一种利用水稻隐性畸形颖壳恢复系制种混收并分离杂交种子的方法与流程

本发明涉及农作物育种及制种领域，具体地说，涉及一种利用水稻隐性畸形颖壳恢复系制种混收并分离杂交种子的方法。

背景技术：

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球一半以上的人口以大米为主食，稻谷的产量关系到世界的粮食安全。自1973年杂交水稻成功实现三系配套以来，杂交水稻的大面积推广应用为中国乃至世界粮食安全作出了重要贡献(袁隆平.(2002).杂交水稻学.中国农业出版社.前言.)。但杂交水稻只能利用双亲杂交第一代(f1)，必须年年制种才能保证大田生产用种。传统杂交水稻制种环节多、工序繁杂、劳动强度大，属于劳动密集型产业。随着社会的发展，中国农村劳动力日益缺乏，且价格不断上涨，杂交水稻的制种成本也随之上涨。业内比较公认的看法是，进一步提高机械化水平、提高效率、降低成本是未来杂交水稻制种发展的趋势。

目前，主要有3种可提高杂交水稻制种机械化水平的方法：一是恢复系、不育系分开种植，利用机械收集恢复系花粉为不育系授粉，可单独收获杂交种子。此种方法制种最自由，但水稻花粉保持活力的时间很短，技术难度极大，短时期内难以实现；二是恢复系、不育系大厢种植，收割机可分开收获杂交种子与恢复系。此种方法较为简便，但恢复系所占比例过大，降低了不育系的比例，且恢复系、不育系距离较远授粉难度较大，制种产量较低；三是恢复系、不育系混种，利用机械混收杂交种子与恢复系种子，然后再通过机械将杂交种子分离出来。利用恢复系、不育系在某些性状上的显著差异，杂交种子和恢复系种子可实现分离。此种方法较为复杂，但不育系比例高，恢复系、不育系距离近且分布均匀，有利于提高制种产量，是目前提高杂交水稻机械化制种水平的较好途径(王杰,邓华凤,张武汉,孙平勇,何强.(2013).杂交水稻机械化制种技术的研究现状与发展策略.安徽农业科学,41(13):5682-5683.)。

近年来，在实现杂交种子和恢复系种子可分离方面取得了较为丰硕的研究成果。比如，国内科研人员提出了基于双亲在除草剂抗性、颖壳颜色等性状上的差异实现杂交种子和恢复系种子分离的技术策略。但到目前为止，生产上大面积推广应用的尚未见报道。这主要是由于以下2个方面的原因：一是这些技术的配套要求高，短时间内难以达到。比如，种子色选机需要较大的投入，相关技术研究需要一定的时间；二是技术本身存在一定的缺陷。比如，授粉后的恢复系对除草剂有一定的抗性，而且同一株水稻上籽粒成熟有先后，植株被杀死时可能有少量种子可以发芽，从而影响杂交种子纯度。因此，迫切需要一种能够与现有种子加工相结合、不需要增添新的机械就能完成杂交种子和恢复系种子分离的机械化制种技术。

技术实现要素：

本发明的目的是解决现有技术存在的不足之处，提供一种制种混收杂交种子可分离的水稻恢复系选育方法及其应用。

本发明的技术方案如下：

本发明首先提供了一种利用水稻隐性畸形颖壳恢复系制种混收并分离杂交种子的方法，包括如下步骤：

(1)选育出综合性状优良且具有畸形颖壳性状的恢复系；

所述畸形颖壳性状由隐性单基因或寡基因控制；

(2)以步骤(1)选育得到的恢复系为父本，以生产上大面积应用或新选育的不育系为母本，进行广泛测交，选育出通过省级或国家审定的亲本组合；

(3)以所述恢复系作父本，以步骤(2)得到的相应不育系作母本，将二者种子进行混播/混插/混抛，杂交种子成熟后和恢复系种子混收，在种子精选加工过程中去除畸形颖壳的恢复系种子。

进一步地，步骤(1)所述恢复系为通过遗传改良方法创制出，综合性状优良，可直接在生产上应用的的畸形颖壳恢复系。

其中，所述遗传改良方法包括但不限于杂交、回交、诱变或基因组编辑。

作为优选，当步骤(1)中利用杂交或回交手段选育恢复系时，以隐性单基因或寡基因控制的畸形颖壳材料为供体，通过杂交或回交选育出综合性状优良且具有畸形颖壳性状的恢复系。

作为优选，步骤(3)中，混播/混插/混抛的制种田穗数比例为优良恢复系:不育系＝1:4～1:30。

进一步地，步骤(3)中，待水稻抽穗扬花后，利用人力、无人机或自然风力由恢复系给不育系授粉。

本发明进一步的提供了所述方法在制备水稻杂交种子方面的应用。

本发明涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明采用的恢复系具有由隐性基因控制的畸形颖壳性状，不会对杂交种子及商品粮的颖壳性状产生影响。同时，在种子的正常精选加工过程中恢复系种子得以巧妙去除，不需要增加新的设备，可节约成本；

