本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种高品质沙田柚的组织培养快繁方法。
背景技术：
沙田柚原产于广西容县，后来发展到福建、广东、广西桂林、广西柳州等地相继引种广西容县沙田柚种植，沙田柚是柚类中的优良品种，沙田柚是亚热带常绿乔木,芸香科柑橘属。沙田柚营养丰富,直接食用果肉占51.8～58.8%,可溶性固形物12～16%,粗蛋白质6.4%(干物计),含糖分12%左右,含酸量0.29%,维生素c含量100～150毫克/100克,居各种柑橘之冠,此外还含有维生素b1、b2、b6、烟酸和磷、钙、铁等,有消食、化痰、止咳、润肺、醒酒等功效。且沙田柚皮可加工成副食品和柚皮时菜,也可提炼高级芳香油;柚核可提炼工业用油;沙田柚树叶是养兔的好饲料;树干木质坚,而且平滑美观,可制作家具。沙田柚经济价值极高。
目前，沙田柚还是以农户个体种植经营为主，每户一般种植沙田柚在10～20亩左右，沙田柚单个种植规模不够大，规模化、集约化、标准化生产水平低，组织化程度低。因此，对沙田柚品系进行选优，选育出优良的沙田柚品种有利于规范沙田柚市场，保护沙田柚品牌效应，提高果农经济收入。目前沙田柚种苗繁殖主要依靠种子繁殖，这些繁殖方式速度慢、效率低，无法满足沙田柚优良品种规模化种植对优质种苗的需求，因此，非常有必要建立一套完整的容县沙田柚组织培养快繁体系。以满足果农大规模种植需要。对比文件1，专利号：201110369554.5，名称：大果红花油茶组织培养快速繁殖的育苗方法，包括用来繁殖的外植体采集、无菌分化、壮苗培养和袋装苗移栽。选取芽尖或叶片作繁殖的外植体，经消毒，去除杂质，用分化培养基培养，培育成原球细胞团并进一步形成小植株，将诱导出的小植株切割后接入新的分化培养基中多次继代，获得的小植株接种到特制的壮苗培养基上进行壮苗培养，最后进行袋装苗移栽。其结构特征、技术特征与本专利申请不相同。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种高产量品质沙田柚的组织培养快繁方法，通过诱导不定芽、丛生芽增殖、试管苗生根等阶段，使沙田柚通过丛生芽的离体快繁方式获得大量试管苗，从而实现了本发明的目的。
一种高品质沙田柚的组织培养快繁方法，其特征在于包括以下工艺步骤：
（1）诱导不定芽：选取沙田柚带顶芽茎、侧芽茎为外植体,经75%～80%酒精消毒1～5分钟后，用无菌水冲洗2～5次后置于0.1%～0.3%的升汞溶液中消毒10～15分钟，然后用无菌水冲洗5～6次，经无菌滤纸吸干水分后接种到诱导培养基上,在25～28℃条件下全暗培养，暗培养7～15天，直至诱导形成不定芽。
（2）丛生芽增殖培养：将不定芽接种到增殖培养基上进行增殖培养，接种后置于每天光照12～15小时，光照强度为1000～1500lx，培养温度为25～28℃的条件下培养，20～30天转接一次。
（3）试管苗生根：将长至2～4cm的丛生芽分切接种到生根培养基上进行诱导生根，接种后先在25～28℃条件下全暗培养7～14天，然后置于每天光照12～15小时，光照强度为2000～3000lx，培养温度为25～28℃的条件下培养至生根。
步骤（1）所述的沙田柚带顶芽茎、侧芽茎外植体在进行不定芽诱导之前需进行预处理，处理的方法是：将从野外采集的沙田柚带顶芽茎、侧芽茎用自来水冲洗干净泥沙，再用饱和洗衣粉溶液浸泡7～10分钟，然后置于流动自来水冲洗8∽24小时，直至冲洗干净，备用。
