一种盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法与流程

本发明涉及一种植物叶片高效再生体系建立的方法，尤其是一种盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法。

背景技术：

一年生草本盐生植物盐生草（halogetonglomeratus），隶属于藜科（chenopodiaceae）盐生草属（halogeton）。多生长于干旱、半干旱荒漠地带的盐渍地，具有适应盐碱、干旱和高温等逆境的特性，是我国西北旱区、中亚特有的抗旱耐盐植物，且防风固沙的功效显著，具有极为重要的生态价值。由于大多数传统作物耐盐性均较弱、耐盐种质多样性差的共性特征，故从盐生植物中发掘耐盐基因，通过遗传转化手段提高作物耐盐性是解决土壤盐渍化问题的主要策略。只有建立了稳定，高频的再生体系，才能构建较好的遗传转化体系，提高转化效率，获得转基因植株，进而对培育耐盐作物新品种具有重要意义。

已有专利文献zl201510113016.8和zl201510112968.8分别报道了快速诱导盐生草胚性愈伤组织的方法和快速诱导繁殖盐生草幼根愈伤组织的方法，但仍不能解决盐生草再生体系建立的问题，本发明在上述2个发明的基础上进一步对盐生草再生体系进行优化，最终确定了盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法。

技术实现要素：

鉴于现有技术的不足，本发明提供了一种盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法。本发明公开了一种以盐生草叶片分生组织为外植体材料，通过愈伤组织的诱导、继代、分化及再生，最终获得再生植株，以期为盐生草遗传改良研究奠定基础。

一种盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法，步骤如下：

（1）盐生草无菌叶片分生组织的获得：常规灭菌后的盐生草种子进行无菌培养15-20d，取其分生组织作为诱导愈伤的外植体；

（2）愈伤组织的诱导：将步骤（1）获得的无菌外植体接种于诱导愈伤组织的培养基，培养15-20d，诱导愈伤组织的发生；

（3）愈伤组织的继代培养：将步骤（2）获得的嫩绿色愈伤组织转接至继代培养基，培养15-20d，使其增殖；

（4）愈伤组织的分化及再生培养：将步骤（3）获得的深绿色愈伤组织切割成直径0.3-0.5cm的小块，转接至分化培养基，培养20-25d，产生不定芽，然后将不定芽转接至相同的分化培养基连续培养1-2次，至生成丛生芽；

（5）丛生芽的生根培养：将步骤（4）获得的丛生芽转接至生根培养基，培养25-30d，最终获得生长良好的再生植株。

所述的盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法，步骤（1）所述的叶片分生组织为无菌苗第5，6片叶生成时的叶片分生组织。

所述的盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法，步骤（2）所述的愈伤组织诱导培养基由ms基本培养基，2.0-2.5mg/l2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-d），0.5-1g/lpolyvinylpyrrolidone(pvp)，10-15mg/l谷氨酰胺，5-6g/l琼脂，20-30g/l蔗糖组成，ph=5.8-6.0。

所述的盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法，步骤（3）所述的愈伤组织继代培养基由ms基本培养基，0.5-1mg/l2，4-d，0.5-1g/lpolyvinylpyrrolidone(pvp)，10-15mg/l谷氨酰胺，5-6g/l琼脂，20-30g/l蔗糖组成，ph=5.8-6.0。

所述的盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法，步骤（4）所述的愈伤组织的分化及再生培养的培养基由ms基本培养基，0.5-1mg/l6-ba，1.5-2mg/lkt，0.15-0.25mg/lnaa，2-2.5g/l酪蛋白，0.5-1g/lpolyvinylpyrrolidone(pvp)，10-15mg/l谷氨酰胺，5-6g/l琼脂，20-30g/l蔗糖组成，ph=5.8-6.0。

所述的盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法，步骤（5）所述丛生芽的生根培养基由ms基本培养基，4-5g/l琼脂，20-30g/l蔗糖组成，ph=5.8-6.0。

所述的盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法，步骤（1）、（2）、（3）、（4）、（5）均在连续光照培养，光照强度在1500-2000lx之间，湿度60-70%的环境下进行。

本发明的有益效果如下：

（1）以盐生草无菌苗第5，6片叶生成时的叶片分生组织为诱导愈伤的外植体，且愈伤组织的诱导与继代培养基中加入2，4-d，polyvinylpyrrolidone(pvp)以及谷氨酰胺，可有效地克服愈伤组织质量差，生长速度缓慢的缺点。

