一种蜡梅植株高效离体再生的方法与流程

本发明涉及蜡梅植株快速繁殖领域，尤其涉及一种蜡梅植株高效离体再生的方法。

背景技术：

蜡梅(chimonanthuspraecox(linn.)link)又名腊梅、寒梅、腊木，是蜡梅科蜡梅属的落叶丛生灌木，是一种集观赏、环保及药用价值于一身的多功能树种。蜡梅花开于寒冬时候，花黄如蜡，清香四溢,花期较长，具有色、香、形、姿的观赏价值，是我国特有的珍贵花木，也是世界著名的园林观赏树种；同时，蜡梅还是自然瓶插寿命可超过三周的珍贵的冬季和早春切花种类。蜡梅花香怡人，所提取香精的成分比玫瑰油、茉莉花香精成分更加丰富，在国际市场上蜡梅芳香油的价格大大高于玫瑰油和茉莉芳香油。同时，蜡梅根系发达,适应性强且能抗多种有害气体，是一种理想的环保植物；此外，蜡梅的根、茎、叶、花蕾、果均可人药，具有广泛的药用前景。近年来，随着蜡梅综合利用价值的提高，蜡梅的需求量也在不断加大；蜡梅良种选育及其配套的苗木高效快繁技术及栽培技术已成为蜡梅产业发展的技术瓶颈及亟待解决的技术问题。

目前，在生产上，蜡梅的繁育主要采用嫁接、分株和播种等传统方法，但这些常规繁殖技术要求严格，繁殖系数较低，且受季节的限制，远不能满足市场对蜡梅种苗的需求及蜡梅产业的快速发展。由于利用植物组织培养技术可在短时期内获得大量的无菌苗，在实现蜡梅种质资源规模化繁育的同时，使得加速蜡梅品种的改良进程成为可能。目前，有关利用组织培养技术对蜡梅进行繁育的研究较少，其中以蜡梅野外茎段和子叶为外植体进行离体再生的研究已有报道，但尚处于初级研究阶段，普遍存在繁育周期长、繁殖系数低、可重复性差和褐化严重等问题，严重限制了植物组培技术在蜡梅繁育中的应用。

针对上述蜡梅繁育过程中所存在的诸多问题，同时为了满足规模化种植和品种改良对蜡梅种苗的需求，急需开发一种蜡梅植株高效离体再生的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种繁育周期短、繁殖系数高、重复性好的蜡梅植株高效离体再生的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种蜡梅植株高效离体再生的方法，包括如下步骤：

(1)取成熟蜡梅种子剪去外壳，经表面消毒后接种于种子萌发培养基中进行快速萌发，经过7-10d的光照培养，获得健壮的蜡梅种子实生苗；

(2)在无菌条件下，以蜡梅种子实生苗的茎段为外植体，接种于添加有不同种类和浓度植物生长调节剂的培养基中依次进行茎段腋芽的萌发诱导、增殖、伸长和生根培养；

(3)待无菌苗长至3-5cm，且伴有健壮根系和2-4个完整叶片时，进行驯化和移栽，最终获得健壮的蜡梅再生植株。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中表面消毒是指将剥去种壳的无损种子于无菌操作台中用无菌水冲洗3-5遍后，用70-75％的无水乙醇消毒15-45s，之后再用18-22％的过氧化氢溶液消毒2-10min，超声处理4-10min，最后用无菌水冲洗4-6遍，消毒期间不停的摇动。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中种子萌发培养基具体为添加有0.02-0.1mg/lga3、25-35g/l蔗糖和6.5-7.5g/l琼脂的1/2dkw培养基。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中茎段取材于苗龄为15-40d后的蜡梅种子实生苗。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中茎段的长度0.5-1.0cm且带有腋芽。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中添加有不同种类和浓度植物生长调节剂的培养基分别为用于茎段腋芽萌发诱导的诱导培养基、用于茎段腋芽增殖和伸长的增殖和伸长培养基及用于不定芽生根的生根培养基。

作为本发明的优选方式之一，所述诱导培养基具体为添加有0.05-0.2mg/lga3、0.2-2.0mg/lkt、5-20mg/lvc、25-35g/l蔗糖和6.5-7.5g/l琼脂的dkw培养基。

