本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种培养方法，更具体的涉及一种大花胡麻草组织培养方法。
背景技术：
大花胡麻草(centrantheragrandiflorabench.)，玄参科胡麻草属植物，别名化血丹、红根野蚕豆、野蚕豆根、小红药、灵芝草等，主要分布于我国云南、贵州、广西等地及印度、缅甸等地。大花胡麻草生物学特征为全株被刚毛，须根为锈红色，茎部刚硬，具分枝；叶片对生，无叶柄，长圆形或条形，全缘；花腋生，花萼为佛焰苞状，苞片为叶状，花冠为管状，棕黄色。为云南民间名贵的地方中药，药用根，经化学分析鉴定其根部含环烯醚萜苷如桃叶珊瑚苷、玉叶金花苷、8-表番土鳖酸、8-表番土鳖碱、玉叶金花酸、梓醇等化学成分及杜鹃红素、甘露醇等化合物，具有消肿散瘀、止血止痛等作用，可用于治疗女性痛经、闭经及风湿骨痛、跌打损伤，还对心脑血管疾病具有显著疗效，具有很高的开发价值。
由于大花胡麻草根经济价值高，其市场需求逐年增加，而目前野生资源已被大量开采。大花胡麻草对生态环境要求严格，其种子发芽率低，生长慢，远不能满足需求。应用组织培养技术进行快速繁殖并成功生根移栽，对于解决资源紧缺和实现产业化开发具有重要的意义。前人在大花胡麻草的组织培养关键技术环节已进行了相关研究，但其组织培养过程中诸如外植体污染严重、繁殖系数低等问题还没得到有效解决。
技术实现要素：
针对上述现有技术中的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、可操作性强，且可以提高繁殖系数、移栽成活率高的大花胡麻草组织培养方法。
为实现上述目的提供一种大花胡麻草组织培养方法，本发明采用了以下技术方案：
一种大花胡麻草组织培养方法，该方法包括：(1)外植体选择和预处理；(2)种子萌发培养；(3)实生苗分化增殖培养；(4)分割苗诱导生根培养；(5)炼苗与移栽；
所述外植体选择和预处理步骤中，选择野外收集的大花胡麻草种子作为外植体，然后对种子进行预处理；
所述种子萌发培养步骤中，将经过处理的大花胡麻草种子接种于种子萌发培养基进行培养，培养2-3周后获得无菌实生苗；
所述实生苗分化增殖培养步骤中，选择1-2cm高的无菌实生苗在超净工作台上接种于增殖培养基进行继代培养，培养3-4周后获得组培丛芽；
所述分割苗诱导生根培养步骤中，将获得的4-6cm长苗的组培丛芽进行分割处理，将分割苗接种于生根培养基中进行诱导生根培养，获得组培苗；
所述炼苗与移栽步骤中，当根长达到2-5cm时，进行炼苗3-5天，后取出组培苗，进行移栽。
优选的，所述外植体选择和预处理步骤中：在收集的大花胡麻草种子中，挑选种荚未开裂的种子作为外植体，然后进行预处理；
所述预处理包括前处理与消毒灭菌处理步骤；
其中，所述前处理步骤为：先用75wt％酒精擦拭种荚表面，将种子破壳取出后置于灭菌的1.5ml的离心管中，加入1ml无菌水浸泡1-2h，待种子吸足水分后，在1000rpm的条件下离心3-5min，倒掉上清液，准备下一步消毒；
所述消毒灭菌处理步骤为：将前处理后的种子置于超净工作台中，用75％的酒精消毒30-60秒，再用体积浓度为0.1％的升汞浸泡8-10min，后使用无菌水冲洗6-8次。
优选的，所述种子萌发培养步骤中，所述种子萌发培养基为在ms培养基中添加蔗糖20-30g/l、琼脂粉6-7g/l，并调节ph至5.5-6.0所得的培养基；所述培养基置于透明玻璃培养瓶中并给予光照10-12h/天，其中，光照强度为1500-2000lx，温度为25℃±2℃，在此条件下培养2-3周诱导种子萌发出苗。
进一步的，所述的种子萌发培养基的ph调节至5.8。
