本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种消除组培苗黄化的核桃组培快繁方法。
背景技术：
核桃(juglansregial.)古称胡桃，属胡桃科，胡桃属，原产于欧洲东南部及亚洲西部，我国是核桃原产地之一。由于核桃是重要的坚果和木本油料树种，具有很高的经济价值，位居世界四大干果（核桃、扁桃、腰果、榛子）之首，以其很高的经济、生态及社会效益在世界各地广泛栽培。核桃在长期栽培和人为选择过程中，形成了很多的高产、优质及抗病性良好的优良核桃品种，为了能保持这些品种的优良性状，核桃的后代繁殖主要是采用嫁接和扦插的无性繁殖手段，但采用嫁接繁殖，存在繁殖系数低，速度慢，成活率不稳定，受穗条数量限制等不利因素；采用扦插繁殖方法，由于核桃体内存在有大量单宁抑制物质，扦插不易生根，这样就导致核桃新的优良品种的迅速扩大受到限制。植物组培快繁方法也是当前苗木无性繁殖的主要方法之一，其特点是可使再生植株保持母体遗传稳定性的同时，加快繁殖速度，一年内几颗无菌小芽可以繁育百万株以上的苗木，生产周期大大缩短，可以在较短时间内培育大量优质种苗，并且能建立规模化生产。由于植物组培技术的优越性，中外学者从20世纪60年代末开始对核桃进行组织快繁技术方面的研究并取得了一定的进展，但核桃组培继代培养中的一些关键技术多年都未能得到很好解决，如核桃在继代培养时极易出现失绿黄化，黄化率高达95%以上，严重影响了核桃组培苗的正常分化和生长，从而导致增殖系数大大降低，使得核桃组培苗工厂化育苗一直难以实现。
技术实现要素：
本发明提出了一种克服现有技术中核桃组培快繁育苗过程中继代培养时出现失绿黄化，严重影响了核桃组培苗的正常分化和生长，从而导致增殖系数降低的不足，提出了一种能够消除核桃组培苗黄化现象，能正常分化和生长，提高繁殖系数，稳定遗传性状的消除组培苗黄化的核桃组培快繁方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种消除组培苗黄化的核桃组培快繁方法，包括繁殖材料选择、外植体处理、初始芽诱导和增殖培养工序；采集当年生长健壮且无病虫害的核桃嫩枝梢作为繁殖材料，对枝条进行修剪成茎段作为外植体，对外植体灭菌消毒处理后接种于初始芽诱导培养基中诱导初始芽发生，再将初始芽接种于增殖培养基中后得到无黄化现象的组培继代芽；主要操作步骤如下：
（1）繁殖材料选择：选择通过国家级或省级良种审定的核桃良种无性系、树龄5～8年生的为采穗母树；在采穗母树树冠外围的上方采集当年生长健壮且无病虫害的核桃嫩枝梢，作为核桃组培的优良繁殖材料；
（2）外植体处理：将采集到的核桃嫩枝梢剪成只保留顶芽或2～3cm长带腋芽的茎段作为外植体，用体积浓度75％乙醇溶液对外植体浸泡灭菌30s，蒸馏水冲洗2次后将外植体置于超净台，再用体积浓度0.1％hgcl2溶液以振荡的方式对外植体进行灭菌处理8～10min，最后用无菌水冲洗5次；
（3）初始芽诱导：将步骤（2）处理得到的外植体接种于诱导培养基中，并置于温度25±2℃，光照强度2000～3500lx，光照10～14h/d的环境中诱导初始芽发生；
（4）增殖培养：将步骤（3）获得的初始芽接种于增殖培养基,并置于温度25±2℃，光照强度2000～3500lx，光照10～14h/d的环境中进行增殖培养，得到无黄化现象的组培继代芽。
以上步骤（2）所述的诱导培养基的原料组分和质量含量为：改良ms+6-ba0.5mg·l-1+蔗糖30000mg•l-1+水解乳蛋白300mg•l-1+表油菜素内酯0.2mg•l-1+琼脂3000mg•l-1。
以上步骤（3）所述的增殖培养基的原料组分和质量含量为：改良ms+6-ba1.0～2.0mg·l-1+蔗糖30000mg•l-1+水解乳蛋白300～500mg•l-1+表油菜素内酯0.3～0.5mg•l-1+琼脂3000mg•l-1。