作为本发明的优选方式之一，所述增殖和伸长培养基具体为添加有0.5-3.0mg/lkt、0.05-0.5mg/ltdz、0.1-1.0mg/liba、5-20mg/lvc、25-35g/l蔗糖和6.5-7.5g/l琼脂的dkw培养基。

作为本发明的优选方式之一，所述生根培养基具体为添加有0.05-1.0mg/l亚精胺、0.1-2.0mg/liaa、5-20mg/lvc、10-20g/l蔗糖和6.0-7.0g/l琼脂的1/2dkw培养基。

本发明相比现有技术的优点在于：其一，取材方便、材料丰富；其二，再生效率高，腋芽再生率高达95.8％，平均每个外植体可产生6.2个不定芽，生根率高达94.2％；其三，再生速度快，繁殖系数高，且能实现对所获得的无菌苗茎段进行进一步的扩大繁殖，为蜡梅种苗的规模化繁育和后期的品种改良提供了重要的技术支持。因此，本发明所提供的一种蜡梅植株高效离体再生的方法，不仅为蜡梅植株的快速繁殖和规模化生产提供了技术支撑，同时也为后期蜡梅的品种培育和遗传改良奠定了基础。

附图说明

图1是实施例2中的一种蜡梅植株高效离体再生的方法的腊梅无菌苗茎段接种初期图；

图2是实施例2中的一种蜡梅植株高效离体再生的方法的蜡梅茎段腋芽萌发图；

图3是实施例2中的一种蜡梅植株高效离体再生的方法的茎段腋芽增殖与伸长图；

图4是实施例2中的一种蜡梅植株高效离体再生的方法的蜡梅茎段不定芽生根图；

图5是实施例2中的一种蜡梅植株高效离体再生的方法的蜡梅无菌苗植株的移栽图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本实施例的一种蜡梅植株高效离体再生的方法，包括如下步骤：

(1)蜡梅种子的表面消毒：

取成熟蜡梅种子剪去外壳，将剥去种壳的无损种子于无菌操作台中用无菌水冲洗3遍后，用70％的无水乙醇消毒15s，之后再用18％的过氧化氢溶液消毒2min，超声处理4min，最后用无菌水冲洗4遍，消毒期间不停的摇动；

(2)蜡梅种子的萌发培养：

将步骤(1)中消毒后的种子，接种于添加有0.02mg/lga3、25g/l蔗糖和6.5g/l琼脂的1/2dkw培养基，于温度为25±2℃，光照条件为2000lx的恒温培养室进行萌发培养，培养7d后，获得萌发的种子实生苗，平均种子萌发率为75.6％；

(3)外植体的选择：

以步骤(2)中苗龄为15d的蜡梅种子实生苗为外植体材料来源，选取长度为0.5cm且带有腋芽的茎段为外植体；

(4)茎段腋芽的萌发诱导：

将步骤(3)中带腋芽的茎段接种于添加有0.05mg/lga3、0.2mg/lkt、5mg/lvc、25g/l蔗糖和6.5g/l琼脂的dkw培养基中进行腋芽的萌发诱导培养，光照培养14d，腋芽的萌发效率高达87.4％；

(5)腋芽的增殖和伸长培养：

将步骤(4)中腋芽萌发后的茎段转接于添加有0.5mg/lkt、0.05mg/ltdz、0.1mg/liba、5mg/lvc、25g/l蔗糖和6.5g/l琼脂的dkw培养基中进行腋芽的增殖和伸长培养，光照培养28d后，平均每个外植体产生3.2个不定芽，且不定芽的平均长度为2.8cm；

(6)不定芽的生根培养：

将步骤(5)中增殖和伸长后的不定芽转接于添加有0.05mg/l亚精胺、0.1mg/liaa、5mg/lvc、10g/l蔗糖和6.0g/l琼脂的1/2dkw培养基中进行不定芽的生根培养，光照培养25d后，不定芽的生根率达到83.6％，且平均每个外植体伴有2-3条细长的、平均长度为5.1cm的不定根；

(7)无菌苗的移栽：

待无菌苗长至3cm，将带有2个完整叶片和健壮根系的蜡梅无菌苗经过开盖驯化后，转入混合营养基质(土：蛭石：珍珠岩＝1:1:1)中进行移栽，1个月后，无菌苗的成活率高达92.7％。

