本发明涉及一种丹参组织培养中愈伤分化生芽培养工艺。
背景技术：
丹参(salviamiltiorrhizabunge)为唇形科鼠尾草属多年生草本植物，又名紫丹参、血参、大红袍等，全国各地均有分布，是我国传统常用药和多种中成药的主要原料，具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，扩张冠状动脉、改善心肌缺血状况、降低血压、安神静心、降血糖和抗菌等功效。其活性成分主要有两大类：脂溶性二萜类化合物和二为水溶性的多聚酚酸类成分。目前市面上丹参为主要成分的药物有：复方丹参滴丸、复方丹参片、丹参胶囊等。
丹参作为医药行业的重要原料，市场需求量大，而传统的种子繁殖和分根繁殖均存在一定的缺陷。丹参种子贮藏期短，萌发率低；而分根繁殖系数低，且容易携带病虫害。因此丹参面临着品种退化，产量下降等问题。而而利用植物组织培养技术，不仅繁殖系数高，又能能保持原有品种的优良性状，是解决丹参面品种退化，产量下降等问题的重要途径。
植物组织培养技术是根据细胞的全能性，利用离体的组织、器官或细胞、生质体等，通过无菌操作，在适当的培养基和和适宜的外部条件下进行培养获得再生的完整植株的过程。在培养过程中从各器官上产生愈伤组织，愈伤组织再经过再分化形成丛生芽，进而形成完整植株。而愈伤分化形成丛生芽的过程是丹参组织培养过程的重要一步，决定着组培过程中繁殖系数的高低。
技术实现要素：
针对上述存在的问题，本发明旨在提供丹参组织培养中愈伤分化生芽培养工艺，该工艺主要对组织培养中愈伤分化生芽过程中的培养基成分进行优化和改进，减少激素的使用量以及使用种类，使用单一激素成分，可以获得高繁殖系数，且芽长势旺盛，并适合后期培养。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
丹参组织培养中愈伤分化生芽培养工艺，包括以下步骤：
1)培养基的配制
a、激素母液的配制：称取6-ba0.1g，用5ml1mnaoh引溶，再用纯水定容至100ml，即为浓度为1.0mg/ml的6-ba母液；
b、激素抽滤灭菌：将滤膜放进抽滤头，高压灭菌，带进超净台，将iba母液抽滤灭菌，备用；
c、配制培养基基本成分：ms+30g/l蔗糖+5.26g/l琼脂，ph5.8；高压灭菌；带入超净台备用；
d、添加激素：在超净台上用无菌的移液抢吸取6-ba加入到基本培养基里，使其浓度为1.5mg/l，混匀；
e、分装：将添加好激素的培养基分装到无菌的组培瓶中，每瓶30～40ml，成分为：ms+1.5mg/l6-ba+30g/l蔗糖+5.26g/l琼脂，ph5.8；
2)外植体的选择和培养：以丹参叶片为外植体，消毒后，切成0.5*0.5cm大小置于愈伤培养基中培养；
3)愈伤的选择：外植体诱导愈伤28-30天，选择有光泽的愈伤；
4)愈伤的处理；
5)愈伤的接种；
6)丛芽的诱导：接种后的愈伤放置于组培室的组培架上进行丛芽的诱导，培养条件：培养温度27±0.5℃，光照时间12h，光强3000lx，t5植物培养灯管。
作为优选，所述步骤(2)“外植体的选择和培养”培养条件：培养温度(27±0.5℃)，光照时间12h，光强3000lx，t5植物培养灯管。
作为优选，所述步骤(3)“愈伤的选择”选择生长旺盛，绿色或黄绿色有光泽的愈伤带入超净台备用，并用75％酒精棉球擦拭瓶口处。
作为优选，所述步骤(4)“愈伤的处理”是用无菌的镊子将生长良好的愈伤从组培瓶里镊起，置于无菌的接种盘上，用无菌的剪刀或解剖刀去除愈伤中褐化部分，将生长良好的部分切成0.5cm×0.5cm大小。
作为优选，所述步骤(5)“愈伤的接种”是用无菌的镊子将0.5cm×0.5cm愈伤镊起，放置于ms固体培养基上，培养基成分为ms+1.5mg/l6-ba+30g/l蔗糖+5.26g/l琼脂，ph5.8，高压灭菌。
本发明的有益效果是：本发明的优势在于减少激素使用，使用单一激素成分，可以获得高繁殖系数，且芽长势旺盛，并适合后期培养；本发明以ms培养为基本培养基，添加适当浓度的6-ba诱导愈伤分化成丛芽。
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
实施例：丹参组织培养中愈伤分化生芽培养工艺，包括以下步骤：
1)培养基的配制
a、激素母液的配制：称取6-ba0.1g，用5ml1mnaoh引溶，再用纯水定容至100ml，即为浓度为1.0mg/ml的6-ba母液；
