本发明属于生物领域，具体涉及一种珍稀濒危植物蒙古沙冬青离体快繁的方法。
背景技术：
蒙古沙冬青，又称大沙冬青，属豆科沙冬青属。主要分布于内蒙古、甘肃、宁夏等地的荒漠地区。它对环境条件适应能力极强，是我国北方荒漠地区唯一一种强旱生常绿阔叶灌木，也是阿拉善荒漠区特有的建群植物，对防沙固沙、防止水土流失、维持当地生态平衡起着重要的作用，具有重要的经济意义和资源价值。但蒙古沙冬青狭小的分布范围和近年来人类活动的破坏，其数量正在不断减少，现已濒临灭绝，被列为国家三级保护植物。蒙古沙冬青自然更新力弱，实生苗移植生根困难，因此采用组织培养的方式进行离体快速繁殖是保护蒙古沙冬青这种珍稀濒危种质资源、解决该物种自然更新能力弱、繁殖困难等问题的有效手段之一。
蒙古沙冬青的离体培养技术始于上世纪80年代。一般采用无菌育苗的方式获得子叶、胚轴或小茎段，选用不同的培养基进行愈伤组织与芽的诱导分化。最早是在1988年，丁晓莉诱导出了愈伤和芽点。慈忠玲等在1994年对愈伤组织和体细胞胚发生过程做过研究，但体细胞胚中途退化，未能发育为完整的植株。1997年蒋志荣等选用无菌苗茎段进行试验,得到了比较合适的诱导芽和根的激素配比。2000年，何丽君等通过对沙冬青无菌实生苗不同部位的外植体进行愈伤组织诱导，直接得到了再生植株，转入到生根培养基中形成完整植株。
近年，有王方琳等在2016年以蒙古沙冬青无菌苗的子叶、茎段为外植体材料，研究了不同激素配比的培养基对不同外植体愈伤组织培养、丛生芽增殖及生根培养的影响，筛选出了适宜各阶段培养的最佳培养基配方。通过部分组织如将子叶切成小片进行愈伤组织培养，再进行芽的诱导与生根以体细胞胚胎发生的方式进行的再生植株诱导，在培养过程中存在许多问题如愈伤组织不易分化且褐化严重，不能多次继代，分化的芽有玻璃化现象，有的虽然也能壮苗生根，却达不到快速繁育等问题。迄今，针对蒙古沙冬青没有经过器官培养途径进行离体快速繁殖的研究报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种珍稀濒危植物蒙古沙冬青离体快繁的方法，以解决现有方法存在愈伤组织诱导中褐化严重、不易分化的问题。
为了使蒙古沙冬青这种生态意义巨大的树种在野外繁殖资源缺少的情况下，能够成功进行繁殖使之能够保存和可持续利用，并能够避免传统的离体培养中存在的诸多问题，缩短培养周期，研发了本发明珍稀濒危植物蒙古沙冬青离体快繁的方法。
本发明技术方案如下：一种珍稀濒危植物蒙古沙冬青离体快繁的方法，包括如下步骤：
a、蒙古沙冬青外植体的获得：
取消毒的蒙古沙冬青种子，在无菌条件下接种到含2.0mg/l6-ba的ms培养基中，黑暗培养7-11d后，切取萌发幼苗的两片子叶节作为外植体；
b、丛生芽的诱导培养：将所述步骤a中得到的外植体近轴面朝上，倾斜插入b5培养基中，黑暗培养，然后用辅助光诱导15—20d；
c、丛生芽的伸长培养：
从子叶节处诱导出丛生芽后，剔除剩余子叶，转接于b5培养基中，黑暗培养，然后用辅助光下伸长培养20—25d；
d、生根培养：
将所述步骤c中长度为2-3cm的丛生芽单株切下转接到b5培养基中培养7-10d后，转接入b5培养基生根培养基中诱导20—30d；
e、扩大繁殖：
切割所述步骤d中获得的完整植株的带腋芽的茎段，转入到含1.0mg/l6-ba和0.2-0.3mg/liaa的b5培养基，黑暗培养，然后用辅助光下伸长培养20—25d；待植株生长到2-3cm，转接入含1.0-2.0mg/liba的1/2b5培养基中诱导生根30—40d。
