一种刺榆组培苗继代培养方法与流程

本发明属于植物培植领域，涉及一种植物组织培养的方法，具体涉及一种刺榆组培苗继代培养方法，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：刺榆为榆科刺榆属落叶小乔木，高可达10～15米，或呈灌木状；喜光，耐寒，耐干旱瘠薄，各种土质易于生长，可作固沙树种。适应性强，萌蘖能力强，生长速度较慢。木材淡褐色，坚硬而细致，可供制农具及器具用；树皮纤维可作人造棉、绳索、麻袋的原料；嫩叶可作饮料；因树枝有棘刺，生长颇速，常成灌木状，故也是作绿篱用的树种。种子可榨油。刺榆繁殖以种子繁殖为主，也可扦插和分株繁育。但是种子繁殖易发生性状变异，不利于保留母本优良性状；传统的无性繁殖方法又因繁殖系数低，成苗缓慢，不能提供大量苗木，限制了刺榆的推广。组织培养技术，选用优良单株作为外植体，保证了遗传性状的稳定，缩短其良种推广的周期,提升种苗质量,为市场上快速、大量提供刺榆优良苗木提供可能。中国发明专利申请cn105660292a公开了“一种刺榆之嫁接方法”；专利申请cn101940604a公开了“刺榆不同提取物的降血脂和抗氧化活性及在医药中的应用”；专利申请cn105724158a公开了“一种刺榆苗之种植方法”。综上所述，可见关于刺榆的研究较少，仅在提取物、种植方法和嫁接方法几个方面有少量研究，关于刺榆组培方面的研究几乎没有看到报道。因此，建立一种刺榆组培快繁方法，是目前对于刺榆研究急需解决的技术难题。本发明通过多次试验，摸索出了一种刺榆的继代培养方法，为市场上提供大量优质的刺榆苗木提供可能，也为刺榆组培的进一步研究提供理论借鉴。技术实现要素：本发明的目的在于，提供一种刺榆组培苗继代培养方法，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。本发明解决刺榆组培方面研究的空白，该培养方法所得组培苗，增殖系数高且稳定，可多次继代，周期短，操作过程简单，能有效降低人工成本，利于大规模的工厂化生产。本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：一种刺榆组培苗继代培养方法，其特征在于：包括刺榆外植体处理、无菌苗的获得和无菌苗的继代，具体操作步骤如下:(1)外植体处理：将采集来的外植体进行预处理，去掉枯叶、烂叶，剪掉破损、坏死的枝条，放到1‰的洗衣粉溶液中浸泡10min，在流水下用细软的毛刷刷掉枝条表面灰尘，放到清水中进行催芽培养，每天更换一次清水，5d左右，枝条开始萌动，抽出新枝；(2)无菌苗的获得：当新枝长度大于3cm时，距离新枝基部叶片0.2cm处将其剪下，距叶柄基部2-3mm处将叶柄、叶片剪掉，放到1％洗衣粉中浸泡5min，流水冲洗30-60min，然后在超净工作台上用75％酒精消毒20-30s，无菌水冲洗1-2次，再用0.02-0.1％升汞消毒6-16min，无菌水冲洗5-6次，滤纸吸干水分后，切成带一个或二个腋芽的茎尖或茎段接种到启动培养基中，每瓶接种2株，7-12d后腋芽开始萌动，形成小芽，将大于2cm的芽转接到培养基中继续培养；所述启动培养基成分为：dkw+6-ba0.05-2.0mg/l+椰汁10-200ml/l+白砂糖30g/l+琼脂5.8-6.0g/l，ph:5.9-6.0；(3)无菌苗的继代：将诱导获得的无菌苗在启动培养基上培养2-3代，增加无菌苗数量，挑选生长健壮、叶片浓绿的无菌苗，接种到增殖培养基进行继代扩繁；利用顶芽、茎段进行繁殖，其中顶芽高0.8～1.4cm、茎段高0.5～1.0cm，至少含一个腋芽，继代周期为26～30d，增殖系数可以达到7-8；所述增殖培养基成分为：改良dkw+6-ba0.01-1.0mg/l+kt0.01-1.0mg/l+椰汁10-200ml/l+白砂糖25-30g/l+琼脂5.8-6.0g/l，ph:5.9-6.0。作为本发明的一种限定，所述步骤(2)中以dkw为基础培养基，含有下列浓度的物质：0.05-2.0mg/l6-ba、10-200ml/l椰汁、30g/l白砂糖、5.8-6.0g/l琼脂，ph:5.9-6.0。