病害特别是土传病害的报道很多且都取得了良好的效果。但目前并未见用于防治核桃树腐烂病菌的生物农药。技术实现要素：本发明的目的之一在于提供一种防治核桃树腐烂病的生物农药，它具有安全、防治核桃树腐烂病效果好，环境友好等特点，降低了多菌灵的使用次数，减少多菌灵的抗性药；本发明的目的之二在于提供防治核桃树腐烂病的生物农药的制备方法，工艺简单，适合于工业生产；本发明的目的之三在于提供生物农药在防治核桃树腐烂病中的应用。为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：1、防治核桃树腐烂病的生物农药，其特征在于，按重量百分比计由以下组分组成：乳酸菌发酵液200-300倍稀释液5％-10％、枯草芽孢杆菌发酵液200-300倍稀释液10％-25％，细黄连霉菌发酵液200-300倍稀释液10％-25％，苦参、花椒和马鞭草混合物提取物3％-5％，余量为水。优选的，按重量百分比计由以下组分组成：乳酸菌发酵液200-300倍稀释液6％-8％、枯草芽孢杆菌发酵液200-300倍稀释液15％-23％，细黄连霉菌发酵液200-300倍稀释液12％-20％，苦参、花椒和马鞭草混合物提取物3.5％-4.5％，余量为水。优选的，按重量百分比计由以下组分组成：乳酸菌发酵液200-300倍稀释液7％、枯草芽孢杆菌发酵液200-300倍稀释液18％，细黄连霉菌发酵液200-300倍稀释液15％，苦参、花椒和马鞭草混合物提取物4％，余量为水。本发明中，所述乳酸菌发酵液由以下方法制备：将乳酸菌划线培养后挑取单菌落接种于液体培养基内，然后在25-35℃下在摇床中培养20-30小时获得种子液，然后将种子液按重量比为l:8-20接种于液体培养基内，再在25-35℃下在摇床中60-80小时得乳酸菌发酵液；所述枯草芽孢杆菌发酵液由以下方法制备：将枯草芽孢杆菌发酵液划线培养后挑取单菌落于液体培养基内，在25-35℃下在摇床中培养20-30小时获得种子液，然后将种子液按重量比为l:8-20接种于液体培养基内，再在25-35℃下在摇床中60-80小时得枯草芽孢杆菌发酵液；所述细黄连霉菌发酵液由以下方法制备：将细黄连霉菌划线培养后挑取单菌落于液体培养基内，在25-35℃下在摇床中培养30-80小时获得种子液，然后将种子液按重量比为l:8-20接种于液体培养基内，再在25-35℃下在摇床中60-80小时得细黄连霉菌发酵液；所述苦参、花椒和马鞭草混合物提取物由以下方法制备：按重量比为1～2:1～2:1～2分别取花椒、马鞭草和苦参干品混合，加入相当于混合物重量3～5倍的水浸泡1～3小时，然后90～100℃保持10～30分钟，冷却，过滤弃残渣，收集滤液即可。进一步，所述液体培养基由以下方法制备：按重量份取淀粉10-30份，牛肉膏10-30份，蛋白胨10-30份，NaCl4-8份，水1000-3000份；充分溶解后加入NaOH调pH至7-7.5，过滤，经湿热灭菌，冷却至18～35℃即得液体培养基。2、所述防治核桃树腐烂病的生物农药的制备方法，包括如下步骤：a、按配方取乳酸菌发酵液的200-300倍稀释液，然后加入配方量的枯草芽孢杆菌发酵液200-300倍稀释液和细黄连霉菌发酵液200-300倍稀释液，获得发酵液混合物，记为培养液A；b、按重量比分别取花椒、马鞭草和苦参干品，加入相当于混合物重量3～5倍的水浸泡1～3小时，然后90～100℃保持10～30分钟，冷却，过滤弃残渣，收集滤液获得苦参、花椒和马鞭草混合物提取物；c、将培养液A与苦参、花椒和马鞭草混合物提取物混合搅拌均匀后，于30℃-50℃放置48h以上即得防治核桃树腐烂病的生物农药。