进一步的，所述步骤a蒙古沙冬青外植体的获得具体步骤为，取萌发的幼苗，上胚轴粗度为3-5mm，保留子叶近胚轴的分生组织部分2-5mm和上胚轴2-4mm，切去了其余部分，然后在两片子叶中间沿胚轴纵向切开，去掉了腋芽，在子叶与胚轴交接处切开2—4个伤口，得到两个子叶节外植体。
进一步的，所述步骤a、步骤b和步骤c中黑暗培养温度为，白天22-26℃，夜间17-21℃。
进一步的，所述步骤b、步骤c、步骤d、步骤e中黑暗培养时间为5-7d。
进一步的，所述步骤b中丛生芽诱导培养基为含1.0mg/l6-ba的b5培养基。
进一步的，所述步骤b和c中辅助光的光周期为14h/d，光强为1000-1500lux。
进一步的，所述步骤c中丛生芽特征为，芽丛生，芽数清晰，芽平均长约0.3-0.5mm。
进一步的，所述步骤c中伸长培养基为含1.0mg/l6-ba和0.2-0.3mg/liaa的b5培养基。
进一步的，所述步骤d中丛生芽的特征为：丛生芽的平均长度为2-3cm。
进一步的，所述步骤d中生根培养基为含1.0-2.0mg/liba的1/2b5培养基。
本发明的优点如下：
（1）本发明与现有的蒙古沙冬青离体培养相比，取子叶节这个部位直接进行丛生芽的诱导，再生根。这个过程不发生愈伤组织从而减少了愈伤组织诱导的步骤，通过子叶节直接培育成不定芽，极大地缩短了离体培养的时间，整个过程从种子萌发、子叶节的获得、丛生芽的诱导与伸长到生根仅需79d。
（2）、在蒙古沙冬青种子萌发初期，施加外源激素6-ba，可以有效地刺激子叶节处潜在的分生细胞不断分裂并打破顶端优势，使子叶节膨大增粗而有利于丛生芽的形成。
（3)、选取萌发7-11d的种子，胚轴较粗壮，很容易从中轴线分离，组织分裂能力最强更有利于丛生芽的形成。
（4）、丛生芽诱导、伸长培养步骤选用了b5培养基，可以极大地减轻蒙古沙冬青离体快繁过程中出现的褐化现象。
（5)、丛生芽诱导、伸长培养、生根培养步骤均采用黑暗培养5-7d后人工辅助光培养，可以极大地减轻每次转换培养基所引起的褐化现象。
（6）、经过丛生芽诱导、伸长、生根获得的蒙古沙冬青完整植株长出的新的带腋芽的茎段，可再次伸长培养并诱导生根形成完整植株，从而达到了快速扩大繁殖的目的。
具体实施方式
以下的实施例可以进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例中ms、b5培养基为现有产品。
实施例1
（1）蒙古沙冬青外植体的获得：将经过常规方法消毒过的蒙古沙冬青种子接种到含有2.0mg/l6-ba的ms培养基中，黑暗培养7-11d后，取萌发的幼苗，上胚轴粗度为3-5mm，保留子叶近胚轴的分生组织部分2-5mm和上胚轴2-4mm，切去其余部分，然后在两片子叶中间沿胚轴纵向切开，去掉腋芽，用解剖刀在子叶与胚轴交接处切开2—4个伤口，得到两个子叶节外植体。
（2）丛生芽的诱导培养：将子叶节的近轴面朝上，倾斜45℃斜插入含1.0mg/l6-ba的b5培养基中，黑暗诱导5-7d，培养温度白天22-26℃，夜间17-21℃，然后人工辅助光诱导15d，丛生芽诱导率78.3%，平均芽数2.6个。
（3)丛生芽的伸长培养：待子叶节出丛生芽长度为0.3-0.5mm时，剔除剩余子叶，转接于含1.0mg/l6-ba和0.2-0.3mg/liaa的b5培养基中，黑暗诱导5-7d，培养温度白天22-26℃，夜间17-21℃，然后人工辅助光诱导20d，丛生芽伸长率60.7%。
