本发明涉及一种植物组织培养的防褐化方法，具体涉及一种月季组培苗防褐化的方法。
背景技术：
月季是我国十大传统名花之一，被誉为花中皇后，又称月月红。月季在园林绿化中有着不可替代的价值，其四季均可观赏，花期长，观赏价值高，在南北园林应用中十分广泛。月季的繁殖方法有传统的扦插和嫁接，但因受限于繁殖材料难以大量快速的繁殖，后期发展的组织培养可以在短期内繁育大量的优良苗木，成为了月季育种中最为有效的快速繁殖手段之一。对于木本植物组织培养而言，褐化是影响组培成功的关键难题。褐化是由于外植体在切口释放出的酚类物质氧化后使培养基变褐，随之外植体也会变褐，进而导致其死亡。
本发明针对月季组培苗褐化严重的问题，提出一种预防月季褐化的组织培养方法，本发明通过控制月季取材，诱导、增殖、生根培养基的成分、激素配比、ph以及外植体的前处理等能够有效防止酚类物质氧化，从而实现防止月季褐化现象的发生，极大提高月季快速繁殖效率。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种防止月季组培苗褐化的方法，极大提高月季快速繁殖效率。
本发明采用的技术方案为：
一种防止月季组培苗褐化的方法，包括如下步骤：
1)、取材：选取处于旺盛生长状态的半木质化月季带芽茎段；去除茎尖及上部幼嫩茎段后切成2-3cm单芽茎段；
2)、消毒：
3)、接种前预处理：将接种前的已消毒的外植体用已过滤消毒的聚乙烯吡咯烷酮水溶液(浓度为2-3g/l)浸泡10分钟左右进行预处理；
4)、接种、诱导培养：将预处理后的月季茎段摊铺在已消毒的滤纸上晾干后接种于诱导培养基中，直至不定芽长至3-4cm，待增殖培养，诱导培养条件为22℃/白天，20℃/黑夜，12h/白天，12h/黑夜，光照强度为3000-4000lux；
5)、增殖培养：将诱导生成的不定芽切下，在增殖培养基中进行培养，15-20天继代一次，增殖培养条件为22℃/白天，20℃/黑夜，12h/白天，12h/黑夜，光照强度为3000-4000lux；
6)、生根培养：将增殖培养的组培苗切成单株接种于生根培养基，于20℃/白天，18℃/黑夜，16h/白天，8h/黑夜，光照强度为4000-5000lux条件下培养。
优选地，所述的步骤2)消毒步骤为：用流动自来水冲洗1-2h，75％酒精浸泡30s后用已灭菌的蒸馏水冲洗3-5次，再用5％naclo处理15min后用已灭菌蒸馏水冲洗3-5次，消毒期间不断摇晃使其消毒充分，切除已消毒茎段首尾置于已灭菌的滤纸晾干后待接种。
优选地，诱导培养基中添加的激素及其含量分别为：6-ba0.5-1mg/l、naa0.01-0.1mg/l，增殖培养基中添加的激素及其含量分别为：6-ba0.5-1mg/l、naa0.01-0.1mg/l、ga30.01mg/l，生根培养基中添加的激素及其含量分别为：naa0.2-0.4mg/l、iba0.1-0.2mg/l。
优选地，诱导培养基、增殖培养基、生根培养基中琼脂用量为7.5-8g/l。
优选地，诱导培养基、增殖培养基、生根培养基的ph值调节为5.5-5.8。
优选地，在增殖培养基、生根培养基中添加活性炭，活性炭用量0.5-1g/l。