本发明中，所述乳酸菌发酵液由以下方法制备：将乳酸菌划线培养后挑取单菌落接种于液体培养基内，然后在25-35℃下在摇床中培养20-30小时获得种子液，然后将种子液按重量比为l:8-20接种于液体培养基内，再在25-35℃下在摇床中60-80小时得乳酸菌发酵液；所述枯草芽孢杆菌发酵液由以下方法制备：将枯草芽孢杆菌发酵液划线培养后挑取单菌落于液体培养基内，在25-35℃下在摇床中培养20-30小时获得种子液，然后将种子液按重量比为l:8-20接种于液体培养基内，再在25-35℃下在摇床中60-80小时得枯草芽孢杆菌发酵液；所述细黄连霉菌发酵液由以下方法制备：将细黄连霉菌划线培养后挑取单菌落于液体培养基内，在25-35℃下在摇床中培养30-80小时获得种子液，然后将种子液按重量比为l:8-20接种于液体培养基内，再在25-35℃下在摇床中60-80小时得细黄连霉菌发酵液。优选的，所述液体培养基由以下方法制备：按重量份取淀粉10-30份，牛肉膏10-30份，蛋白胨10-30份，NaCl4-8份，水1000-3000份；充分溶解后加入NaOH调pH至7-7.5，过滤，经湿热灭菌，冷却至18～35℃即得液体培养基。本发明的有益效果在于：(1)本发明的防治核桃树腐烂病的生物农药，是将拮抗细菌发酵液与中药提取物按一定比例制成(微)生物农药，具有防效好、安全、环境友好等特点，降低了化学农药的使用次数，减少抗性药，是生产绿色食品所必须的生物农药。(2)本发明的防治核桃树腐烂病的生物农药的制备方法，操作简单，对环境友好，适于大规模生产。具体实施方式下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例1防治核桃树腐烂病的生物农药，按重量百分比计由以下组分组成：乳酸菌发酵液200-300倍稀释液5％、枯草芽孢杆菌发酵液200-300倍稀释液10％，细黄连霉菌发酵液200-300倍稀释液10％，苦参、花椒和马鞭草混合物提取物3％，余量为水。其中乳酸菌发酵液由以下方法制备：取固体琼脂平板培养基，将乳酸菌接种于固体琼脂平板培养基，在25℃下培养30小时得菌落；取单菌落，接种于灭菌液体培养基内在25℃下在摇床中培养20小时，制成种子液；将种子液接种到灭菌液体培养基内，25℃下在摇床中60小时得乳酸菌发酵液；种子液与液体培养基的重量份数比为l:8。枯草芽孢杆菌发酵液由以下方法制备：取固体琼脂平板培养基，将枯草芽孢杆菌发酵液接种于固体琼脂平板培养基，在25℃下培养30小时得菌落；取单菌落，接种于灭菌液体培养基内在25℃下在摇床中培养20小时，制成种子液；将种子液接种到灭菌培养基内，25℃下在摇床中60小时得枯草芽孢杆菌发酵液；种子液与培养液的重量份数比为l:8；细黄连霉菌发酵液由以下方法制备：取固体琼脂平板培养基，将细黄连霉菌接种于固体琼脂平板培养基，在25℃下培养30小时得菌落；取单菌落，接种于灭菌液体培养基内在25℃下在摇床中培养20小时，制成种子液；将种子液接种到灭菌培养基内，25℃下在摇床中60小时得细黄连霉菌发酵液；种子液与培养液的重量份数比为l:8。所述苦参、花椒和马鞭草混合物提取物由以下方法制备：按重量份分别取花椒、马鞭草和苦参干品各1份，加水10份浸泡2小时后100℃保持10分钟，冷却，过滤弃残渣，收集滤液即可。