以上所述的改良ms培养基的组成为：kno31600mg·l-1；nh4no31200mg·l-1；cacl2350mg·l-1；mgso4.7h2o370mg·l-1；ca(no3)2.4h2o100mg•l-1；kh2po3270mg•l-1；mnso4.4h2o22.3mg•l-1；znso4.7h2o10.6mg•l-1；cuso4.5h2o0.025mg•l-1；h3bo38.2mg•l-1；na2moo4.2h2o0.25mg•l-1；ki0.83mg•l-1；cocl2.6h2o0.025mg•l-1；na2•edta37.3mg•l-1；feso4.7h2o27.8mg•l-1；维生素b10.4mg•l-1；维生素b60.5mg•l-1；烟酸2.0mg•l-1；甘氨酸1.0mg•l-1；肌醇120mg•l-1。
相对于现有技术，本发明具有的优点及有益效果：
1、本发明改良了传统的ms基本培养基的营养物质的含量和比例，添加了水解乳蛋白和表油菜素内酯两种化学添加物，彻底消除了核桃组培苗在组培过程中出现的黄化现象，使组培苗能正常分化和生长，增殖倍数增加了3～4.5倍，短期内培育大量优质健康的良种苗木，具有良好的经济效益、社会效益和生态效益。
2、本发明在获得无菌苗的的基础上探索核桃组培快繁育苗过程中继代培养时出现失绿黄化，严重影响了核桃组培苗的正常分化和生长，从而导致增殖系数降低的问题提出解决方法，消除核桃组培苗黄化现象，能正常分化和生长，提高繁殖系数，稳定遗传性状，从而使核桃组培苗能达到工厂化育苗的标准。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：
在连续放晴2天以上的天气，选择树龄5～8年生、通过国家级或省级良种审定的核桃良种无性系作为采穗母树；在采穗母树树冠外围的上方采集当年生长健壮且无病虫害的核桃嫩枝梢，作为核桃组培的优良繁殖材料。
将采集到的核桃嫩枝梢剪成只保留顶芽或2～3cm长带腋芽的茎段作为外植体，用体积浓度75％乙醇溶液对外植体浸泡灭菌30s，蒸馏水冲洗2次后将外植体置于超净台，再用体积浓度0.1％hgcl2溶液以振荡的方式对外植体进行灭菌处理8～10min，最后用无菌水冲洗5次。
将消毒灭菌处理得到的外植体接种于诱导培养基中，并置于温度25±2℃，光照强度2000～2500lx，光照14h/d的环境中诱导初始芽发生。所述的诱导培养基的原料组分和质量含量为：改良ms+6-ba0.5mg·l-1+蔗糖30000mg•l-1+水解乳蛋白300mg•l-1+表油菜素内酯0.2mg•l-1+琼脂3000mg•l-1。
培养8d后腋芽开始萌动，培养35d芽长高3～5cm时，将芽从原茎段上切下，接种于增殖培养基,增殖培养基的原料组分和质量含量为：改良ms+6-ba1.0～2.0mg·l-1+蔗糖30000mg•l-1+水解乳蛋白300mg•l-1+表油菜素内酯0.3mg•l-1+琼脂3000mg•l-1，并置于温度25±2℃，光照强度2000～2500lx，光照14h/d的环境中进行增殖培养，促进培养物的腋芽和侧芽萌发。约35d转接一次，培养35d，平均芽高达4.2cm，苗木叶色浓绿无黄化，增殖系数3.8。
以上所述的改良ms培养基的组成为：kno31600mg·l-1；nh4no31200mg·l-1；cacl2350mg·l-1；mgso4.7h2o370mg·l-1；ca(no3)2.4h2o100mg•l-1；kh2po3270mg•l-1；mnso4.4h2o22.3mg•l-1；znso4.7h2o10.6mg•l-1；cuso4.5h2o0.025mg•l-1；h3bo38.2mg•l-1；na2moo4.2h2o0.25mg•l-1；ki0.83mg•l-1；cocl2.6h2o0.025mg•l-1；na2•edta37.3mg•l-1；feso4.7h2o27.8mg•l-1；维生素b10.4mg•l-1；维生素b60.5mg•l-1；烟酸2.0mg•l-1；甘氨酸1.0mg•l-1；肌醇120mg•l-1。
实施例2：
在连续放晴2天以上的天气，选择树龄5～8年生、通过国家级或省级良种审定的核桃良种无性系作为采穗母树；在采穗母树树冠外围的上方采集当年生长健壮且无病虫害的核桃嫩枝梢，作为核桃组培的优良繁殖材料。
将采集到的核桃嫩枝梢剪成2～3cm长带腋芽的茎段作为外植体，用体积浓度75％乙醇溶液对外植体浸泡灭菌30s，蒸馏水冲洗2次后将外植体置于超净台，再用体积浓度0.1％hgcl2溶液以振荡的方式对外植体进行灭菌处理8～10min，最后用无菌水冲洗5次。