（2）在愈伤组织分化培养过程中，以6-ba，kt，naa为外源激素，并加入酪蛋白，polyvinylpyrrolidone(pvp)以及谷氨酰胺，最终可获得大量形状一致，遗传稳定性高的盐生草丛生芽，满足试验需求。

（3）整个培养过程在可控条件下进行，不受气候条件和盐生草自然生长周期的限制，杜绝了病虫害的干扰，实现了简单、易行、高效获得盐生草再生体系的目标。

附图说明

图1是叶片分生组织培养15-20d后的盐生草愈伤组织的照片；

图2是继代培养15-20d后的盐生草愈伤组织的照片；

图3是愈伤组织培养20-25d后分化出的不定芽的照片；

图4是不定芽分化培养20-25d后产生的丛生芽的照片；

图5是丛生芽转接至生根培养基25-30d获得的再生植株的照片。

具体实施方式

为使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。

在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。

实施例1

一种盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法，将常规灭菌后的盐生草种子进行无菌培养16d，取其分生组织作为诱导愈伤的外植体，将其转接至诱导培养基，培养15d，然后将获得的愈伤组织转接至继代培养基19d后，选取深绿色愈伤组织切割成直径0.3cm的小块，置于分化培养基，培养21d，分化出不定芽，接着将不定芽转接至相同的分化培养基23d后生成丛生芽，最后将丛生芽置于生根培养基，培养28d。其中诱导培养基主要由ms基本培养基，2.0mg/l2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-d），0.5g/lpolyvinylpyrrolidone(pvp)，10mg/l谷氨酰胺，5g/l琼脂，30g/l蔗糖组成；继代培养基主要由ms基本培养基，1.0mg/l2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-d），0.6g/lpolyvinylpyrrolidone(pvp)，12mg/l谷氨酰胺，5g/l琼脂，30g/l蔗糖组成；分化及再生培养基主要由ms基本培养基，0.5mg/l6-ba，2mg/lkt，0.25mg/lnaa，2g/l酪蛋白，0.6g/lpolyvinylpyrrolidone(pvp)，10mg/l谷氨酰胺，5g/l琼脂，30g/l蔗糖组成。愈伤诱导、继代、分化及生根培养均在25℃的环境下进行，且为连续光照培养，光照强度在1000lx之间，ph=5.8。

结果表明：愈伤组织诱导率100%，芽分化率45%，且能得到大量深绿色丛生芽，其生根率100%，整个再生植株生长健壮。

实施例2

一种盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法，将常规灭菌后的盐生草种子进行无菌培养20d，取其分生组织作为诱导愈伤的外植体，将其转接至诱导培养基，培养18d，然后将获得的愈伤组织转接至继代培养基20d后，选取深绿色愈伤组织切割成直径0.5cm的小块，置于分化培养基，培养25d，分化出不定芽，接着将不定芽转接至相同的分化培养基25d后生成丛生芽，最后将丛生芽置于生根培养基，培养25d。其中诱导培养基主要由ms基本培养基，2.3mg/l2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-d），0.7g/lpolyvinylpyrrolidone(pvp)，12mg/l谷氨酰胺，5g/l琼脂，30g/l蔗糖组成；继代培养基主要由ms基本培养基，1.5mg/l2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-d），0.5g/lpolyvinylpyrrolidone(pvp)，10mg/l谷氨酰胺，5g/l琼脂，30g/l蔗糖组成；分化及再生培养基主要由ms基本培养基，0.8mg/l6-ba，1.7mg/lkt，0.20mg/lnaa，2g/l酪蛋白，0.5g/lpolyvinylpyrrolidone(pvp)，10mg/l谷氨酰胺，5g/l琼脂，30g/l蔗糖组成。愈伤诱导、继代、分化及生根培养均在25℃的环境下进行，且为连续光照培养，光照强度在1000lx之间，ph=5.8。

