一种玉米籽粒离体培养方法与流程

本发明涉及作物栽培籽粒培养领域。具体涉及到一种玉米籽粒离体培养方法。

背景技术：

玉米是一年生禾本科草本植物，是重要的粮食作物和重要的饲料来源，也是总产量很高的粮食作物。

玉米的器官有根、茎、叶、雄穗、雌穗等。其中，雌穗是肉穗花序，受精结实发育成果穗，果穗中心有穗轴，玉米花丝依附于果穗，苞叶包裹在外部。玉米的生长受到诸多因素的影响，大致有温度、湿度、温差、日照时数、玉米病害、本身的遗传因素以及营养元素等。

近年来，我国华北、西北和东北等区域频繁地出现高温和干旱等极端性气候，且高温和干旱持续时间增长，对全国玉米产量和品质产生了重要影响，已成为我国玉米生产的主要限制因子；另外，我国6-8月份华北、黄淮海地区连阴雨灾害经常发生，玉米生育期内日照不足会直接影响营养生长、碳氮代谢及产量的形成；此外，玉米生育后期的病害，如穗腐病、瘤黑粉病，也是造成玉米产量下降的一大原因。

除了上述生物和非生物逆境对玉米籽粒生长发育的影响，在适宜的条件下，玉米籽粒库容建成及充实主要受遗传控制，但在大田条件下，营养元素和植物生长调节剂对粒重的增加也起着调控作用。

目前针对以上生物和非生物逆境，营养元素及植物生长调节剂对玉米籽粒生长发育影响的研究多采用人工气候室和大田试验。由于玉米生育后期植株高大，人工气候室往往因场地限制不能满足玉米的生长要求，且无法大批量操作。而大田试验因受外界环境因素影响较大，无法深入研究某一胁迫或营养物质对籽粒生长发育的影响。现有的玉米籽粒离体培养技术多集中在1980s，如1977年gengenbach提出的玉米果穗离体培养系统，1981年jones提出的玉米籽粒固体培养技术，1989年singletary和below提出的玉米籽粒液体培养技术。但上述三种方法在玉米籽粒培养过程中很容易出现染菌、籽粒不能培养至成熟、籽粒爆裂等问题。

因此，为了更好地研究影响玉米籽粒生长发育的因素，目前亟需一种新的玉米籽粒离体培养技术，从而避免在籽粒培养过程中出现上述问题。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种玉米籽粒离体培养方法，从而避免在籽粒培养过程中出现染菌、籽粒不能培养至成熟、籽粒爆裂等问题，且能将籽粒培养至成熟，从而能够更好地研究影响玉米籽粒发育的因素。

为实现上述目的，本发明提供了一种玉米籽粒离体培养方法，包括以下步骤：

(1)将玉米果穗剥去苞叶，剪去花丝，用酒精灭菌；

(2)将所述灭菌后的玉米果穗分块获得玉米样块；

(3)将所述玉米样块进行分粒；

(4)将所述通过分粒获得的玉米籽粒放入培养基进行培养；

其中所述培养基的组分包括氨基酸母液、大量元素母液、微量元素母液、有机母液、铁盐母液和碳源。

上述玉米籽粒离体培养方法在另一种实施方式中，在步骤(1)中用75％的酒精将剪去花丝的玉米果穗进行灭菌，然后将所述灭菌后的玉米果穗转至超净工作台。

上述玉米籽粒离体培养方法在另一种实施方式中，在步骤(2)中，所述分块为：将所述玉米果穗在与穗轴垂直的方向切出相邻三圈籽粒作为玉米样块，然后将所述玉米样块在与穗轴平行方向切出相邻3列籽粒并至少保留这3列籽粒的部分穗轴，获得9颗玉米籽粒及其穗轴。

上述玉米籽粒离体培养方法在另一种实施方式中，在步骤(3)中，所述分粒为：切除所述获得的9颗玉米籽粒中的8颗玉米籽粒及其穗轴，保留所述9颗玉米籽粒中央的1颗籽粒及其穗轴，然后将所述保留的1颗籽粒所连接的穗轴进行部分切除，得到连接有部分穗轴的玉米籽粒。

上述玉米籽粒离体培养方法在另一种实施方式中，所述氨基酸母液包括谷氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、精氨酸、色氨酸、丝氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺；所述大量元素母液包括kh2po4，mgcl2·6h2o和cacl2·6h2o；所述微量元素母液包括h3bo3，mnso4·h2o，znso4·7h2o，ki，namoo4·2h2o，cuso4·5h2o和cocl2·6h2o；所述有机母液包括盐酸硫胺素、叶酸和烟酸；所述铁盐母液包括edta·2na和feso4·7h2o；所述碳源包括蔗糖。