步骤（1）所述的诱导培养基为：以ms为基本培养基，附加2.0～4.0mg/l核黄素、0.1～0.2mg/ld-泛酸钙、1.0～6.0mg/l抗坏血酸、1.0～5.0mg/ll-半胱氨酸、0.01～0.03mg/l生物素、2.5%～3.0%蔗糖、0.35%～0.5%琼脂、以及0.2～1.0mg/l6-ba和0.1～0.5mg/lnaa，ph值为5.4～5.8。
步骤（2）所述的增殖培养基为：以ms为基本培养基，附加0.2～2.0mg/l6-ba、0.1～0.8mg/lnaa、2.0～4.0mg/l核黄素、0.1～0.2mg/ld-泛酸钙、1.0～6.0mg/l抗坏血酸、1.0～5.0mg/ll-半胱氨酸、0.01～0.03mg/l生物素和2.5%～3.0%蔗糖、0.35%～0.5%琼脂，ph值为5.4～5.8。
步骤（3）所述的生根培养基为：以1/2ms为基本培养基，附加0.1～0.8mg/liba、0.1～1.0mg/lnaa、2.0～4.0mg/l核黄素、0.1～0.2mg/ld-泛酸钙、1.0～6.0mg/l抗坏血酸、1.0～5.0mg/ll-半胱氨酸、0.01～0.03mg/l生物素、2.5%～3.0%蔗糖、0.4%～0.6%琼脂，ph值为5.4～5.8。
本发明利用植物组织培养技术进行沙田柚种苗规模化生产，建立了沙田柚的组织培养快繁方法，而本发明具有简单、易行、经济的特点。可以为沙田柚优良品种的保护和规模化种植提供种苗保障。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1
1）、外植体预处理
将从野外采集的沙田柚带顶芽茎用自来水冲洗干净泥沙后置于饱和的洗衣粉溶液中浸泡7分钟，再用流动自来水冲,12小时后置于3℃冰箱中备用。
2）、培养过程
（1）诱导不定芽：沙田柚带顶芽茎经75%酒精消毒1分钟后，用无菌水冲洗3次后置于0.1%的升汞溶液中消毒15分钟，然后用无菌水冲洗5次，经无菌滤纸吸干水分后接种到诱导培养基上,在28℃条件下全暗培养，培养7天后形成不定芽。所采用的诱导培养基为：ms+0.5mg/l6-ba+0.3mg/lnaa+3.0mg/l核黄素+0.1mg/ld-泛酸钙+1.5mg/l抗坏血酸+1.5mg/ll-半胱氨酸+0.01mg/l生物素+3.0%蔗糖+0.35%琼脂，ph值为5.8。
（2）丛生芽增殖培养：将不定芽接种到增殖培养基上进行增殖培养，接种后置于每天光照15小时，光照强度为1000lx，培养温度为28℃的条件下培养，25天转接一次，增殖系数为4～6。所采用的增殖培养基为：ms+1.5mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+3.0mg/l核黄素+0.1mg/ld-泛酸钙+1.5mg/l抗坏血酸+1.5mg/ll-半胱氨酸+0.01mg/l生物素+3.0%蔗糖+0.35%琼脂，ph值为5.8。
（3）试管苗生根：将长至2～4cm的丛生芽分切接种到生根培养基上进行诱导生根，接种后先在28℃条件下全暗培养14天，然后置于每天光照15小时，光照强度为3000lx，培养温度为28℃的条件下培养20天生根，生根率达95%。所采用的生根培养基为：1/2ms+0.8mg/liba+1.0mg/lnaa+2.0mg/l核黄素+0.2mg/ld-泛酸钙+1.0mg/l抗坏血酸+1.0mg/ll-半胱氨酸+0.03mg/l生物素+3.0%蔗糖+0.4%琼脂，ph值为5.8。
实施例2
1）、外植体预处理
将从野外采集的沙田柚带顶芽、侧芽茎用自来水冲洗干净泥沙后置于饱和洗衣粉溶液中浸泡10分钟，再用流动自来水冲洗24小时后胶塑料袋密封后置于5℃冰箱中备用。
2）、培养过程