（4)生根培养：待丛生芽伸长至2-3cm时，单株切下转接到b5培养基中培养7-10d后，转接入含1.0-2.0mg/liba的1/2b5培养基中诱导20d，生根率达53.1%，平均生根数2.3条。
（5）扩大繁殖：切割获得的完整植株的带腋芽的茎段，转入到含1.0mg/l6-ba和0.2-0.3mg/liaa的b5培养基，黑暗培养5-7d后，人工辅助光下伸长培养20d，伸长率89.8%。待植株生长到2-3cm，转接入含1.0-2.0mg/liba的1/2b5培养基中诱导生根30d，生根率88.2%。
实施例2
与实施例1不同之处在于,步骤（2）丛生芽的诱导培养中辅助光诱导20d。
实施例3
与实施例1不同之处在于,步骤（3)丛生芽的伸长培养中辅助光诱导20d。
将子叶节的近轴面朝上，倾斜45℃斜插入含1.0mg/l6-ba的b5培养基中，黑暗诱导5-7d，培养温度白天22-26℃，夜间17-21℃，然后人工丛生芽诱导率78.3%，平均芽数2.6个。
实施例4
与实施例1不同之处在于,步骤（4)生根培养中转接入b5培养基中诱导30d。
实施例5
与实施例1不同之处在于,步骤（5）扩大繁殖中黑暗培养后用辅助光下伸长培养25d，转接入b5培养基中诱导生根40d。
为证明本发明效果，特作出以下16个对比例：
对比例1：将经过常规方法消毒过的蒙古沙冬青种子接种到ms培养基中，黑暗培养7-11d后取萌发的幼苗，获得子叶节外植体的方法与实施例1相同。将子叶节的近轴面朝上，倾斜45℃斜插入含1.0mg/l6-ba的b5培养基中，黑暗诱导5-7d后人工辅助光诱导15d，丛生芽诱导率18.5%，平均芽数0.4个。
对比例2
将经过常规方法消毒过的蒙古沙冬青种子接种到含有1.0mg/l6-ba的ms培养基中，黑暗培养7-11d后取萌发的幼苗，获得子叶节外植体的方法与实施例1相同。将子叶节的近轴面朝上，倾斜45℃斜插入含1.0mg/l6-ba的b5培养基中，黑暗诱导5-7d后人工辅助光诱导15d，丛生芽诱导率36.7%，平均芽数1.48个。
对比例3
将经过常规方法消毒过的蒙古沙冬青种子接种到含有3.0mg/l6-ba的ms培养基中，黑暗培养7-11d后取萌发的幼苗，获得子叶节外植体的方法与实施例1相同。将子叶节的近轴面朝上，倾斜45℃斜插入含1.0mg/l6-ba的b5培养基中，黑暗诱导5-7d后人工辅助光诱导15d，丛生芽诱导率79.6%，平均芽数2.8个。
对比例4
将经过常规方法消毒过的蒙古沙冬青种子接种到含有5.0mg/l6-ba的ms培养基中，黑暗培养7-11d后取萌发的幼苗，获得子叶节外植体的方法与实施例1相同。将子叶节的近轴面朝上，倾斜45℃斜插入含1.0mg/l6-ba的b5培养基中，黑暗诱导5-7d后人工辅助光诱导15d，丛生芽诱导率79.3%，平均芽数5.2个。
对比例5
将经过常规方法消毒过的蒙古沙冬青种子接种到含有2.0mg/l6-ba的ms培养基中，黑暗培养1-5d后取萌发的幼苗，获得子叶节外植体的方法与实施例1相同。将子叶节的近轴面朝上，倾斜45℃斜插入含1.0mg/l6-ba的b5培养基中，黑暗诱导5-7d后人工辅助光诱导15d，丛生芽诱导率26.9%，平均芽数2个。
对比例6
