一种提高前列腺素A含量的紫皮洋葱不定根悬浮培养方法与流程

本发明涉及一种紫皮洋葱不定根培养方法。

背景技术：

洋葱(alliumcepal.)，别名球葱、圆葱、玉葱等，百合科、葱属二年生草本植物。洋葱在中国分布广泛，南北各地均有栽培，是中国主栽蔬菜之一。洋葱含有丰富的药用成分，如含硫化合物、类黄酮化合物、苯丙素酚类化合物、甾体皂苷类、含氮化合物、前列腺素等，能够抑菌、抗氧化、抗肿瘤、降血脂及预防心脑血管疾病。

前列腺素(prostaglandins，pgs)属于类花生四烯酸，向来被认为与血小板的功能具有密切的联系。前列腺素分为a、b、c、d、e、f、g、h、i等类型，不同类型的前列腺素具有不同的功能。其中前列腺素a具有拮抗兴奋性氨基酸受体介导的神经毒性和线粒体毒素引起的细胞毒性作用，同时对于局灶性缺血性中风模型具有良好的疗效。前列腺素a的主要药理学作用包括：扩血管、抑制细胞增殖、抗病毒作用、细胞保护作用、抗炎作用等。

普通的洋葱不定根中的前列腺素a的含量不高，仅为0.124mg/100g，目前研究人员都在寻求一种方法来提高洋葱中的前列腺素a。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决普通的洋葱不定根中的前列腺素a的含量低的问题，提供一种提高前列腺素a含量的紫皮洋葱不定根悬浮培养方法。

本发明提高前列腺素a含量的紫皮洋葱不定根悬浮培养方法，包括以下步骤：

一、将新鲜洋葱剥除鳞茎外皮，切除顶部2/3的组织和外层鳞片叶，流水冲洗20～30min，然后使用75％乙醇消毒30～40s，用无菌水冲洗3～4次，接着于体积浓度为3％～5％的次氯酸钠溶液中浸泡10～15min，无菌水冲洗3-4次，切取洋葱鳞茎盘，用无菌滤纸吸干水分，切割成0.3～0.4mm的小块，接种于诱导培养基上，于黑暗环境培养20～24d；

二、挑选长势良好的愈伤组织，接种于继代培养基上，于光照环境继续培养，20～30d继代1次，共继代2～3次；

三、挑选疏松，生长旺盛的愈伤组织，用镊子夹碎，接种到悬浮培养基中，接种量为10～15g/l，于黑暗环境100～150rpm培养，7～8d继代一次，继代时倒掉旧的悬浮培养基，加入新鲜悬浮培养基；

四、将在摇床上培养的紫皮洋葱不定根，接种到装有新鲜培养基的生物反应器中，接种量为12.5～13g/l，于黑暗环境培养，30～32d后收获。

进一步的，步骤一所述诱导培养基配方：ms+0.5mg/l2,4-d。

进一步的，步骤二所述继代培养基配方：ms+0.5mg/l2,4-d+1g/lpvp。

进一步的，步骤三所述悬浮培养基配方：1/2ms+1.5mg/liba+0.01mg/lnaa。

进一步的，步骤三所述悬浮培养基配方：不添加激素的1/2ms培养基。

进一步的，步骤四所述生物反应器中的培养基配方：1/2ms+1.5mg/liba+0.01mg/lnaa，每升培养基添加蔗糖30g，琼脂9g/l，灭菌前调ph值至5.75-5.85，121℃灭菌20min。

本发明的有益效果：

本发明建立一种紫皮洋葱不定根悬浮培养、气升式生物反应器培养的方法。利用生物反应器培养洋葱不定根，可大大降低自然条件的限制，减少病菌侵害，且生长周期较自然界短，效率高。使用本方法在70d后收获，获得的不定根鲜重可达到278.8g，干重15.59g，培养前的鲜重为100g，干重5.02g，不定根增长率可达278.8％。

使用本发明方法培养紫皮洋葱不定根，可提高洋葱不定根中前列腺素a的含量，且前列腺素a含量与培养前相比提高了5.6％。

本方法简单，效果显著，为日后利用洋葱生产富含前列腺素a等次生代谢物奠定基础。

说明书附图

图1为紫皮洋葱诱导产生的愈伤组织照片；

图2为紫皮洋葱的疏松愈伤组织照片；

图3为以培养基1/2ms+1.5mg/liba+0.01mg/lnaa得到的紫皮洋葱悬浮培养的不定根；

图4为以培养基1/2ms+无激素得到的紫皮洋葱悬浮培养的不定根；

图5为10l生物反应器培养的不定根照片。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式提高前列腺素a含量的紫皮洋葱不定根悬浮培养方法，包括以下步骤：