优选的，所述实生苗分化增殖培养步骤中，所述增殖培养基为在wpm培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)0.4-0.6mg/l、萘乙酸(naa)0.04-0.06mg/l、蔗糖20-30g/l以及琼脂粉6-7g/l，并调节ph至5.5-6.0所得的培养基；所述培养基置于透明玻璃培养瓶中并给予光照12-14h/天，其中，光照强度为1500-2000lx，温度为25℃±2℃。
优选的，所述分割苗诱导生根培养步骤中，所述生根培养基为在wpm培养基中添加萘乙酸(naa)0.1-0.3mg/l，蔗糖20-30g/l以及琼脂粉6-7g/l，并调节ph至5.5-6.0所得的培养基；所述培养基置于透明玻璃培养瓶中并给予光照12-14h/天，光照强度为1500-2000lx，温度为25℃±2℃。
进一步的，所述的wpm培养基以一升为量计算由如下成分组成：nh4no3400mg·l-1，ca(no3)2·4h2o556mg·l-1，k2so4990mg·l-1，cacl2·2h2o96mg·l-1，kh2po4170mg·l-1，na2moo4·2h2o0.25mg·l-1，mgso4·7h2o370mg·l-1，mnso4·h2o22.4mg·l-1，znso4·7h2o8.6mg·l-1，cuso4·5h2o0.25mg·l-1，feso4·7h2o27.8mg·l-1，na2-edta37.3mg·l-1；肌醇100mg·l-1，维生素b11.0mg·l-1，烟酸0.5mg·l-1，维生素b60.5mg·l-1，甘氨酸2.0mg·l-1，蔗糖20g·l-1，琼脂6g·l-1；ph调节至5.8。
进一步的，所述的增殖培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/l、萘乙酸0.05mg/l；所述生根培养基中含有萘乙酸0.2mg/l。
进一步的，所述的种子萌发培养基、增殖培养基、生根培养基中分别含有活性炭0.5-0.8g/l。
优选的，在步骤(4)生根培养结束后，取出的组培苗，先洗净根上的培养基，然后将苗移植到基质中，并用透气盖遮盖，保持空气湿度在85％-90％，至新根长出(约20天)，正常养护，移栽成活率可达80％。
本发明的有益效果在于：
1、本发明改进了外植体消毒程序、分化增殖培养基本培养基及添加激素，提高繁殖效率，具体通过对大花胡麻草组织培养过程中种子消毒方法、增殖培养方法、诱导生根方法进行改进，解决了种子易污染、繁殖系数低、易褐化问题，通过本方法培养出的大花胡麻组培苗繁殖系数高、生长速度快、移栽成活率高；此外，本发明提供的方法简便易行、可操作性强、重现性好。
2、本发明采用一套系统科学的组织培养方法，简化了传统的种子消毒步骤，种子处理更简便，种子成活率更高。
3、本发明根据大花胡麻草的生长习性采取wpm培养基再生苗长势好，繁殖系数高、生长速度快、再生无玻璃化现象。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本技术领域的普通技术人员应该理解的是，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
实施例1
一种大花胡麻草组织培养方法，其首先采用离体组织培养获得组培苗，然后炼苗、移栽即得大花胡麻草种苗，其中离体组织培养包括如下步骤：
(1)、外植体选择和预处理步骤：挑选种荚未开裂的大花胡麻草种子为起始材料，用75％酒精擦拭表面，将种子破壳取出后用作组织培养繁殖的外植体。将该外植体置于灭菌的1.5ml离心管中，加入1ml无菌水浸泡1-2h，待种子吸足水分后，1000rpm离心3-5min，倒掉上清液，在75％的酒精溶液中进行30-60s消毒处理，然后在重量体积比浓度为0.1％的升汞溶液中进行8-10min的杀菌处理，再用无菌水冲洗6-8次，完成对所述大花胡麻草种子的消毒灭菌处理。