结果表明：愈伤组织诱导率100%，芽分化率50%，且能得到大量深绿色丛生芽，其生根率100%，整个再生植株生长健壮。

实施例3

一种盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法，将常规灭菌后的盐生草种子进行无菌培养15d，取其分生组织作为诱导愈伤的外植体，将其转接至诱导培养基，培养20d，然后将获得的愈伤组织转接至继代培养基17d后，选取深绿色愈伤组织切割成直径0.4cm的小块，置于分化培养基，培养20d，分化出不定芽，接着将不定芽转接至相同的分化培养基23d后生成丛生芽，最后将丛生芽置于生根培养基，培养30d。其中诱导培养基主要由ms基本培养基，2.0g/l2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-d），0.9g/lpolyvinylpyrrolidone(pvp)，14mg/l谷氨酰胺，5g/l琼脂，30g/l蔗糖组成；继代培养基主要由ms基本培养基，1.0mg/l2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-d），0.8g/lpolyvinylpyrrolidone(pvp)，11mg/l谷氨酰胺，5g/l琼脂，30g/l蔗糖组成；分化及再生培养基主要由ms基本培养基，1.0mg/l6-ba，2.0mg/lkt，0.15mg/lnaa，2.2g/l酪蛋白，0.5g/lpolyvinylpyrrolidone(pvp)，11mg/l谷氨酰胺，5g/l琼脂，30g/l蔗糖组成。愈伤诱导、继代、分化及生根培养均在25℃的环境下进行，且为连续光照培养，光照强度在1000lx之间，ph=5.8。

结果表明：愈伤组织诱导率100%，芽分化率48%，且能得到大量深绿色丛生芽，其生根率100%，整个再生植株生长健壮。

实施例4

在盐生草叶片分生组织高效再生体系建立过程中，外源物质的种类与用量对愈伤组织的诱导、分化以及生根起到了关键作用，本试验通过对外源物质的种类与用量进行优化，确定了最佳的盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法。

（1）愈伤组织诱导过程中外源物质种类和用量的选择

外源物质为2,4-d，6-ba，naa，kt，谷氨酰胺，酪蛋白，pvp，其中2,4-d是2,4二氯苯氧乙酸，6-ba是苄氨基嘌呤，naa是萘乙酸，kt是激动素，设置三个处理，分别为处理a(0.1mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+10mg/l谷氨酰胺+0.5g/lpvp)，处理b(2mg/l2,4-d+10mg/l谷氨酰胺+0.5g/lpvp)，处理c(1mg/l2,4-d+15mg/l谷氨酰胺)，所用基础培养基是ms培养基，30g/l蔗糖，5g/l琼脂，0.1g/l肌醇，ph=5.8，取培养15-20d的无菌苗叶片分生组织，接种于以上三种不同诱导培养基，3次重复，25℃，2000lx连续光照培养15-20d，观察愈伤组织的诱导情况。结果发现：处理a无愈伤组织产生，且随着培养时间的延长，组织逐渐呈浅红色，处理b诱导愈伤率高达100%，且全为嫩绿色愈伤组织，处理c能诱导出少量的愈伤组织，且愈伤组织褐化严重。

（2）愈伤组织继代过程中外源物质种类和用量的选择

通过试验1所选出的诱导愈伤组织最佳外源物质种类和用量的基础上，对愈伤组织继代培养所用的外源物质的种类和用量进行选择，设置三个处理，分别为处理a（2mg/l2,4-d+10mg/l谷氨酰胺），处理b（1mg/l2,4-d+10mg/l谷氨酰胺），处理c（1mg/l2,4-d+10mg/l谷氨酰胺+0.5g/lpvp），所用基础培养基是ms培养基，30g/l蔗糖，5g/l琼脂，0.1g/l肌醇，ph=5.8，取诱导培养基上培养15-20d的愈伤组织，接种于以上三种不同的继代培养基，3次重复，25℃，2000lx连续光照培养15-20d，观察愈伤组织的增殖情况。结果发现：处理a愈伤组织呈团状，松软且褐化严重，处理b愈伤组织块状，结构紧实，但是褐化严重，处理c得到大量块状，结构紧实，深绿色的愈伤组织。