（1）诱导不定芽：沙田柚带顶芽、侧芽茎经75%酒精消毒5分钟后，用无菌水冲洗5次后置于0.2%的升汞溶液中消毒10分钟，然后用无菌水冲洗6次，经无菌滤纸吸干水分后接种到诱导培养基上,在25℃条件下全暗培养，培养10天后形成不定芽。所采用的诱导培养基为：ms+1mg/l6-ba+0.3mg/lnaa+3.0mg/l核黄素+0.2mg/ld-泛酸钙+1.0mg/l抗坏血酸+1.0mg/ll-半胱氨酸+0.03mg/l生物素+3.0%蔗糖+0.35%琼脂，ph值为5.6。
（2）丛生芽增殖培养：将不定芽接种到增殖培养基上进行增殖培养，接种后置于每天光照12小时，光照强度为1300lx，培养温度为25℃的条件下培养，28天转接一次，增殖系数为4～6。所采用的增殖培养基为：ms+1.5mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+3.0mg/l核黄素+0.2mg/ld-泛酸钙+1.0mg/l抗坏血酸+1.0mg/ll-半胱氨酸+0.03mg/l生物素+3.0%蔗糖+0.35%琼脂，ph值为5.6。
（3）试管苗生根：将长至2～4cm的丛生芽分切接种到生根培养基上进行诱导生根，接种后先在25℃条件下全暗培养10天，然后置于每天光照12小时，光照强度为2500lx，培养温度为25℃的条件下培养28天生根，生根率达92%。所采用的生根培养基为：1/2ms+0.8mg/liba+1.0mg/lnaa+2.0mg/l核黄素+0.2mg/ld-泛酸钙+2.0mg/l抗坏血酸+2.0mg/ll-半胱氨酸+0.03mg/l生物素+3.0%蔗糖+0.4%琼脂，ph值为5.6。
实施例3
1）、外植体预处理
将从野外采集的沙田柚带顶芽、侧芽茎用自来水冲洗干净泥沙后置于饱和洗衣粉溶液中浸泡7分钟，再用流动自来水冲洗8小时后胶塑料袋密封后置于5℃冰箱中过夜备用。
2）、培养过程
（1）诱导不定芽：沙田柚带顶芽、侧芽茎经80%酒精消毒5分钟后，用无菌水冲洗4次后置于0.1%的升汞溶液中消毒14分钟，然后用无菌水冲洗5次，经无菌滤纸吸干水分后接种到诱导培养基上,在25℃条件下全暗培养，培养14天后形成不定芽。所采用的诱导培养基为：ms+0.8mg/l6-ba+0.4mg/lnaa+3.0mg/l核黄素+0.1mg/ld-泛酸钙+2.0mg/l抗坏血酸+2.0mg/ll-半胱氨酸+0.03mg/l生物素+3.0%蔗糖+0.35%琼脂，ph值为5.4。
（2）丛生芽增殖培养：将不定芽接种到增殖培养基上进行增殖培养，接种后置于每天光照13小时，光照强度为1200lx，培养温度为27℃的条件下培养，26天转接一次，增殖系数为3～6。所采用的增殖培养基为：ms+1.5mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+3.0mg/l核黄素+0.1mg/ld-泛酸钙+2.0mg/l抗坏血酸+2.0mg/ll-半胱氨酸+0.03mg/l生物素+3.0%蔗糖+0.35%琼脂，ph值为5.4。
（3）试管苗生根：将长至2～4cm的丛生芽分切接种到生根培养基上进行诱导生根，接种后先在25℃条件下全暗培养13天，然后置于每天光照13小时，光照强度为3000lx，培养温度为25℃的条件下培养20天生根，生根率达95%。所采用的生根培养基为：1/2ms+0.8mg/liba+1.0mg/lnaa+2.0mg/l核黄素+0.2mg/ld-泛酸钙+1.0mg/l抗坏血酸+1.0mg/ll-半胱氨酸+0.03mg/l生物素+3.0%蔗糖+0.4%琼脂，ph值为5.4。