上述玉米籽粒离体培养方法在另一种实施方式中，所述氨基酸母液中各组分的浓度分别为：谷氨酸600-650mg/l、蛋氨酸40-45mg/l、丙氨酸150-180mg/l、酪氨酸85-98mg/l、组氨酸45-65mg/l、苏氨酸65-75mg/l、脯氨酸200-250mg/l、精氨酸45-60mg/l、色氨酸65-80mg/l、丝氨酸110-130mg/l、甘氨酸55-65mg/l、缬氨酸105-125mg/l、亮氨酸355-365mg/l、赖氨酸30-35mg/l、谷氨酰胺100-110mg/l、苯丙氨酸130-140mg/l、异亮氨酸80-90mg/l、半胱氨酸50-60mg/l、天冬氨酸170-180mg/l和天冬酰胺102-110mg/l；所述大量元素母液中各组分的浓度分别为kh2po44.5-5.5g/l，mgcl2·6h2o2.5-3.5g/l和cacl2·6h2o1.2-2.5g/l；所述微量元素母液中各组分的浓度分别为h3bo30.5-0.7g/l，mnso4·h2o1.5-1.8g/l，znso4·7h2o0.1-0.4g/l，ki0.05-0.15g/l，namoo4·2h2o0.01-0.04g/l，cuso4·5h2o0.001-0.004g/l和cocl2·6h2o0.001-0.004g/l；所述有机母液中各组分的浓度为盐酸硫胺素0.02-0.06g/l、叶酸0.002-0.006g/l和烟酸0.005-0.03g/l；所述铁盐母液中各组分的浓度为edta·2na30-45mg/l和feso4·7h2o20-35mg/l；所述碳源中所包含的蔗糖的浓度为130-170g/l。

上述玉米籽粒离体培养方法在另一种实施方式中，所述培养基包括固体培养基，并且所述固体培养基通过如下步骤制备：

在容量为2l的烧杯中倒入200-300ml蒸馏水，然后加入所述氨基酸母液80-120ml、所述大量元素母液80-120ml、所述微量元素母液8-12ml、所述有机母液8-12ml、所述铁盐母液3-6ml和所述碳源130-160g，搅拌溶解得到混合溶液，将所述混合溶液加入到容量瓶中，用蒸馏水定容至1l，用hcl或naoh调整ph值至5.7-5.8，再加入5-6g凝固剂，加热至沸腾，直至所述凝固剂完全融化，然后分装于容量为250ml的锥形瓶中，其中每个锥形瓶分装35-45ml，将所述锥形瓶瓶口进行封口，放入高压灭菌锅，110-130℃灭菌15-25分钟获得所述固体培养基；其中所述凝固剂包括琼脂，并且所述琼脂的浓度为3-7g/l。

上述玉米籽粒离体培养方法在另一种实施方式中，所述培养基包括液体培养基，并且所述液体培养基通过如下步骤制备：

在容量为2l的烧杯中倒入200-300ml蒸馏水，然后加入所述氨基酸母液80-120ml、所述大量元素母液80-120ml、所述微量元素母液8-12ml、所述有机母液8-12ml、所述铁盐母液3-6ml和所述碳源130-160g，搅拌溶解得到混合溶液，将所述混合溶液加入到容量瓶中，用蒸馏水定容至1l，用hcl或naoh调整ph值至5.7-5.8，然后分装于容量为250ml的锥形瓶中，其中每个锥形瓶分装35-45ml，将所述锥形瓶瓶口进行封口，放入高压灭菌锅，110-130℃灭菌15-25分钟获得所述液体培养基。

上述玉米籽粒离体培养方法在另一种实施方式中，将所述得到的玉米籽粒的穗轴部分向下插入所述固体培养基中进行培养。

上述玉米籽粒离体培养方法在另一种实施方式中，在培养皿中加入所述液体培养基，将支撑物放入所述液体培养基中，在所述支撑物上面覆盖滤纸，然后将所述得到的玉米籽粒的穗轴部分放在由所述支撑物支撑的所述滤纸之上进行培养，其中所述培养皿的直径为6-10cm，所述支撑物的高度为0.5cm-1.5cm，所述培养皿中需要加入所述液体培养基10-15ml。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本申请通过调整培养基组分和配比，形成了一套成熟的玉米籽粒离体培养方法，该玉米籽粒离体培养方法在保证灭菌的前提下节省了现有技术中多种灭菌剂的使用，从而简化了灭菌过程，降低了污染率，从而能避免在籽粒培养过程中出现染菌、籽粒不能培养至成熟、籽粒爆裂等问题，并且减少了对玉米果穗造成过多切口，对籽粒的伤害程度降到最低，从而能将籽粒培养至成熟；并且成熟期离体培养玉米籽粒的干重能达到大田籽粒干重的80％；通过控制培养的外界条件(温湿度、病害等)，改变培养基中营养元素的含量或添加植物生长调节剂，可研究环境和栽培措施对玉米籽粒发育的影响。

附图说明

图1是根据本发明的玉米籽粒离体培养流程。

图2是根据本发明的玉米籽粒固体培养法，其中，21-锥形瓶，22-玉米籽粒，23-穗轴，24-固体培养基。

图3是根据本发明的玉米籽粒液体培养法，其中，31-培养皿，32-滤纸，33-支撑物。

图4是根据本发明的不同处理籽粒的干、鲜重变化。

图5是根据本发明的成熟期不同培养条件下玉米籽粒的形态，

其中，a-液体培养籽粒，b-固体培养籽粒，c-大田生长籽粒。

图6是根据本发明的离体培养与大田生长籽粒干重的回归分析。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

