道地丹参杂交一代优势利用及其制种方法与流程

本发明涉及药用植物杂交优势利用方法，特别是一种道地丹参杂交一代优势利用及其制种方法。
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：丹参（salviamiltiorrhizabunge）是我国传统医药中应用最早、最广泛的中药之一,是著名的活血祛瘀药,在临床上被广泛用于治疗冠心病、心绞痛、缺血性中风等疾病。随着我国人口老龄化，心血管疾病成为危害人类健康的主要疾病，发病率遂年上升，对药物需求量增大。尤其是目前我国提倡的中药大健康产业的发展，对传统中药需求量巨大。然而，我国至今还没有一个人工培育的道地丹参新品种。各地栽培的丹参都是由野生直接变栽培，没有人工选择，产量低。丹参为常异花授粉植物，它的种子是杂合性的，用种子繁殖造成后代分离，不稳定，必然造成产药材产量下降，药物成分不稳定。用种根繁殖5年以上表现出明显的退化现象。因此，我国中药品质不断下降，严重影响了我国中医的应用，有人疾呼“中医亡于中药”，这己是不争的事实。如何改变这种现状，其中之一就是从源头抓起，用现代化科学技术手段培育道地药材新品种。至今，我国中药植物遗传育种学还处于基本空白状态，中药界大部分工作还停留在行政管理和商业操作范筹，缺乏用现代科学技术，特别是中药基因组学技术对我国中药种质资源进行遗传学改良与新品种培育研究。中国专利cn201410013083.8公开了一种道地丹参的培育方法，它是利用中药道地功能基因组及其特征基因，依据道地中药本身固有的基因，培育对生物及非生物胁迫能力强的绿色超级道地中药的有效方法。提供了一种挖掘和利用我国道地中药功能基因组的重要途径，对我国中药新品种培育和可持续发展具有重要意义和应用价值。技术实现要素：本发明的目的是提供一种道地丹参杂交一代优势利用及其制种方法。它是在道地丹参的培育方法的基础上,以紫色基因为标记的道地丹参杂交一代优势利用及其杂交制种方法，为大面积推广应用而建立的制种方法。这样生产的三倍体道地丹参种苗用于大田生产，三倍体道地丹参可达100％，丹参药材产量和药物有效成分含量可以获得大幅度提高。本发明提供的一种道地丹参杂交一代优势利用及其制种方法是在完成具有白花隐性基因二倍体白花丹参人工诱变成四倍体后，在田间以四倍体白花丹参为母本♀与二倍体紫花丹参为父本♂按1：1或1;2种植，以蜂媒、风媒和人工辅助授粉，只收获四倍体白花丹参植株上的种子，以据茎、叶、叶柄紫色标记，在幼苗期去除不带紫色标记的幼苗（四倍体）。本发明提供一种三倍体道地丹参杂交一代优势利用及其杂交制种方法，详细包括以下步骤：1）收集全国不同地理居群野生和栽培丹参，建立具有代表性的丹参种质资源圃。2）从形态学、细胞生物学染色体水平、分子生物学水平对我国丹参种质资源进行研究，从基因组染色体结构对道地丹参进行鉴定。3）利用aflp分子标记技术确定道地丹参dna条形码。4）将具有白花隐性标记性状的二倍体（2x）丹参人工诱变成同源四倍体（4x）丹参。5）在田间将四倍体白花丹参与二倍体紫花道地丹参按1：1或1;2种植,通过蜂媒、凤媒和人工授粉获得三倍体丹参种子。6）只收获四倍体白花丹参上结的种子,经鉴定70-80％为三倍体丹参,20-30％为四倍体丹参。7）种子幼苗茎、叶、叶柄微带紫色者均为三倍体道地丹参,不带紫色幼苗为四倍体,两者差别显著,以此在苗期鉴别,人工去除不带紫色的幼苗（四倍体）,三倍体丹参种苗纯度可达到100％。8）将三倍体丹参杂交一代f1种子,用于大田生产，按常规管理方法进行管理。按本发明的上述步骤可以年年进行三倍体道地丹参杂交制种，如果有制种条件的地方，也可和粮食作物一样每年只种三倍体丹参杂交一代f1种子,用于大田生产，可使药材产量和药物有效成分含量得到大幅度提高，在中药材生产上实现了上世纪七十年代第二次绿色革命提出的杂交优势利用问题。三倍体道地丹参杂交一代f1种子直接用于大田生产，药材产量和药物有效成分含量得到了大幅度提高。小面积试验丹参药材产量增产320％，丹参酮ⅱa隐丹参酮，丹酚酸都超过【药典】规定的水平。总之，本发明提供一种三倍体道地丹参杂交一代优势利用及其杂交制种方法的突出特点：①首次提出应用中药植物杂交一代优势利用来提高药材产量和药物含量；②首次建立了以紫花基因为标记的道地丹参杂交一代制法；③首次将道地丹参杂交一代种子用于大田生产上，可大幅度提高丹参药材产量和药物有效成分含量。附图说明图1：中国丹参种质资源圃。