防治核桃树腐烂病的生物农药制备方法：a、按配方取乳酸菌发酵液的200-300倍稀释液，然后加入配方量的枯草芽抱杆菌发酵液200-300倍稀释液和细黄连霉菌发酵液200-300倍稀释液，获得培养液A；b、按重量份分别取花椒、马鞭草和苦参干品各1份，加水10份浸泡2小时后100℃保持10分钟，冷却，过滤弃残渣，收集滤液获得苦参、花椒和马鞭草混合物提取物；c、将培养液A与苦参、花椒和马鞭草混合物提取物混合搅拌均匀后，于30℃放置48h以上即得防治核桃树腐烂病的生物农药。本实施例中，固体琼脂平板培养基是由下述制备方法制得：按重量份取1份胰蛋白胨，0.5份酵母提取物，0.5份氯化钠，1份琼脂和水800份，混合加热熔化，加入NaOH调pH至7，过滤，装瓶封口后进行湿热灭菌，无菌操作倒入平板，冷却至室温得固体培养基。本实施例中，液体培养基是由下述制备方法制得：按重量份取淀粉10份，牛肉膏10份，蛋白胨10份，NaCl4份和水1000份；混合加热熔化，加入NaOH调pH至7，过滤，装瓶封口后进行湿热灭菌，冷却至室温得液体培养基。其中，湿热灭菌是装瓶封口的培养基放入高压蒸汽灭菌锅内，0.8kg/cm2，115℃，15min湿热灭菌。实施例2防治核桃树腐烂病的生物农药，按重量百分比计由以下组分组成：乳酸菌发酵液200-300倍稀释液10％、枯草芽抱杆菌发酵液200-300倍稀释液25％，细黄连霉菌发酵液200-300倍稀释液25％，苦参、花椒和马鞭草混合物提取物5％，余量为水。其中乳酸菌发酵液由以下方法制备：取固体琼脂平板培养基，将乳酸菌接种于固体琼脂平板培养基，在30℃下培养36小时得菌落；取单菌落，接种于灭菌液体培养基内在30℃下在摇床中培养24小时，制成种子液；将种子液接种到灭菌液体培养基内，25℃下在摇床中72小时得乳酸菌发酵液；种子液与液体培养基的重量份数比为l:9。枯草芽孢杆菌发酵液由以下方法制备：取固体琼脂平板培养基，将枯草芽孢杆菌发酵液接种于固体琼脂平板培养基，在30℃下培养36小时得菌落；取单菌落，接种于灭菌液体培养基内在30℃下在摇床中培养24小时，制成种子液；将种子液接种到灭菌培养基内，30℃下在摇床中72小时得枯草芽孢杆菌发酵液；种子液与培养液的重量份数比为l:9；所述细黄连霉菌发酵液由以下方法制备：取固体琼脂平板培养基，将细黄连霉菌接种于固体琼脂平板培养基，在30℃下培养36小时得菌落；取单菌落，接种于灭菌液体培养基内在30℃下在摇床中培养24小时，制成种子液；将种子液接种到灭菌培养基内，30℃下在摇床中72小时得细黄连霉菌发酵液；种子液与培养液的重量份数比为l:9。所述苦参、花椒和马鞭草混合物提取物由以下方法制备：按重量份分别取花椒、马鞭草和苦参干品各1份，加水10份浸泡2小时后100℃保持20分钟，冷却，过滤弃残渣，收集滤液即可。防治核桃树腐烂病的生物农药制备方法：a、按配方取乳酸菌发酵液的200-300倍稀释液，然后加入配方量的枯草芽抱杆菌发酵液200-300倍稀释液和细黄连霉菌发酵液200-300倍稀释液，获得培养液A；b、按重量份分别取花椒、马鞭草和苦参干品各1份，加水10份浸泡2小时后100℃保持20分钟，冷却，过滤弃残渣，收集滤液获得苦参、花椒和马鞭草混合物提取物；c、将培养液A与苦参、花椒和马鞭草混合物提取物混合搅拌均匀后，于35℃放置48h以上即得防治核桃树腐烂病的生物农药。本实施例中，固体琼脂平板培养基是由下述制备方法制得：按重量份取1份胰蛋白胨，0.5份酵母提取物，0.5份氯化钠，1份琼脂和水800份，混合加热熔化，加入NaOH调pH至7，过滤，装瓶封口后进行湿热灭菌，无菌操作倒入平板，冷却至室温得固体培养基。