(2)、种子萌发培养步骤：在超净工作台上将种子接种于种子萌发培养基进行培养，培养在每天光照10-12h，光照强度为1500-2000lx以及温度为25℃±2℃的条件下进行，培养2-3周，获得无菌实生苗，其中种子培养基为在ms基本培养基中添加有蔗糖25g/l、活性炭0.6g/l、琼脂粉6.5g/l，并调节ph为5.8所得的培养基。
(3)实生苗分化增殖培养步骤：将萌发后1-2cm高的大花胡麻草无菌实生苗接种于增殖培养基，培养3-4周，获得组培丛芽，其中，增殖培养基为在wpm培养基中添加有6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)0.5mg/l、萘乙酸(naa)0.05mg/l、活性炭0.6g/l、蔗糖25g/l以及琼脂粉6.5g/l，并调节ph至5.8所得的培养基。
(4)、分割苗诱导生根培养步骤：将获得的组培丛芽中4-6cm长苗分割后接种于生根培养基中进行生根培养，其中所述生根培养基为在wpm培养基中添加萘乙酸(naa)0.2mg/l，蔗糖25g/l以及活性炭0.6g/l、琼脂粉6.5g/l，并调节ph至5.8所得的培养基。
实施例2
一种大花胡麻草组织培养方法，其首先采用离体组织培养获得组培苗，然后炼苗、移栽即得大花胡麻草种苗，其中离体组织培养包括如下步骤：
(1)、外植体选择和预处理步骤：挑选种荚未开裂的大花胡麻草种子为起始材料，用75％酒精擦拭表面，将种子破壳取出后用作组织培养繁殖的外植体。将该外植体置于灭菌的1.5ml离心管中，加入1ml无菌水浸泡1-2h，待种子吸足水分后，1000rpm离心3-5min，倒掉上清液，在75％的酒精溶液中进行30-60s消毒处理，然后在重量体积比浓度为0.1％的升汞溶液中进行8-10min的杀菌处理，再用无菌水冲洗6-8次，完成对所述大花胡麻草种子的消毒灭菌处理。
(2)、种子萌发培养步骤：在超净工作台上将种子接种于种子萌发培养基进行培养，培养在每天光照10-12h，光照强度为1500-2000lx以及温度为25℃±2℃的条件下进行，培养2-3周，获得无菌实生苗，其中种子培养基为在ms基本培养基中添加有蔗糖30g/l、活性炭0.8g/l、琼脂粉7g/l，并调节ph为6所得的培养基。
(3)实生苗分化增殖培养步骤：将萌发后1-2cm高的大花胡麻草无菌实生苗接种于增殖培养基，培养3-4周，获得组培丛芽，其中，增殖培养基为在wpm培养基中添加有6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)0.6mg/l、萘乙酸(naa)0.06mg/l、活性炭0.8g/l、蔗糖30g/l以及琼脂粉7g/l，并调节ph至6所得的培养基。
(4)、分割苗诱导生根培养步骤：将获得的组培丛芽中4-6cm长苗分割后接种于生根培养基中进行生根培养，其中所述生根培养基为在wpm培养基中添加萘乙酸(naa)0.3mg/l，蔗糖30g/l以及活性炭0.8g/l、琼脂粉7g/l，并调节ph至5.8所得的培养基。
实施例3
一种大花胡麻草组织培养方法，其首先采用离体组织培养获得组培苗，然后炼苗、移栽即得大花胡麻草种苗，其中离体组织培养包括如下步骤：
(1)、外植体选择和预处理步骤：挑选种荚未开裂的大花胡麻草种子为起始材料，用75％酒精擦拭表面，将种子破壳取出后用作组织培养繁殖的外植体。将该外植体置于灭菌的1.5ml离心管中，加入1ml无菌水浸泡1-2h，待种子吸足水分后，1000rpm离心3-5min，倒掉上清液，在75％的酒精溶液中进行30-60s消毒处理，然后在重量体积比浓度为0.1％的升汞溶液中进行8-10min的杀菌处理，再用无菌水冲洗6-8次，完成对所述大花胡麻草种子的消毒灭菌处理。