b、激素抽滤灭菌：将滤膜放进抽滤头，高压灭菌，带进超净台，将iba母液抽滤灭菌，备用；
c、配制培养基基本成分：ms+30g/l蔗糖+5.26g/l琼脂，ph5.8；高压灭菌；带入超净台备用；
d、添加激素：在超净台上用无菌的移液抢吸取6-ba加入到基本培养基里，使其浓度为1.5mg/l，混匀；
e、分装：将添加好激素的培养基分装到无菌的组培瓶中，每瓶30～40ml，成分为：ms+1.5mg/l6-ba+30g/l蔗糖+5.26g/l琼脂，ph5.8；
2)外植体的选择和培养：以丹参叶片为外植体，消毒后，切成0.5*0.5cm大小置于愈伤培养基中培养，培养条件：培养温度27±0.5℃，光照时间12h，光强3000lx，t5植物培养灯管；
3)愈伤的选择：外植体诱导愈伤1个月左右，选择生长旺盛，绿色或黄绿色有光泽的愈伤带入超净台备用，并用75％酒精棉球擦拭瓶口处；
4)愈伤的处理：用无菌的镊子将生长良好的愈伤从组培瓶里镊起，置于无菌的接种盘上，用无菌的剪刀或解剖刀去除愈伤中褐化部分，将生长良好的部分切成0.5cm×0.5cm大小；
5)愈伤的接种：用无菌的镊子将0.5cm×0.5cm愈伤镊起，放置于ms固体培养基上，培养基成分为ms+1.5mg/l6-ba+30g/l蔗糖+5.26g/l琼脂，ph5.8，高压灭菌；
6)丛芽的诱导：接种后的愈伤放置于组培室的组培架上进行丛芽的诱导，30天后开始统计丛芽诱导的数量、生长情况；培养条件：培养温度(27±0.5℃)，光照时间12h，光强3000lx，t5植物培养灯管。
目前大多所利用的愈伤分化生芽的培养基配方大多以ms培养为基本培养基，组合添加6-ba、2,4-d、naa等几种激素；而经过改良后，只需添加6-ba一种激素，即可达到最佳芽分化结果。
本发明的优势在于减少激素使用，使用单一激素成分，可以获得高繁殖系数，且芽长势旺盛，并适合后期培养。本发明以ms培养为基本培养基，添加适当浓度的6-ba诱导愈伤分化成丛芽；6-ba是广谱多用途的植物生长调节剂，具有促进非分化组织分化的功能；2、4-d和naa常用于愈伤的诱导，2、4-d是一种苯氧化类植物生长调节剂，naa是一种有机萘类植物生长调节剂，两者生理活性都比较高，在低浓度下都可刺激细胞分化；一般情况下植物体内本身就可以产生少量的激素，且在愈伤诱导过程中已经加入了naa和2、4-d，因此在愈伤中已有积累，若再人为加入，则浓度会过高，产生相反效果，会是愈伤不分化甚至褐化；因此，我们只需加入一定量的6-ba就可快速诱导愈伤组织分化丛芽。
在具体实验过程中，本发明以丹参叶片为外植体，在适宜的培养基，适宜的培养条件下诱导出愈伤，选择生长旺盛，质地紧密，颜色为黄绿色的愈伤，切成0.5*0.5cm2小块置于芽分化培养基上。在单一使用6-ba时，我们发现，6-ba浓度低于1.5mg/l时芽分化的启动时间长，且芽分化率随浓度的增高而增加，在浓度为1.5mg/l时，芽分化率高，且启动时间短，而高于1.5mg/l时，虽然启动时间也较短，但是分化率相对较低，且出现玻璃化现象。
表1：不同浓度6-ba对丹参愈伤分化生芽的影响
表1:不同浓度6-ba对丹参愈伤分化生芽的影响
单独使用2,4-d时，浓度低于1.0mg/l时有部分的芽开始分化，高于1.0mg/l时，只有少量的愈伤分化形成芽。说明高浓度的2，4-d可能会抑制愈伤中芽的分化形成。
表2：不同浓度2，4-d对丹参愈伤分化生芽的影响
注:+较差，++较好，+++旺盛
单独使用naa时，浓度低于1.0mg/l时少部分愈伤有芽的分化，愈伤出现褐色的不定根，高于1.0mg/l时，芽分化率开始减少，当浓度为2.5mg/l，几乎没有芽的分化形成，且出现大量的褐色不定根。说明高浓度的naa可以促进不定根的生成，但是不利于芽的形成。
表3：不同浓度naa对丹参愈伤分化生芽的影响
此外，将这三种激素混合使用，观察芽分化的情况。通过实验我们发现，只要添加浓度适合的6-ba，愈伤的芽分化率都比较高，而2，4-d和naa混合使用芽分化率相对较低。从实验步骤的简化和节约成本方面考虑，我们选择单独使用6-ba一种激素，可以达到最优的效果。
表4：不同激素组合因子对丹参愈伤分化生芽的影响
表5：愈伤组织诱导分化生芽工艺优化后培养结果
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。