将消毒灭菌处理得到的外植体接种于诱导培养基中，并置于温度25±2℃，光照强度2500～3000lx，光照12h/d的环境中诱导初始芽发生。所述的诱导培养基的原料组分和质量含量为：改良ms+6-ba0.5mg·l-1+蔗糖30000mg•l-1+水解乳蛋白300mg•l-1+表油菜素内酯0.2mg•l-1+琼脂3000mg•l-1。
培养8d后腋芽开始萌动，培养35d芽长高3～5cm时，将芽从原茎段上切下，接种于增殖培养基,增殖培养基的原料组分和质量含量为：改良ms+6-ba1.5mg·l-1+蔗糖30000mg•l-1+水解乳蛋白400mg•l-1+表油菜素内酯0.4mg•l-1+琼脂3000mg•l-1，并置于温度25±2℃，光照强度2500～3000lx，光照12h/d的环境中进行增殖培养，促进培养物的腋芽和侧芽萌发。约35d转接一次，培养35d，平均芽高达3.8cm，苗木叶色浓绿无黄化，增殖系数4.5。
以上所述的改良ms培养基的组成为：kno31600mg·l-1；nh4no31200mg·l-1；cacl2350mg·l-1；mgso4.7h2o370mg·l-1；ca(no3)2.4h2o100mg•l-1；kh2po3270mg•l-1；mnso4.4h2o22.3mg•l-1；znso4.7h2o10.6mg•l-1；cuso4.5h2o0.025mg•l-1；h3bo38.2mg•l-1；na2moo4.2h2o0.25mg•l-1；ki0.83mg•l-1；cocl2.6h2o0.025mg•l-1；na2•edta37.3mg•l-1；feso4.7h2o27.8mg•l-1；维生素b10.4mg•l-1；维生素b60.5mg•l-1；烟酸2.0mg•l-1；甘氨酸1.0mg•l-1；肌醇120mg•l-1。
实施例3：
在连续放晴2天以上的天气，选择树龄5～8年生、通过国家级或省级良种审定的核桃良种无性系作为采穗母树；在采穗母树树冠外围的上方采集当年生长健壮且无病虫害的核桃嫩枝梢，作为核桃组培的优良繁殖材料。
将采集到的核桃嫩枝梢剪成2～3cm长带腋芽的茎段作为外植体，用体积浓度75％乙醇溶液对外植体浸泡灭菌30s，蒸馏水冲洗2次后将外植体置于超净台，再用体积浓度0.1％hgcl2溶液以振荡的方式对外植体进行灭菌处理8～10min，最后用无菌水冲洗5次。
将消毒灭菌处理得到的外植体接种于诱导培养基中，并置于温度25±2℃，光照强度3000～3500lx，光照10h/d的环境中诱导初始芽发生。所述的诱导培养基的原料组分和质量含量为：改良ms+6-ba0.5mg·l-1+蔗糖30000mg•l-1+水解乳蛋白300mg•l-1+表油菜素内酯0.2mg•l-1+琼脂3000mg•l-1。
培养8d后腋芽开始萌动，培养35d芽长高3～5cm时，将芽从原茎段上切下，接种于增殖培养基,增殖培养基的原料组分和质量含量为：改良ms+6-ba2.0mg·l-1+蔗糖30000mg•l-1+水解乳蛋白500mg•l-1+表油菜素内酯0.5mg•l-1+琼脂3000mg•l-1，并置于温度25±2℃，光照强度3000～3500lx，光照10h/d的环境中进行增殖培养，促进培养物的腋芽和侧芽萌发。约35d转接一次，培养35d，平均芽高达4.1cm，苗木叶色浓绿无黄化，增殖系数4.3。
以上所述的改良ms培养基的组成为：kno31600mg·l-1；nh4no31200mg·l-1；cacl2350mg·l-1；mgso4.7h2o370mg·l-1；ca(no3)2.4h2o100mg•l-1；kh2po3270mg•l-1；mnso4.4h2o22.3mg•l-1；znso4.7h2o10.6mg•l-1；cuso4.5h2o0.025mg•l-1；h3bo38.2mg•l-1；na2moo4.2h2o0.25mg•l-1；ki0.83mg•l-1；cocl2.6h2o0.025mg•l-1；na2•edta37.3mg•l-1；feso4.7h2o27.8mg•l-1；维生素b10.4mg•l-1；维生素b60.5mg•l-1；烟酸2.0mg•l-1；甘氨酸1.0mg•l-1；肌醇120mg•l-1。