实施例2

本实施例的一种蜡梅植株高效离体再生的方法，包括如下步骤：

(1)蜡梅种子的表面消毒：

取成熟蜡梅种子剪去外壳，将剥去种壳的无损种子于无菌操作台中用无菌水冲洗4遍后，用75％的无水乙醇消毒30s，之后再用20％的过氧化氢溶液消毒5min，超声处理6min，最后用无菌水冲洗5遍，消毒期间不停的摇动；

(2)蜡梅种子的萌发培养：

将步骤(1)中消毒后的种子，接种于添加有0.05mg/lga3、30g/l蔗糖和7.0g/l琼脂的1/2dkw培养基，于温度为25±2℃，光照条件为2200lx的恒温培养室进行萌发培养，培养8d后，获得萌发的种子实生苗，平均种子萌发率为98.5％；

(3)外植体的选择：

以步骤(2)中苗龄为30d的蜡梅种子实生苗为外植体材料来源，选取长度为0.7cm且带有腋芽的茎段为外植体；

(4)茎段腋芽的萌发诱导：

将步骤(3)中带腋芽的茎段(图1)接种于添加有0.1mg/lga3、1.0mg/lkt、12.5mg/lvc、30g/l蔗糖和7.0g/l琼脂的dkw培养基中进行腋芽的萌发诱导培养，光照培养14d，腋芽的萌发效率高达95.8％；

(5)腋芽的增殖和伸长培养：

将步骤(4)中腋芽萌发后的茎段(图2)转接于添加有2.0mg/lkt、0.1mg/ltdz、1.0mg/liba、12.5mg/lvc、30g/l蔗糖和7.0g/l琼脂的dkw培养基中进行腋芽的增殖和伸长培养，光照培养21d后，平均每个外植体产生6.2个不定芽，且不定芽的平均长度为3.4cm(图3)；

(6)不定芽的生根培养：

将步骤(5)中增殖和伸长后的不定芽转接于添加有0.5mg/l亚精胺、1.0mg/liaa、12.5mg/lvc、15g/l蔗糖和6.5g/l琼脂的1/2dkw培养基中进行不定芽的生根培养，光照培养25d后，不定芽的生根率达到94.2％，且平均每个外植体伴有6.7条粗壮的、平均长度为4.5cm的不定根(图4)；

(7)无菌苗的移栽：

待无菌苗长至4cm，将带有3个完整叶片和健壮根系的蜡梅无菌苗经过开盖驯化后，转入混合营养基质(土：蛭石：珍珠岩＝1:1:1)中进行移栽(图5)，1个月后，无菌苗的成活率高达96％。

实施例3

本实施例的一种蜡梅植株高效离体再生的方法，包括如下步骤：

(1)蜡梅种子的表面消毒：

取成熟蜡梅种子剪去外壳，将剥去种壳的无损种子于无菌操作台中用无菌水冲洗5遍后，用75％的无水乙醇消毒45s，之后再用22％的过氧化氢溶液消毒10min，超声处理10min，最后用无菌水冲洗6遍，消毒期间不停的摇动；

(2)蜡梅种子的萌发培养：

将步骤(1)中消毒后的种子，接种于添加有0.1mg/lga3、35g/l蔗糖和7.5g/l琼脂的1/2dkw培养基，于温度为25±2℃，光照条件为2500lx的恒温培养室进行萌发培养，培养10d后，获得萌发的种子实生苗，平均种子萌发率为79.8％；

(3)外植体的选择：

以步骤(2)中苗龄为40d的蜡梅种子实生苗为外植体材料来源，选取长度为1.0cm且带有腋芽的茎段为外植体；

(4)茎段腋芽的萌发诱导：

将步骤(3)中带腋芽的茎段接种于添加有0.2mg/lga3、2.0mg/lkt、20mg/lvc、35g/l蔗糖和7.5g/l琼脂的dkw培养基中进行腋芽的萌发诱导培养，光照培养14d，腋芽的萌发效率高达81.5％；

(5)腋芽的增殖和伸长培养：

将步骤(4)中腋芽萌发后的茎段转接于添加有3.0mg/lkt、0.5mg/ltdz、1.0mg/liba、20mg/lvc、35g/l蔗糖和7.5g/l琼脂的dkw培养基中进行腋芽的增殖和伸长培养，光照培养28d后，平均每个外植体产生4.8个不定芽，且不定芽的平均长度为2.3cm；