一、将新鲜洋葱剥除鳞茎外皮，切除顶部2/3的组织和外层鳞片叶，流水冲洗20～30min，然后使用75％乙醇消毒30～40s，用无菌水冲洗3～4次，接着于体积浓度为3％～5％的次氯酸钠溶液中浸泡10～15min，无菌水冲洗3-4次，切取洋葱鳞茎盘，用无菌滤纸吸干水分，切割成0.3～0.4mm的小块，接种于诱导培养基上，于黑暗环境培养20～24d；

二、挑选长势良好的愈伤组织，接种于继代培养基上，于光照环境继续培养，20～30d继代1次，共继代2～3次；

三、挑选疏松，生长旺盛的愈伤组织，用镊子夹碎，接种到悬浮培养基中，接种量为10～15g/l，于黑暗环境100～150rpm培养，7～8d继代一次，继代时倒掉旧的悬浮培养基，加入新鲜悬浮培养基；

四、将在摇床上培养的紫皮洋葱不定根，接种到装有新鲜培养基的生物反应器中，接种量为12.5～13g/l，于黑暗环境培养，30～32d后收获。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一所述诱导培养基配方：ms+0.5mg/l2,4-d。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二所述继代培养基配方：ms+0.5mg/l2,4-d+1g/lpvp。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三所述悬浮培养基配方：1/2ms+1.5mg/liba+0.01mg/lnaa。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三所述悬浮培养基配方：不添加激素的1/2ms培养基。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤四所述生物反应器中的培养基配方：1/2ms+1.5mg/liba+0.01mg/lnaa，每升培养基添加蔗糖30g，琼脂9g/l，灭菌前调ph值至5.75-5.85，121℃灭菌20min。其它与具体实施方式一相同。

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

(一)诱导愈伤组织

将新鲜洋葱剥除鳞茎外皮，切除顶部2/3和外层鳞片叶，流水冲洗20min，75％乙醇消毒30s，无菌水冲洗3-4次。3％次氯酸钠溶液浸泡10min，无菌水冲洗3-4次。切取洋葱鳞茎盘，用无菌滤纸吸干水分，切割成0.3-0.4mm小块，诱导愈伤组织(如图1所示)。最佳外植体为鳞茎盘(表1)，最佳诱导培养基为ms+0.5mg/l2,4-d，黑暗培养(表2和表3)。

表1不同外植体对紫皮洋葱愈伤组织诱导的影响

注：“-”表示不生长；“+”表示长势差；“++”表示长势较好；“+++”表示长势良好。

表2不同激素浓度组合对紫皮洋葱愈伤组织诱导的影响

表3光照对紫皮洋葱愈伤组织诱导的影响

(二)继代培养

挑选长势良好的愈伤组织，接种于最佳培养基上，于光照环境培养，20-30d继代1次，继代2-3次后，愈伤呈疏松(如图2所示)、小颗粒状。最佳继代培养条件为ms+0.5mg/l2,4-d+1g/lpvp，光照培养(表4)。

表4激素种类及光照对紫皮洋葱愈伤组织继代培养的影响

(三)悬浮不定根的建立

挑选疏松，生长旺盛的愈伤组织，用镊子夹碎，接种到装有50ml培养基三的150ml三角瓶中，接种量为10g/l，于黑暗环境100rpm培养，7d继代一次，继代时倒掉旧培养液，加入新鲜培养液。最佳悬浮培养基为1/2ms+1.5mg/liba+0.01mg/lnaa和1/2ms+无激素，接种量1％，100rpm，黑暗培养(表5和表6)。以培养基1/2ms+1.5mg/liba+0.01mg/lnaa得到的紫皮洋葱悬浮培养的不定根如图3所示，以培养基1/2ms+无激素得到的紫皮洋葱悬浮培养的不定根如图4所示。

表5培养基种类、激素对紫皮洋葱液体悬浮的影响

注：运用duncan多重比较，相同字母为差异不显著(p＜0.05)。

表6接种量对紫皮洋葱液体悬浮的影响

(四)生物反应器培养

将在摇床上培养的紫皮洋葱不定根，接种到装有8l培养基的10l生物反应器中，10l生物反应器培养的不定根如图5所示，培养基为1/2ms+1.5mg/liba+0.01mg/lnaa，接种量为12.5g/l，于黑暗环境培养，70d后收获，平均鲜重278.8g，平均干重15.59g，不定根增长率达278.8±6.31％。前列腺素a含量平均0.131mg/100g，前列腺素a与培养前相比含量提高了5.6±0.95％。