图2：丹参基因组染色体结构：二倍体2n=2x=16,三倍体2n=3x=24,四倍体2n=4x=32。图3：道地丹参dna—aflp分子标记三联密码。图4：道地丹参田间杂交制种种植图,四倍体♀与二倍体♂按1∶1种植。图5：以紫色基因为标记性状的三倍体与四倍体丹参苗期鉴别：带紫色的苗为3x,不带紫色的苗为4x。图6；道地丹参杂交一代大田种植生长势(a,b,c)。图7；三倍体道地丹参杂交一代根部药材。图8；三倍体道地丹参杂交一代根部药材丹参酮iia和丹酚酸b含量测定结果。具体实施方式：本发明可从下述实施例中得以体现，但它不会对本发明作任何限制。实施例中未注明具体实验方法和栽培工艺条件，通常按照道地丹参种植的常规条件以及手册中所述的条件，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可由商业途径获得。本发明提供道地丹参杂交一代优势利用及其制种法包括以下步骤：⑴建立中国丹参种质资源圃，收集全国野生和栽培丹参种质资源，在天津蓟县山区建立丹参种质资源圃,见图1。表1：中国丹参种质资源圃名录。表1.中国丹参种质资源的来源2004年9月编号采集地点编号采集地点1陕西省运城(中条山1号)19浙江省嵊洲c2山西省运城、半栽培20上海市崇明岛a3山西省运城栽培21上海市崇明岛b4陕西省洛南野生22江苏射陽a5陕西省洛南栽培23江苏射阳b6陕西省商洛24江苏射陽c7陕西省天士力25江苏射陽d8陕西省山阳26江苏射阳e9河南省内乡a27江苏射阳f10河南省内乡b28安徽省亳州11河南省方城29湖北蓟春12河北省迁西30湖北隨州13山东省西营31四川省中江14山东省烟台a32四川省金堂15山东省烟台b33山东省萊芜（白花）16浙江省嵊洲a34本地野生丹参17浙江省王坛35河北省安国18浙江省嵊洲b36河北省行唐⑵从形态学、细胞生物学、分子生物学、药物化学层面对中国丹参种质资源进行研究，评选出全国12个不同地区道地丹参种质资源。⑶对评选出的道地丹参基因组染色体结构进行鉴定,图2。⑷利用aflp分子标记技术（具体方法见王冰等：中国不同地理居群丹参遗传多样性分析,中国中药杂志32（19）2007，10）确定道地丹参dna条形密码。⑸将具有白花隐性标记性状的山东莱抚产二倍体白花丹参人工诱变成同源四倍体（具体参考陈力等提供的方法：白花丹参同源四倍体的诱导与鉴定，中草药杂志,40（12）33-36,2009/12/1。⑹选配道地丹参杂交一代强式组合，在田间按4x♀×2x♂1;1或1;2模式种植,例如申请者2007年用四倍体白花丹参m0代17个株系,分别与不同地区二倍体道丹参进行了杂交,选配了55个亲本杂交组合,获得了124个三倍体丹参株系。具体做法如图4所示,四倍体白花丹参一行,二倍体道地紫花丹参一行,进行正常田间种植。⑺靠蜂媒、风媒、人工辅助授粉。丹参为常异花授粉植物,自然杂交结实率为75％,自交结实率为46.16％,主要靠蜜蜂和风力授粉,为提高杂交结实率可增加人工辅助授粉。⑻秋后只收获四倍体白花丹参上结的种子,经鉴定约有2/3为三倍体,1/3为四倍体。⑼通过苗期鉴别,带紫色的幼苗（茎、叶、叶柄）均为三倍体,不带紫色幼苗为四倍体,应以去除,三倍体可达到100％,图5。⑽按上述方法生产的三倍体丹参杂交一代f1种子,直接用于大田生产，按常规管理方法进行管理。按上述方法生产的道地丹参杂交一代f1种苗,按常规进行大田生产,可充分显示出丹参杂一代优势和多倍体优势，如下表2所示：表2:三倍体丹参f1根部药材产量（平均数）（2007年11月20日）测定种质测定株数平均单株产量（克/株）比二倍体对照增加（%）二倍体对照（ck）4162.75四倍体78318.20+195.51三倍体124531.66+326.67药材产量和药物有效成分合量可获得显著提高图6，图7。⑾按【中华人民共和国药典】规定,采用高效液相色谱法测定其含量，丹参酮ⅱa不得少于0.2％，丹酚酸b不得少于3％,我们共检测了41份样品,其中28份样品丹参酮ⅱa超过药典规定的水平,占68.2％,7份样品超过0.3-0.4％,占17％,丹酚酸b的含量全部超过3％的规定,其中超过6％以上的有28份,占68.29％,这表明按本方法培育的三倍体道地丹参根部药材产量与药物成分含量之间不存在负相关关系,即主要药物成分含量并没有因为三倍体丹参药材产量提高而降低。丹参酮ⅱa、隐丹参、丹酚酸进行了测定,结果见图8。当前第1页12