优选地，诱导培养基的配方为：ms+30g/l蔗糖+7.5-8g/l琼脂+0.5-1mg/l6-苄氨基嘌呤+0.01-0.1mg/l萘乙酸，ph5.5-5.8。增殖培养基的配方为：ms+30g/l蔗糖+7.5-8g/l琼脂+0.5-1mg/l6-苄氨基嘌呤+0.01-0.1mg/l萘乙酸+0.01mg/l赤霉素+0.5-1g/l活性炭，ph5.5-5.8。生根培养基的配方为:1/2ms+25g/l蔗糖+7.5-8g/l琼脂+0.2-0.4mg/l萘乙酸+0.1-0.2mg/l吲哚丁酸+0.5-1g/l活性炭，ph5.5-5.8。
本发明所具有的有益效果:
本发明优化了月季组织培养各个阶段的操作方法，有效降低褐化率到10％以下，解决了月季组培褐化率高的难题。具体地：
本发明采用了聚乙烯吡咯烷酮和活性炭两种吸附剂，采用聚乙烯吡咯烷酮浸泡作为外植体的前处理方法，培养基中添加活性炭来吸附外植体释放的酚类物质以及氧化后形成的醌类物质，从而达到预防褐化的效果。
本发明进一步优选了月季组织培养各个阶段的培养基配方，有效降低了月季组培过程中的褐化问题。
培养基的硬度会影响酚类物质的扩散，适当增加琼脂用量会降低褐化率，本发明优选琼脂用量为7.5-8g/l。
培养基的低ph具有降低多酚氧化酶活性的作用，能够抑制褐化；本发明培养基的ph值调节为5.5-5.8。
月季外植体伤口处积累的酚类物质长时间会引起褐化，通过缩短继代周期，可以减轻月季组培苗的褐化现象。本发明将继代培养时间缩短到20天以内。
温度直接影响植物体内酶活性，在保证植物正常生长的前提下适当降低温度可以降低相关酶活性，从而抑制酚类物质的合成，进而减轻褐化现象的发生。本发明将月季增殖培养置于22℃/白天，20℃/黑夜条件下培养；生根培养置于20℃/白天，18℃/黑夜条件下培养。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但不限定本发明的保护范围。
一种防止月季组培苗褐化的方法，包括如下步骤：
选取北方地区春末季节半木质化的月季带芽茎段，去除茎尖及上部幼嫩茎段后切成2-3cm单芽茎段，流动自来水冲洗1h，75％酒精处理30s后用已灭菌的蒸馏水冲洗3次，5％naclo处理15min后用已灭菌蒸馏水冲洗3次对外植体进行消毒，消毒期间不断摇晃使其消毒充分，切除已消毒茎段首尾置于已灭菌的滤纸晾干后待接种。
用孔径为0.22μm过滤膜过滤2g/l聚乙烯吡咯烷酮水溶液，将待接种的月季茎段浸泡于上述已灭菌的聚乙烯吡咯烷酮中10min，摊铺在已消毒的滤纸上晾干后接种于诱导培养基中(ms+30g/l蔗糖+7.5g/l琼脂+0.5mg/l6-苄氨基嘌呤+0.01mg/l萘乙酸，ph5.8)，诱导培养条件为22℃/白天，20℃/黑夜，12h/白天，12h/黑夜，光照强度为3300lux。
待经诱导培养的不定芽长至4-5cm时，将诱导生成的不定芽切下，在增殖培养基(ms+30g/l蔗糖+7.5g/l琼脂+0.5mg/l6-苄氨基嘌呤+0.01mg/l萘乙酸+0.01mg/l赤霉素+0.5g/l活性炭，ph5.6)中进行培养，15天继代一次，增殖培养条件为22℃/白天，20℃/黑夜，12h/白天，12h/黑夜，光照强度为3300lux。
待月季组培苗培养至5-6cm后，切成单芽置于生根培养基(1/2ms+25g/l蔗糖+7.5g/l琼脂+0.2mg/l萘乙酸+0.1mg/l吲哚丁酸+0.5g/l活性炭，ph5.6)中，于20℃/白天，18℃/黑夜，16h/白天，8h/黑夜，光照强度4500lux条件下培养。
本方法有效解决了月季组织培养褐化率高的问题，改善月季组培苗各生长阶段的关键步骤，有效地将月季组培苗褐化率降到10％以下，对月季产业化生产有重要意义。