(6)不定芽的生根培养：

将步骤(5)中增殖和伸长后的不定芽转接于添加有1.0mg/l亚精胺、2.0mg/liaa、20mg/lvc、20g/l蔗糖和7.0g/l琼脂的1/2dkw培养基中进行不定芽的生根培养，光照培养25d后，不定芽的生根率达到89.8％，且平均每个外植体伴有5-8条短粗的、平均长度为3.2cm的不定根；

(7)无菌苗的移栽：

待无菌苗长至5cm，将带有4个完整叶片和健壮根系的蜡梅无菌苗经过开盖驯化后，转入混合营养基质(土：蛭石：珍珠岩＝1:1:1)中进行移栽，1个月后，无菌苗的成活率高达94.6％。

实施例4

本实施例测试了不同消毒方法对上述实施例实施过程中的蜡梅种子萌发效果的影响，具体操作如下：

取成熟蜡梅种子剪去外壳，于无菌操作台中用无菌水冲洗3遍后，用75％的无水乙醇消毒30s，之后再用不同种类的消毒试剂(0.1％升汞溶液，20％次氯酸钠溶液及20％过氧化氢溶液)消毒不同时间(2，5，8和10min)，最后用无菌水冲洗4遍，消毒期间不停的摇动；将消毒后的种子，接种于添加有0.05mg/lga3、30g/l蔗糖和7.0g/l琼脂的1/2dkw培养基中于温度为25±2℃，光照条件为2200lx的恒温培养室进行萌发培养，培养8d后，统计种子的萌发率和污染率，结果如表1所示。

表1结果表明，在所测试的三种消毒剂中，20％过氧化氢的消毒效果最佳，随着消毒时间的延长污染率逐渐降低，消毒5min时种子的萌发率最高达84.5％，此时种子的污染率也仅为5.3％。

表1不同消毒方法对蜡梅种子萌发的影响

为了提高种子的萌发率，在表1最优结果(20％过氧化氢消毒5min)的基础上,进一步研究超声处理不同时间(0，2，4，8和10min)对种子萌发的影响，结果如表2所示；研究结果表明，超声处理能够提高过氧化氢的消毒效果，在降低污染率的同时，提高腊梅种子萌发的萌发率；研究发现，20％过氧化氢溶液处理5min，结合超声处理6min，蜡梅种子的污染率为0.0％，萌发率最高达98.5％。

表2超声处理对蜡梅种子萌发的影响

实施例4

为了提高蜡梅种子实生苗茎段的再生效率，本实施例进一步测试了不同种类和浓度的植物调节剂(kt、tdz和iba)对上述实施例实施过程中的腋芽增殖和伸长的影响，具体操作如下：

取成熟蜡梅种子剪去外壳，将剥去种壳的无损种子于无菌操作台中用无菌水冲洗4遍后，用75％的无水乙醇消毒30s，之后再用20％的过氧化氢溶液消毒5min，超声处理6min，最后用无菌水冲洗5遍，消毒期间不停的摇动；将消毒后的种子，接种于添加有0.05mg/lga3、30g/l蔗糖和7.0g/l琼脂的1/2dkw培养基，于温度为25±2℃，光照条件为2200lx的恒温培养室进行萌发培养，培养8d后，获得萌发的种子实生苗，平均种子萌发率为98.5％；以苗龄为30d的蜡梅种子实生苗为外植体材料来源，选取长度为0.7cm且带有腋芽的茎段为外植体；将带腋芽的茎段接种于添加有0.1mg/lga3、1.0mg/lkt、12.5mg/lvc、30g/l蔗糖和7.0g/l琼脂的dkw培养基中进行腋芽的萌发诱导培养，光照培养14d，腋芽的萌发效率高达95.8％；将腋芽萌发后的茎段转接于添加有不同种类和浓度的植物调节剂(kt、tdz和iba)的培养基中进行腋芽的增殖和伸长培养，光照培养21d后，测试不同种类和浓度的植物调节剂(kt、tdz和iba)对腋芽增殖和伸长的影响，结果如表3所示。

表3研究表明，2.0mg/lkt、0.1mg/ltdz和1.0mg/liba结合使用对蜡梅腋芽的增殖和伸长效果最佳，光照培养21d后，平均每个外植体产生6.2个不定芽，且不定芽的平均长度为3.4cm。

表3不同植物生长调节剂对蜡梅腋芽增殖和伸长的影响

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。