将经过常规方法消毒过的蒙古沙冬青种子接种到含有2.0mg/l6-ba的ms培养基中，黑暗培养13-15d后取萌发的幼苗，获得子叶节外植体的方法与实施例1相同。将子叶节的近轴面朝上，倾斜45℃斜插入含1.0mg/l6-ba的b5培养基中，黑暗诱导5-7d后人工辅助光诱导15d，丛生芽诱导率39.3%，平均芽数1.72个。
对比例7
将经过常规方法消毒过的蒙古沙冬青种子接种到含有2.0mg/l6-ba的ms培养基中，黑暗培养7-11d后取萌发的幼苗，获得子叶节外植体的方法与实施例1相同。将子叶节的近轴面朝上，倾斜45℃斜插入含1.0mg/l6-ba的ms培养基中，黑暗诱导5-7d后人工辅助光诱导15d，丛生芽诱导率76.6%，平均芽数2.5个。
对比例8
将经过常规方法消毒过的蒙古沙冬青种子接种到含有2.0mg/l6-ba的ms培养基中，黑暗培养7-11d后取萌发的幼苗，获得子叶节外植体的方法与实施例1相同。将子叶节的近轴面朝上，倾斜45℃斜插入含0.5mg/l6-ba的b5培养基中，黑暗诱导5-7d后人工辅助光诱导15d，丛生芽诱导率73.9%，平均芽数1.45个。
对比例9
将经过常规方法消毒过的蒙古沙冬青种子接种到含有2.0mg/l6-ba的ms培养基中，黑暗培养7-11d后取萌发的幼苗，获得子叶节外植体的方法与实施例1相同。将子叶节的近轴面朝上，倾斜45℃斜插入含1.5mg/l6-ba的b5培养基中，黑暗诱导5-7d后人工辅助光诱导15d，丛生芽诱导率78.9%，平均芽数3.4个。
对比例10
将经过常规方法消毒过的蒙古沙冬青种子接种到含有2.0mg/l6-ba的ms培养基中，黑暗培养7-11d后取萌发的幼苗，获得子叶节外植体的方法与实施例1相同。将子叶节的近轴面朝上，倾斜45℃斜插入含2.5mg/l6-ba的b5培养基中，黑暗诱导5-7d后人工辅助光诱导15d，丛生芽诱导率79.6%，平均芽数4.3个。
对比例11
经过种子萌发、丛生芽诱导的蒙古沙冬青丛生芽（方法和条件与实施例1相同），与实施例1的区别在于待子叶节出丛生芽长度为0.3-0.5mm时，剔除剩余子叶，转接于含1.0mg/l6-ba和0.1-0.3mg/lga3的b5培养基中，黑暗诱导5-7d后人工辅助光诱导20d，丛生芽伸长率18.5%。
对比例12
经过种子萌发、丛生芽诱导的蒙古沙冬青丛生芽（方法和条件与实施例1相同），与实施例1的区别在于待子叶节出丛生芽长度为0.3-0.5mm时，剔除剩余子叶，转接于含1.0mg/l6-ba和0.5mg/lga3的b5培养基中，黑暗诱导5-7d后人工辅助光诱导20d，丛生芽伸长率5.0%。
对比例13
经过种子萌发、丛生芽诱导与伸长后的蒙古沙冬青丛生芽（方法和条件与实施例1相同），与实施例1的区别在于待丛生芽伸长至2-3cm时，单株切下转接到b5培养基中培养7-10d后，转接入含0.5mg/liba的1/2b5培养基中诱导20d，生根率达40.7%，平均生根数1条。
对比例14
经过种子萌发、丛生芽诱导与伸长后的蒙古沙冬青丛生芽（方法和条件与实施例1相同），与实施例1的区别在于待丛生芽伸长至2-3cm时，单株切下转接到b5培养基中培养7-10d后，转接入含1.0-2.0mg/liaa的1/2b5培养基中诱导20d，生根率达28.9%，平均生根数1条。
对比例15
经过种子萌发、丛生芽诱导与伸长后的蒙古沙冬青丛生芽（方法和条件与实施例1相同），与实施例1的区别在于待丛生芽伸长至2-3cm时，单株切下转接到b5培养基中培养7-10d后，转接入含1.0-2.0mg/lnaa的1/2b5培养基中诱导20d，生根率达30.63%，平均生根数1.2条。