本实施例中，液体培养基是由下述制备方法制得：按重量份：取淀粉20份，牛肉膏20份，蛋白胨20份，NaCl5份，水2000份；加入到沸水浴锅中混合加热熔化，加入NaOH调pH至7.5，过滤，装瓶封口后进行湿热灭菌，冷却至室温得液体培养基。其中，湿热灭菌是装瓶封口的培养基放入高压蒸汽灭菌锅内，0.9kg/cm2，120℃，25min湿热灭菌。固体琼脂平板培养基是由下述制备方法制得：1.5份胰蛋白胨，0.6份酵母提取物，0.6份氯化钠，1.5份琼脂，水1000份加入到沸水浴锅中混合加热熔化，加入NaOH调pH至7.5，过滤，装瓶封口后进行湿热灭菌，无菌操作倒入平板，冷却至室温得固体培养基。实施例3防治核桃树腐烂病的生物农药，按重量百分比计由以下组分组成：乳酸菌发酵液200-300倍稀释液10％、枯草芽抱杆菌发酵液200-300倍稀释液15％，细黄连霉菌发酵液200-300倍稀释液15％，苦参、花椒和马鞭草混合物提取物4％，余量为水。其中乳酸菌发酵液由以下方法制备：取固体琼脂平板培养基，将乳酸菌接种于固体琼脂平板培养基，在35℃下培养80小时得菌落；取单菌落，接种于灭菌液体培养基内在35℃下在摇床中培养30小时，制成种子液；将种子液接种到灭菌液体培养基内，35℃下在摇床中80小时得乳酸菌发酵液；种子液与液体培养基的重量份数比为l:20。枯草芽抱杆菌发酵液由以下方法制备：取固体琼脂平板培养基，将枯草芽孢杆菌发酵液接种于固体琼脂平板培养基，在35℃下培养80小时得菌落；取单菌落，接种于灭菌液体培养基内在35℃下在摇床中培养30小时，制成种子液；将种子液接种到灭菌培养基内，30℃下在摇床中80小时得枯草芽孢杆菌发酵液；种子液与培养液的重量份数比为l:20；所述细黄连霉菌发酵液由以下方法制备：取固体琼脂平板培养基，将细黄连霉菌接种于固体琼脂平板培养基，在35℃下培养80小时得菌落；取单菌落，接种于灭菌液体培养基内在35℃下在摇床中培养30小时，制成种子液；将种子液接种到灭菌培养基内，30℃下在摇床中80小时得细黄连霉菌发酵液；种子液与培养液的重量份数比为l:20。所述苦参、花椒和马鞭草混合物提取物由以下方法制备：按重量份分别取花椒、马鞭草和苦参干品各1份，加水10份浸泡2小时后100℃保持30分钟，冷却，过滤弃残渣，收集滤液即可。防治核桃树腐烂病的生物农药制备方法：a、按配方取乳酸菌发酵液的200-300倍稀释液，然后加入配方量的枯草芽抱杆菌发酵液200-300倍稀释液和细黄连霉菌发酵液200-300倍稀释液，获得培养液A；b、按重量份分别取花椒、马鞭草和苦参干品各1份，加水10份浸泡2小时后100℃保持30分钟，冷却，过滤弃残渣，收集滤液获得苦参、花椒和马鞭草混合物提取物；c、将培养液A与苦参、花椒和马鞭草混合物提取物混合搅拌均匀后，于50℃放置48h以上即得防治核桃树腐烂病的生物农药。本实施例中，液体培养基是由下述制备方法制得：按重量份：取淀粉30份，牛肉膏30份，蛋白胨30份，NaCl8份，水3000份；加入到沸水浴锅中混合加热熔化，加入NaOH调pH至7.5，过滤，装瓶封口后进行湿热灭菌，冷却至室温得液体培养基。其中，湿热灭菌是装瓶封口的培养基放入高压蒸汽灭菌锅内，1.05kg/cm2，130℃，30min湿热灭菌。固体琼脂平板培养基是由下述制备方法制得：2份胰蛋白胨，1份酵母提取物，1份氯化钠，1.5份琼脂，水1000份加入到沸水浴锅中混合加热熔化，加入NaOH调pH至7.5，过滤，装瓶封口后进行湿热灭菌，无菌操作倒入平板，冷却至室温得固体培养基。