(2)本发明采用的畸形颖壳性状由单基因或寡基因控制，有利于降低育种难度，提高育种效率；

(3)本发明可与现有制种技术体系无缝衔接，有利于简化杂交种子和恢复系种子混收的制种技术体系。

附图说明

图1为隐性畸形颖壳突变体(bls1)穗及籽粒图。

图2为隐性畸形颖壳突变体(bls1)散粉图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明优选畸形颖壳水稻恢复系的选育及其在混收式水稻制种过程中的应用，该应用的具体方法为：首先通过杂交、回交或诱变、基因组编辑等遗传改良方法，选育出综合性状优良、具有由隐性基因控制的畸形颖壳恢复系，利用此恢复系与不育系广泛测交，选育出通过省级或国家审定的组合。制种时，将选育组合的恢复系、不育系种子混播或混插(抛)，利用人力、无人机或自然风力授粉，杂交种子成熟后和恢复系种子混收，在种子精选加工过程中去除具有畸形颖壳的恢复系种子，从而完成制种过程。

经上述应用后混收得到的杂交种子纯度一般在98％以上，可达我国规定的二级种子96％以上的基本要求。

实施例1恢复系的选育

通过杂交、回交或诱变、基因组编辑等遗传改良方法，选育出综合性状优良、具有由隐性基因控制的畸形颖壳优良恢复系。水稻中畸形颖壳资源比较丰富，本发明优选为单基因控制的隐性性状，有利于降低育种难度。如本发明优选的bls1三角颖突变体(xiaodingma等.beaklikespikelet1isrequiredforlateraldevelopmentoflemmaandpaleainrice.plantmolecularbiologyreporter,2013,31(1):98-108)，bls1突变体的特点是颖壳高度开裂、千粒重大幅降低(千粒重降至野生型的一半左右，约12g)，但花粉数量、活力以及散粉习性较好，对不育系的授粉能力较强。

以具有隐性畸形颖壳性状的水稻资源作亲本，与其它优良恢复系(如华占、扬稻6号等)、常规稻(如黄华占、五山丝苗等)或育种中间材料进行杂交、回交，利用常规育种方法可从杂交、回交后代中选育出综合性状优良但具有畸形颖壳的恢复系。

或者利用诱变方法，如物理诱变、化学诱变或物理化学诱变复合处理生产上大面积应用的优良恢复系(如华占、扬稻6号等)，从大群体中筛选具有隐性畸形颖壳性状的优良恢复系。这种方法的缺点是突变方向和频率不可控，只能依靠扩大群体来增加获得目标突变体的可能性；优点是一旦获得目标突变体，可快速在生产上推广应用。

也可利用基因组编辑的方法，选用优良恢复系(如华占、扬稻6号等)、常规稻(如黄华占、五山丝苗等)或育种中间材料，对本发明优选的三角颖基因bls1(loc_os02g56610)进行敲除。然后通过自交筛选或与野生型杂交、自交筛选去除转基因成分，从而育成不携带转基因成分，同时具有畸形颖壳性状的优良恢复系。该技术成熟高效，大部分从事生物技术研究的实验室均可顺利完成。而且，目前已经有生物技术公司提供此方面的商业服务，如武汉伯远生物科技有限公司等。

总之，本发明选育的恢复系除了具有隐性基因控制的畸形颖壳性状外，与目前杂交水稻育种上主流的恢复系选育方法并无其它差异。因此，对本领域内的技术人员来说，实施本发明时可操作性强，而且可根据实际情况选用切实可行的技术路线。

实施例2组合选育过程

首先利用实施例1选育的恢复系进行广泛测交、品比，筛选出比对照(不同生态区、不同熟期的对照不同，一般以当地同类型主栽品种为对照)在产量、米质、抗性上有改良、达到审定要求(每个省及生态区均有相关规定，并且不断修正)的新组合。然后，经过相应程序后，进入省级或国家级区域试验。经2～3年试验并达到相应标准后，通过省级或国家级审定。

需要说明的是，品种审定制度本身在不断的更新、完善。2014年，国家农作物品种审定委员会下发了《国家级水稻玉米品种审定绿色通道试验指南》，符合相关资质的种子企业可以自行开展自有品种区域试验、生产试验，进一步拓展了品种审定的渠道，更有利于满足市场需求。对本领域内的技术人员来说，这是众所周知和必须遵循的，本发明并没有例外和特殊之处。

总之，本发明的组合选育与目前主流的组合选育方法及程序并无差异。由于水稻是中国主要农作物之一，国家规定必须通过审定才能在生产上应用。因此，本步骤也是必不可少的，但对本领域内的技术人员来说，实施本步骤并无新的技术难题，故本实施例对此不再详细说明。