一、培养基配制(固体培养基和液体培养基)

培养基组分包括氨基酸、大量元素、微量元素、有机物、铁盐、碳源、凝固剂等。首先对以上组分配制成相应的母液，具体见表1，然后根据需求取相应的母液配制成培养基。以配制1l固体培养基为例，先在烧杯中倒入一些蒸馏水，分别量取氨基酸母液100ml、大量元素母液100ml、微量元素母液10ml、有机母液10ml、铁盐母液5ml倒入所述烧杯中，然后称取蔗糖150g倒入所述烧杯，搅拌溶解，加蒸馏水用容量瓶定容至1l，用hcl或naoh调整ph值至5.7-5.8，称取5.5g琼脂粉倒入配好的溶液中，放在电炉上加热至沸腾，直至琼脂粉完全融化。趁热分装于锥形瓶，其中每个锥形瓶含40ml培养基，瓶口用无菌培养容器封口膜(12cm*12cm)封口，放入高压灭菌锅，121℃灭菌20分钟。液体培养基无琼脂凝固剂，其他组分同固体培养基。

表1.固体培养基母液组分及相应的浓度

二、培养流程

从玉米果穗灭菌处理到籽粒培养完成，整个流程可分为四个过程，即玉米果穗灭菌、玉米果穗分块、玉米样块分粒和玉米籽粒培养，具体步骤入下：

①玉米果穗灭菌：

将玉米果穗剥去外面几层苞叶，剪去花丝，75％酒精灭菌；转至超净工作台，所述玉米穗无需再次灭菌。

②玉米果穗分块：

根据试验需求，对玉米果穗进行分块处理。根据培养籽粒在穗部的位置(如强势粒、弱势粒)横向切出三圈籽粒，所需培养的籽粒位于中间一圈。以穗轴中心为起点，切出扇形的并列3排籽粒，此时每个玉米样块有9颗籽粒。

③玉米样块分粒

切除所述获得的9颗玉米籽粒中的8颗玉米籽粒，保留所述玉米样块中央的1颗籽粒，并将所述保留的1颗籽粒所连接的穗轴进行部分切除，得到连接有部分穗轴的玉米籽粒。

④籽粒培养

将所述得到的玉米籽粒的穗轴部分向下插入固体培养基。如使用液体培养基，需以铝条为支撑物(铝条长度根据培养皿大小调整)，所述铝条上面覆盖滤纸，然后将所述得到的玉米籽粒的穗轴部分放入由所述铝条支撑的滤纸之上。每个籽粒需提供12ml的培养液。根据试验要求设置培养条件，如温度25℃，相对湿度75％。以两个星期为一个周期，把培养的籽粒转移至新的培养基。

三、玉米籽粒离体培养方法筛选与体系的建立

3.1不同培养条件下籽粒的干鲜重动态变化

由图4可以看出，不同处理的籽粒干、鲜重是在授粉后天数(dap)为10天后显现出差异。大田籽粒的鲜重保持较高的增长率，在40dap，其鲜重分别比液体、固体培养高62.5％、40.0％。液体、固体培养籽粒的鲜重变化在30dap趋于稳定，籽粒含水量下降。各处理的籽粒干重随着培养天数的增加，均呈上升趋势，在40dap达到最大。就干重变化趋势来看，固体培养籽粒更接近大田生长籽粒。

3.2成熟期不同培养条件下玉米籽粒的形态

从图5可以发现通过固体培养基培养的玉米籽粒发育饱满充实，通过液体培养基培养的玉米籽粒发育饱满充实度要低于通过固体培养基培养的玉米籽粒发育饱满充实度。

3.3大田生长于离体培养籽粒干重的回归分析

液体、固体培养与大田生长籽粒的干重回归分析如图6所示，两种培养方法下的籽粒与大田生长的干重积累呈线性回归关系。液体、固体培养方法的回归方程分别y＝-0.023+2.3785x、y＝-0.0066+1.3821x，回归系数均为正值，均与大田生长籽粒呈正相关关系。其相关系数分别为0.9491、0.9898，均为极显著相关，但固体培养相关值高于液体培养。可见，离体培养籽粒能够很好的反映大田自然生长籽粒的干物质积累，且固体培养条件下的籽粒表现更好。

3.4不同培养条件下籽粒的污染率和发育

通过比较各处理籽粒在40dap的发育情况，发现处理间的干、鲜重及体积均有显著性差异(见表2)，且大小顺序均为大田＞固体培养＞液体培养。液体、固体培养籽粒的干重分别比对照低56.5％、21.7％，鲜重分别比对照低62.5％、40％，在40dap对照籽粒的含水量比体外培养籽粒高。液体培养的污染率比固体培养高71.3％，但败育率比其低4.4％。

表2在40dap不同培养条件下玉米籽粒的发育

同列无字母或数据肩标相同字母表示差异不显著(p＞0.05)，不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)，不同大写字母表示差异极显著(p＜0.01)。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。