(2)、种子萌发培养步骤：在超净工作台上将种子接种于种子萌发培养基进行培养，培养在每天光照10-12h，光照强度为1500-2000lx以及温度为25℃±2℃的条件下进行，培养2-3周，获得无菌实生苗，其中种子培养基为在ms基本培养基中添加有蔗糖20g/l、活性炭0.5g/l、琼脂粉6g/l，并调节ph为5.5所得的培养基。
(3)实生苗分化增殖培养步骤：将萌发后1-2cm高的大花胡麻草无菌实生苗接种于增殖培养基，培养3-4周，获得组培丛芽，其中，增殖培养基为在wpm培养基中添加有6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)0.4mg/l、萘乙酸(naa)0.04mg/l、活性炭0.5g/l、蔗糖20g/l以及琼脂粉6g/l，并调节ph至5.5所得的培养基。
(4)、分割苗诱导生根培养步骤：将获得的组培丛芽中4-6cm长苗分割后接种于生根培养基中进行生根培养，其中所述生根培养基为在wpm培养基中添加萘乙酸(naa)0.1mg/l，蔗糖20g/l以及活性炭0.5g/l、琼脂粉6g/l，并调节ph至5.5所得的培养基。
实施例4
本实施例的一种大花胡麻草组织培养方法，其离体组织培养基本步骤同实施例1，不同的是，步骤(3)中，采用的分化增殖培养基的成分为wpm培养基中添加有6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)0.8mg/l、萘乙酸(naa)0.08mg/l、活性炭0.8g/l、蔗糖30g/l以及琼脂粉6.5g/l，并调节ph至5.8所得的培养基。
对比例1
本实施例的一种大花胡麻草组织培养方法，其离体组织培养基本步骤同实施例1，不同的是，所有培养基中均没有添加活性炭。
对比上述实施例1～4及对比例1的培养结果如下：
实施例1至3中，种子消毒后组织培养，无菌率均控制在95％～100％；增殖培养系数为1：4；外植体长势最好，没有玻璃化现象。
实施例4中，种子消毒后组织培养，无菌率控制在95％～100％；增殖培养系数为1：6，在实施例4中发现有的外植体有玻璃化现象。
对比例1中，种子消毒后组织培养，无菌率控制在95％～100％；褐化死亡率明显高于实施例1-4，说明培养基中添加的活性炭对外植体有较好的抗褐化效果，且对离体培养的生长发育几乎无影响。
此外，实施例1～4的移栽成活率可达86％，对比例1的移栽成活率可达80％。
对比例2
本实施例的一种大花胡麻草组织培养方法，其离体组织培养基本步骤同实施例1，不同的是，增殖培养基和生根培养基为ms培养基。
对比上述实施例1～4及对比例2的培养结果如下：
种子消毒后组织培养，无菌率均控制在95％～100％。
实施例1～4中，增殖培养和生根培养基本培养基为wpm培养基，所获得再生苗植株健壮，叶片为健康的绿色，增殖系数大于1：4，移栽成活率均大于80％。
对比例2中，在ms基本培养基上增殖培养效果差，增殖系数小于1：4，叶片发黄，移栽成活率低。
综上可见，本发明通过对大花胡麻草组织培养过程中外植体灭菌方法、分化增殖培养方法、生根培养方法及培养基的选择进行改进，有效解决了大花胡麻草外植体消毒易污染、易褐化等难题，为其快速繁殖提供了有效的技术支持，解决了目前大花胡麻草野生资源少、难繁殖的问题，为满足当前市场需求提供新的途径。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。