作为本发明的一种限定，所述步骤(3)中改良dkw培养基含有成分为：cacl2·2h2o134-164mg/l；mgso4·7h2o666-814mg/l；kno31629-1991mg/l；(nh4)2so41050-1284mg/l；kh2po4239-292mg/l；na2·edta40.9-49.9mg/l；feso4·7h2o30.4-37.2mg/l；ca(no3)2·4h2o1771-2165mg/l；h3bo34.3-5.3mg/l；mnso4·4h2o30.2-36.9mg/l；zn(no3)2·6h2o15.3-18.7mg/l；na2mo·4h2o0.35-0.43mg/l；cuso4·5h2o0.23-0.28mg/l；肌醇90-110mg/l；烟酸0.9-1.1mg/l；盐酸硫胺素1.8-2.2mg/l；甘氨酸1.8-2.2mg/l。作为本发明的一种限定，所述步骤(3)中以改良dkw为基础培养基，含有下列浓度的物质：0.01-1.0mg/l6-ba、0.01-1.0mg/lkt、10-200ml/l椰汁、25-30g/l白砂糖、5.8-6.0g/l琼脂，ph:5.9-6.0。作为本发明的一种限定，所述培养均在植物组培室，采用日光灯照射，白天和黑夜交替培养，光照时间12-14h/d、光照强度2000-3000lx，温度26±2℃。作为本发明的一种限定，所述培养用的培养基均通过高压蒸汽灭菌锅灭菌，121℃灭菌15min。本发明的有益效果：由于采用了上述的技术方案，本发明所取得的技术进步在于：1.采用绿枝催芽的方法获得新生枝条，降低了启动培养的污染率，成活率可以达到75％以上。接种到含有椰汁的dkw培养基上，7-12d腋芽开始萌动，萌动率达到85％以上，提高了获取有效无菌苗的数量。2.采用本发明所提供的刺榆继代培养方法，控制继代周期26-30d，缩短了培养周期；增值系数可以达到7-8，并可以多代进行，降低了生产成本；通过改良dkw基本培养基，添加椰汁调节培养基营养成分，解决了刺榆组培过程中多次继代组培苗的黄化现象，为持续提供优质优良的刺榆种苗提供可能。3.本发明适用于刺榆组培苗的继代培养。附图说明图1为添加椰汁培养基中植株生长状态图。图2为不同浓度椰汁培养基中植株生长状态图。具体实施方式以下结合具体实施例，对本发明作进步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。图1为添加椰汁培养基中植株生长状态图。图2为不同浓度椰汁培养基中植株生长状态图。实施例1一种刺榆继代培养方法，它按照以下步骤顺序进行：(1)外植体处理：将采集来的外植体进行预处理，去掉枯叶、烂叶，剪掉破损、坏死的枝条，放到1‰的洗衣粉溶液中浸泡10min，在流水下用细软的毛刷刷掉枝条表面灰尘，放到清水中进行催芽培养，每天更换一次清水，5d左右，枝条开始萌动，抽出新枝。(2)无菌苗的获得：当新枝长度大于3cm时，距离新枝基部叶片0.2cm处将其剪下，距叶柄基部2-3mm处将叶柄、叶片剪掉，放到1％洗衣粉中浸泡5min，流水冲洗30-60min，然后在超净工作台上用75％酒精消毒20-30s，无菌水冲洗1-2次，再用0.02-0.1％升汞消毒6-16min，无菌水冲洗5-6次，滤纸吸干水分后，切成带一个或二个腋芽的茎尖或茎段接种到启动培养基中，每瓶接种2株，7-12d后腋芽开始萌动，形成小芽，将大于2cm的芽转接到培养基中继续培养。所述启动培养基成分为：dkw+6-ba0.05-2.0mg/l+椰汁10-200ml/l+白砂糖30g/l+琼脂5.8-6.0g/l，ph:5.9-6.0。启动培养基配制好后用蒸汽高压灭菌锅灭菌，121℃灭菌15min。培养光照时间12-14h/d、光照强度2000-3000lx，温度26±2℃。启动培养20d，成活率75％，萌发率85％。(3)无菌苗的继代：将诱导获得的无菌苗在启动培养基上培养2-3代，增加无菌苗数量，挑选生长健壮、叶片浓绿的无菌苗，接种到增殖培养基进行继代扩繁。利用顶芽、茎段进行繁殖，其中顶芽高0.8～1.4cm、茎段高0.5～1.0cm，至少含一个腋芽，继代周期为26～30d，增殖系数可以达到7-8。