（3）愈伤组织分化及再生过程中外源物质种类和用量的选择

通过试验2所选出的愈伤组织继代培养最佳外源物质种类和用量的基础上，继续对愈伤组织分化及再生过程中最佳外源物质的种类和用量进行优化，设置三个处理，分别为处理a（0.5mg/lnaa+2mg/lkt+2g/l酪蛋白+0.5g/lpvp），处理b（0.2mg/lnaa+2mg/lkt+10mg/l谷氨酰胺+0.5g/l酪蛋白+0.5g/lpvp），处理c（0.5mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+2mg/lkt+10mg/l谷氨酰胺+2g/l酪蛋白+0.5g/lpvp），所用基础培养基是ms培养基，30g/l蔗糖，5g/l琼脂，0.1g/l肌醇，ph=5.8，取继代培养15-20d的愈伤组织，接种于以上三种不同的分化培养基，3次重复，25℃，2000lx连续光照培养20-25d，观察愈伤组织的分化情况。结果发现：处理a和处理b分化出少量的不定芽，随着培养时间的延长，不定芽逐渐呈现浅黄色或黄色，处理c得到大量深绿色的不定芽，且不定芽生长速率较快。

（4）不定芽继代次数的选择

通过试验3优选出适合愈伤组织分化的最佳外源物质种类与用量，在此基础上，继续对不定芽继代再生次数进行明确，所用基础培养基是ms培养基，30g/l蔗糖，5g/l琼脂，0.1g/l肌醇，ph=5.8，并且添加0.5mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+2mg/lkt+10mg/l谷氨酰胺+2g/l酪蛋白+0.5g/lpvp，取分化培养20-25d的不定芽，接种于此培养基，3次重复，25℃，2000lx连续光照培养，每20-25d继代一次，并且连续继代，观察不定芽的生长情况。结果发现：不定芽继代培养1-2次，可获得大量生长均匀一致的丛生芽，且丛生芽呈深绿色，生长健壮，当继代3-4次后，丛生芽生长放缓，且部分呈黄色或黄褐色。

（5）丛生芽生根过程中外源物质种类和用量的选择

通过试验4确定的最适不定芽继代次数的基础上，继续对最佳生根培养基的外源物质种类与用量进行选择，设置三个处理，处理a（1/2ms+30g/l蔗糖+0.1g/l肌醇+6g/l琼脂），处理b（ms+30g/l蔗糖+0.1g/l肌醇+4.6g/l琼脂），处理c（ms+30g/l蔗糖+0.1g/l肌醇+5g/l琼脂+0.5mg/lnaa），其中ph=5.8，取继代1-2次所得的丛生芽，接种于以上三种不同的分化培养基，3次重复，25℃，2000lx连续光照培养25-30d，观察丛生芽的生根情况。结果发现：处理a生根效果较差，且根集中在琼脂表面，处理c产生的根系过多，且丛生芽生长异常，处理b生根效果最好，丛生芽生长健壮，呈深绿色。

实施例5

一种盐生草叶片分生组织高效再生试剂盒，试剂盒包括：愈伤组织诱导试剂、愈伤组织继代培养试剂、愈伤组织分化及再生培养试剂和丛生芽的生根培养试剂。其中，愈伤组织诱导试剂包括：2.0-2.5mg/l2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-d），0.5-1g/lpolyvinylpyrrolidone(pvp)，10-15mg/l谷氨酰胺，5-6g/l琼脂，20-30g/l蔗糖。愈伤组织继代培养试剂包括：ms基本培养基，0.5-1mg/l2，4-d，0.5-1g/lpolyvinylpyrrolidone(pvp)，10-15mg/l谷氨酰胺，5-6g/l琼脂，20-30g/l蔗糖。愈伤组织分化及再生培养试剂包括：ms基本培养基，0.5-1mg/l6-ba，1.5-2mg/lkt，0.15-0.25mg/lnaa，2-2.5g/l酪蛋白，0.5-1g/lpolyvinylpyrrolidone(pvp)，10-15mg/l谷氨酰胺，5-6g/l琼脂，20-30g/l蔗糖。丛生芽的生根培养试剂包括：ms基本培养基，4-5g/l琼脂，20-30g/l蔗糖。试剂盒中各试剂采用密闭玻璃瓶存放，4度保存。

综上所述，本发明建立的盐生草再生体系以叶片分生组织为外植体，使其诱导出愈伤组织，愈伤组织继代后进行分化培养，得到不定芽，不定芽连续继代1-2次，获得丛生芽，最后丛生芽生根培养得到完整的再生植株。各步骤生长表现良好，培养的植株健壮，根系发达，表明本发明是切实可行有效的。

以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。