实施例4防治核桃树腐烂病的生物农药，按重量百分比计由以下组分组成：乳酸菌发酵液200-300倍稀释液7％、枯草芽抱杆菌发酵液200-300倍稀释液18％，细黄连霉菌发酵液200-300倍稀释液15％，苦参、花椒和马鞭草混合物提取物4％，余量为水。其制备方法与实施例1相同。实施例5防治核桃树腐烂病的生物农药，按重量百分比计由以下组分组成：乳酸菌发酵液200-300倍稀释液6％、枯草芽抱杆菌发酵液200-300倍稀释液15％，细黄连霉菌发酵液200-300倍稀释液12％，苦参、花椒和马鞭草混合物提取物3.5％，余量为水。其制备方法与实施例1相同。实施例6防治核桃树腐烂病的生物农药，按重量百分比计由以下组分组成：乳酸菌发酵液200-300倍稀释液8％、枯草芽抱杆菌发酵液200-300倍稀释液23％，细黄连霉菌发酵液200-300倍稀释液20％，苦参、花椒和马鞭草混合物提取物4.5％，余量为水。其制备方法与实施例1相同。应用实施例：为了证明本发明的生物农药对核桃树腐烂病的效果进行了多次试验，防治效果效好，下述实验中所用生物农药是采用实施例1～7的方法制备的，另外，还做了三组平行对照试验，对照A的生物农药配方不含乳酸菌发酵液，对照B的生物农药配方不含枯草芽孢杆菌发酵液，对照C的生物农药配方不含细黄连霉菌发酵液，其余同实施例1。每组田间实验4年总计实验示范339亩2508棵有腐烂病的核桃树，每棵树只喷施一次。试验结果如表1-4：实验结果表明，本发明对核桃腐烂病当年治愈率为100％，次年有20棵核桃树腐烂病复发，复发率为0.80％，最高复发率为0.94％，最低复发率为0.59％。表1本发明的生物农药田间试验结果年份病树当年治愈治愈率次年复发复发率2013502502100％40.80％2014532532100％50.94％2015676622100％40.59％2016798792100％60.75％平均627627100％50.80％总计25082508100％200.80％表2对照A的生物农药田间试验结果年份病树当年治愈治愈率次年复发复发率201350247193.8％40.80％201453250494.7％50.94％201567663593.9％40.59％201679876595.8％70.88％平均627593.7594.6％50.80％总计2508237594.6％200.80％表3对照B的生物农药田间试验结果年份病树当年治愈治愈率次年复发复发率201350248997.6％71.4％201453250695.3％81.5％201567665797.3％91.3％201679876395.9％111.4％平均62760496.5％8.751.4％总计2508241696.5％351.4％表4对照C的生物农药田间试验结果结合上述试验，本发明的生物农药田间实验结果表明有下述特点：1、本发明农药治愈率高，复发率低。当年一次喷施总治愈率达100％，平均复发率为0.80％最高不超过1％。2、本发明无需多次喷施，每个疤只需一次就可康复。3、无需严格刮净病疤，适合于大多数果农掌握和使用。4、本发明农药无污染，适合于绿色食品生产，有利于提高果品品质。最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。当前第1页1 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