所述增殖培养基成分为：改良dkw+6-ba0.01-1.0mg/l+kt0.01-1.0mg/l+椰汁10-200ml/l+白砂糖25-30g/l+琼脂5.8-6.0g/l，ph:5.9-6.0。培养基配制好后用蒸汽高压灭菌锅灭菌，121℃灭菌15min。培养光照时间12-14h/d、光照强度2000-3000lx，温度26±2℃。实施例2继代培养基本培养基的优化。为了解决刺榆继代培养过程中组培苗的黄化问题，对继代培养的基本培养基进行改良优化，改良dkw母液的具体成分如下：cacl2·2h2o134-164mg/l；mgso4·7h2o666-814mg/l；kno31629-1991mg/l；(nh4)2so41050-1284mg/l；kh2po4239-292mg/l；na2·edta40.9-49.9mg/l；feso4·7h2o30.4-37.2mg/l；ca(no3)2·4h2o1771-2165mg/l；h3bo34.3-5.3mg/l；mnso4·4h2o30.2-36.9mg/l；zn(no3)2·6h2o15.3-18.7mg/l；na2mo·4h2o0.35-0.43mg/l；cuso4·5h2o0.23-0.28mg/l；肌醇90-110mg/l；烟酸0.9-1.1mg/l；盐酸硫胺素1.8-2.2mg/l；甘氨酸1.8-2.2mg/l。除了继代基本培养基替换成改良dkw母液外，其他步骤方法同实施例1，使用改良dkw为基本培养基，增殖系数达到7-10，且植株生长健壮，叶色、叶形正常，多次继代后植株叶片黄叶现象明显减少。实施例3继代培养基的筛选。以改良dkw为基本培养基，筛选不同浓度6-ba、kt、iba对刺榆继代培养的影响。每个处理接种14瓶，每瓶接种10株，重复3次。试验方案如表1，除了添加激素与实例1不同外，其余方法步骤均与实施例1相同。表1不同浓度6-ba、kt、iba对刺榆继代培养的影响试验号ba(mg/l)kt(mg/l)iba(mg/l)增殖系数生长状态10.010.014.2植株分枝较少，植株矮小，部分叶片畸形20.10.016.8植株分枝较多，植株生长正常31.00.019.6植株分枝多，有玻璃化和叶片畸形40.10.58.6植株分枝较多，植株生长正常50.11.08.5植株分枝较多，生长正常，部分玻璃化60.10.014.8植株分枝较少，植株矮小，部分叶片畸形70.10.055.2植株分枝较少，植株矮小，部分叶片畸形由表1可知，不同浓度6-ba、kt、iba对刺榆继代培养的影响不同，影响效果大小分别为6-ba＞kt＞iba，刺榆的增殖系数随着ba浓度的增加而增加，但当浓度过高时，植株易出现玻璃化现象；kt不同浓度间对刺榆的继代培养影响较小，可根据实际生产需要自行调节；iba对刺榆继代培养影响较小。实施例4继代培养基的优化。为了解决刺榆继代培养过程中组培苗的黄化问题，在改良继代培养基本培养基dkw的基础上，又通过添加外源物质酸水解酪蛋白、香蕉、马铃薯、椰汁、活性炭和agno3等对继代培养基进一步优化。每个处理接种14瓶，每瓶接种10株，重复3次。试验方案如表2，除了添加外源与实例1不同外，其余方法步骤均与实施例1相同。表2外源添加物质对刺榆组培苗黄化的影响试验号外源物质增殖系数生长状态1酸水解酪蛋白3.2植株叶片黄绿色，少量黄化、脱落2香蕉1.8植株叶片黄化、脱落、死亡现象严重3马铃薯0.8植株叶片黄化、脱落、死亡现象严重4椰汁8.2植株叶片鲜绿色、无畸形，生长健壮5活性炭1.2植株叶片黄化、脱落、死亡现象严重6agno31.5植株叶片黄化、脱落、死亡现象严重由表2可知，添加椰汁的培养基上刺榆植株叶片鲜绿色、无畸形，生长健壮，且增殖系数高，为8.2；其次是添加酸水解酪蛋白，可以减轻刺榆植株叶片的黄化现象，但是效果没有添加椰汁好，增殖系数也不高，为3.2；而添加香蕉、马铃薯、活性炭和agno3并不能改善刺榆组培苗的黄化现象，叶片黄化、脱落、死亡现象严重，植株基本无分枝。所以可以通过在刺榆继代培养基中添加椰汁使刺榆植株正常生长。以上对本发明的具体实施方式进行了说明，但本发明并不以此为限，只要不脱离本发明的宗旨，本发明还可以有各种变化。当前第1页12