对比例16
经过种子萌发、丛生芽诱导与伸长后的蒙古沙冬青丛生芽（方法和条件与实施例1相同），与实施例1的区别在于待丛生芽伸长至2-3cm时，单株切下转接到b5培养基中培养7-10d后，转接入含1.5-2.0mg/liaa和0.5mg/lnaa的1/2b5培养基中诱导20d，生根率达42.6%，平均生根数1.8条。
对比例1-4说明，与实施例1将蒙古沙冬青种子接种到含有2.0mg/l6-ba的ms培养基中不同，将种子接种到不含有6-ba或含有1.0mg/l6-ba的ms培养基中，获得的子叶节胚轴细弱，用于丛生芽诱导时，诱导率低，芽数少。将种子接种到含有3.0mg/l6-ba的ms培养基中，获得的子叶节用于丛生芽诱导时，诱导率与实施例1相差仅1.3%，平均芽数仅相差0.2个，但是丛生芽中部分叶片出现畸形，不利于后期生长发育。将种子接种到含有5.0mg/l6-ba的ms培养基中，获得的子叶节用于丛生芽诱导时，诱导率与实施例1相差仅1.0%，平均芽数虽比实施例1多1倍，但是6-ba浓度也相应的增加到了2.5倍，生产成本增加，且丛生芽多细密呈簇状，后期生长无有效芽。
对比例5-6说明，与实施例1种子黑暗培养7-11d不同，种子黑暗培养时间为1-5d，培养1d时，由于萌发时间短，种皮未自然脱落，胚轴未伸出，两片子叶较难分离。3d-5d时，子叶黄色，胚轴有伸长但较短且细弱，获取子叶节外植体时容易断裂，用于丛生芽诱导时，诱导率低。种子黑暗培养13-15d，子叶节处分生组织的分生能力减弱，使得丛生芽诱导降低，平均芽数降低。
对比例7说明，与实施例1将子叶节接种于含1.0mg/l6-ba的b5培养基中不同，将子叶节接种于含有相同浓度6-ba的ms培养基中，丛生芽诱导率与实施例1仅相差1.7%，平均芽数仅相差0.1个，但是使用ms培养基，生长20d时叶缘、芽有褐化现象，转入伸长培养基易褐化死亡。
对比例8-10说明，与实施例1将子叶节接含1.0mg/l6-ba的b5培养基中不同，将子叶节接种于含有0.5mg/l6-ba的b5培养基中，平均芽数较少。将子叶节接种于含有1.5mg/l6-ba的b5培养基中，丛生芽诱导率与实施例1相差仅0.6%，平均芽数虽多0.8个，但是丛生芽多成簇状，后期生长发育中虽有茎叶，但部分为畸形叶。对比例10将子叶节接种于含有2.5mg/l6-ba的b5培养基中，丛生芽诱导率与实施例1相差仅1.3%，平均芽数虽比实施例1增加了约1.6倍，但是6-ba浓度也相应的增加到了2.5倍，生产成本增加，且丛生芽多细密呈簇状，后期生长无有效芽。
对比例11-12说明，与实施例1将诱导出的丛生芽转接于含1.0mg/l6-ba和0.2-0.3mg/liaa的b5培养基中不同，将诱导出的丛生芽转接于含1.0mg/l6-ba和0.1-0.3mg/l的ga3的b5培养基中，叶片细长，茎叶呈黄绿略带透明，呈玻璃化，茎伸长率低。将诱导出的丛生芽转接于含1.0mg/l的6-ba和0.5mg/l的ga3的b5培养基中，叶片增长增宽，叶片黄绿透明呈玻璃化，茎伸长率低。
对比例13-16说明，与实施例1将单株丛生芽转接入含1.0-2.0mg/l的iba的1/2b5培养基不同，将将单株丛生芽转接入含0.5mg/l的iba、1.0-2.0mg/l的iaa、1.0-2.0mg/l的naa、1.5-2.0mg/liaa和0.5mg/lnaa的1/2b5培养基均不利于单株芽生根，生根率较低且生根数较少。