实施例3制种过程

以恢复系作为父本，不育系作为母本。

一、恢复系、不育系混播混收型

当恢复系、不育系播差期＜3天时，可通过水分调节、催芽控制等措施达到双亲花期理想相遇。水分调节主要是针对恢复系、不育系对缺水的敏感性存在差异进行。若恢复系早于不育系，可在1期至3期控水晒田，控制恢复系发育；若不育系早于恢复系，则在此1期至3期灌水，促进恢复系生长发育。一般可调节推迟或提早2～3d。催芽控制采取生育期短的亲本不催芽、生育期长的亲本催芽等措施，可以微调双亲在播始历期上存在的差异。如果恢复系、不育系抽穗扬花完美相遇，不需要进行花期调节，是最理想的。恢复系和不育系在育秧或直播时就可均匀混播，一方面可省工节本，另一方面可使恢复系在不育系群体中的分布更加均匀，有利于授粉提高结实率。栽培方面，接近普通水稻栽培。如果是通过育秧方式，利用机械插秧技术可降低成本；如采用直播方式，注意苗期草害的防治，勤晒田扎深根防倒伏。注意氮磷钾肥的配合使用，不要过多施用氮肥。根据恢复系、不育系特征特性和当地生态条件，有针对性防治病虫草害。恢复系、不育系抽穗扬花后，分1～3次喷施“920”。每天10:00-13:00赶粉2～4次，每次赶粉能观察到较为明显的“粉雾”。本类型较为理想，省工节本，尤其是采用直播-自然风力赶粉-机械混收分离模式，成本接近于普通水稻种植。

二、恢复系、不育系混插(抛)混收型

当10天＞恢复系、不育系播差期＞3天时，必须通过错期播种才能达到双亲花期理想相遇，但可以混插或混抛。恢复系、不育系错期育秧，选择合适的时机插秧或抛秧。人工插秧，较容易实现混插；机械插秧，需要对机械进行一定的改良，使机械能栽插20～30天的秧苗。另一方面，根据需要在插秧时放置合适比例(恢复系:不育系为1:1～24)的恢复系秧苗，使其在制种群体中比例适宜、分布均匀。混插(抛)可使恢复系在不育系群体中的分布均匀，有利于授粉提高结实率。栽培方面，注意氮磷钾肥的配合使用，不要过多施用氮肥。根据恢复系、不育系特征特性和当地生态条件，有针对性防治病虫草害。恢复系、不育系抽穗扬花后，分1～3次喷施“920”。每天10:00-13:00赶粉2～4次，每次赶粉能观察到较为明显的“粉雾”。

三、恢复系、不育系分插混收型

当恢复系、不育系播差期＞10天时，必须通过错期播种、分开栽插才能达到双亲花期理想相遇。恢复系、不育系分开栽插，接近常规杂交水稻制种技术。但考虑到本技术可实现混收分离，恢复系可均匀分布于制种田中。如常规制种技术中，恢复系在不育系厢面的两侧；利用本发明制种，可将恢复系移栽至母本厢面中间均匀分布。栽培方面，注意氮磷钾肥的配合使用，不要过多施用氮肥。根据恢复系、不育系特征特性和当地生态条件，有针对性防治病虫草害。恢复系、不育系抽穗扬花后，分1～3次喷施“920”，每天10:00-13:00赶粉2～4次，每次赶粉能观察到较为明显的“粉雾”。

由于本发明的恢复系种子颖壳畸形、裂颖，种子发育不良，发芽率、成苗率均不及普通种子。这一方面有利于防杂，即使有少量恢复系种子混杂在杂交种子中，发芽成苗率低；但另一方面，在制种时容易导致恢复系苗数不够。因此，要尽量使用新收获恢复系种子，同时加大用量2～3倍。为了防止烂种，播种时使用多菌灵等内吸性杀菌剂浸种。少浸多露，直播时田间不淹水，保持透气性良好，提高恢复系发芽率、成苗率。由于不育系的千粒重、发芽率在不同组合、不同年份间存在差异，因此，以制种田恢复系、不育系的穗数比例来研究是恰当的。研究表明，一般混播/混插/混抛的制种田穗数比例为优良恢复系:不育系＝1:4～1:30。本领域技术人员可根据恢复系、不育系的千粒重、发芽率及小面积试验结果选用最佳比例。

实施例3杂交种子的分离

待制种田不育系上所结杂交种子成熟后即可收获。种子收获后利用种子精选设备去除颖壳开裂、畸形的恢复系种子，如一次筛选后还有少量残余，可通过增加分选次数提高杂交种子纯度。

水稻种子精选设备主要根据其籽粒的形状和比重的原理，分为风筛选和比重选两种精选设备，一般加工过程中先经过风筛选设备去除杂质和空瘪粒，再经过比重选设备去除比重不一致的杂质。风筛选设备一般设置三层筛片，因恢复系种子颖壳开裂，籽粒发育不正常，形状较正常种子小，所以在经过筛片时正常种子可以在筛片上面振动精选下来，畸形恢复系种子就被筛片漏掉，然后作为杂质筛选出来。如果不能完全清选干净，再经过比重选设备。比重选设备主要根据种子的比重原理，通过振动将比重不一致的杂质选出。因恢复系种子颖壳开裂，籽粒发育不正常，比重明显小于正常种子，所以再经过比重选设备就可以完全将这部分畸形恢复系种子选出。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。