嘉定白蒜组培鳞茎快繁方法与流程

本发明涉及一种组织培养快速繁殖技术，尤其是指嘉定白蒜组培鳞茎快繁方法。

背景技术：

大蒜曾经是我国出口历史长、出口量大的重要农产品。其中，嘉定白蒜闻名遐迩，其在国内乃至东南亚市场以其色泽白、蒜头肥大、肉质脆嫩、辛辣味浓、耐久储存等独有的特点，曾为当地农民的增产创收发挥重要作用。大蒜是百合科葱属的一种无性繁殖作物，生产栽培主要用鳞茎作为繁殖材料。这不仅繁殖系数低，而且繁殖器官也是产品器官，栽培成本高。而且病毒等病原物极易通过种蒜积累和传播，对大蒜生产构成严重威胁。近二十年来由于多种因素的制约，大蒜的种子和出口每况愈下。其中除种植结构调整，农民种植效益驱动外，品种退化，蒜头质量下降，符合出口标准的蒜头比例低是根本原因。随着大蒜种植面积集中，受连作种植留种因素影响，大蒜感染病毒呈现逐代积累趋势，造成品种急剧退化。显然传统留种方式在当前土地资源紧缺的条件下已不足以抵御病毒病危害和持续发挥大蒜的品种优势，采用现代生物技术回复和改良大蒜的种性刻不容缓。

中国专利公开号cn1238122a公开了一种大蒜脱毒组培苗的培养基，是以b5、ms基础培养基辅以高浓度6ba、naa以及ph值5.6-6.0等因素，研究适合玉林大蒜的组培培养,其中只涉及出芽数和出芽率的实验统计，并未涉及大蒜鳞茎快繁研究。而大蒜组培苗的移栽成活率是大蒜脱毒苗工厂化生产应用的关键，组培苗移栽成活率不足40%，但我们培养的组培脱毒鳞茎球移栽成活率高达95%以上，发明重点在脱毒大蒜组培快繁鳞茎技术的生产应用。中国专利申请号95116060.5公开了利用植物组织培养技术大规模生产无病毒种蒜的方法。该方法采用ms基础培养基，鳞茎形成要求在4℃温度下无菌预处理2个月，制冷成本高，生产操作指导性不强。本发明重点在ms改良后大量元素、钙盐等减量控制、在温度18-20℃的适宜环境下，节约成本、实现规模化生产。

技术实现要素：

本发明的目的在于：提供一种嘉定白蒜组培鳞茎快繁方法，利用组织培养技术对嘉定白蒜进行工厂化离体快繁。

本发明的再一目的是：提供一种适合嘉定白蒜的培养基。

本发明目的通过下述方案实现：一种嘉定白蒜组培鳞茎快繁方法，包括：外植体消毒、脱毒无菌苗的建立、试管苗的繁殖、生根培养和移栽，其中：采用鳞茎生根培养，所述的鳞茎生根培养是将试管苗单株按株高3-4cm、茎粗0.2-0.4cm的标准，切除枯萎黄化老叶，转接到鳞茎生根培养基上，培养温度16℃-22℃，光照强度500-800lux，湿度50%-60%，培养50天至植株叶片部分完全枯萎，得到组培脱毒鳞茎，其球鳞茎内部叶片组织消失，鳞茎球长实，大小0.6-0.8cm，形成肉质大蒜，根长4-6cm；所述的鳞茎生根培养基（jd-3）为ms+附加6-ba0-1.0mg/l、kt0-0.2mg/l、zt0-0.05mg/l、naa0-0.2mg/l、白砂糖100g/l+琼脂5.0g/l。

在上述方案基础上，jd-3为改良ms培养基（kno30.95-1.43g/l，nh4no30.81-1.24g/l，mgso4·7h2o0.19-0.28g/l，kh2po40.09-0.13g/l，cacl2·2h2o0.22-0.44g/l，na2edta·2h2o0.002-0.04g/l,feso4·7h2o0.015-0.03g/l,mnso4·h2o8.45-16.9mg/l，h3bo33.1-6.2mg/l，znso4·7h2o4.3-8.6mg/l，ki0.42-0.83mg/l，na2moo4·2h2o0.13-0.25mg/l，cocl2·6h2o0.01-0.025mg/l，cuso4·5h2o0.01-0.025mg/l，肌醇5-10mg/l,烟酸0.025-0.05mg/l，盐酸硫胺素0.005-0.01mg/l，盐酸吡哆醇0.025-0.05mg/l），附加6-ba0-1.0mg/l、kt0-0.2mg/l、zt0-0.05mg/l、naa0-0.2mg/l、白砂糖100g/l+琼脂5.0g/l，ph值调至6.5-7.0。

在上述方案基础上，所述外植体消毒是把大蒜鳞茎剥去大蒜皮，用自来水冲洗干净，再用75%酒精消毒60秒左右，倒出酒精后用无菌水冲洗2-3次，然后再用20%的次氯酸钠溶液消毒10-20min，最后用无菌水冲洗4-5次，完成外植体消毒。

在上述方案基础上，所述的脱毒无菌苗的建立是把消毒好的大蒜外植体，将大蒜蒜瓣切去上半部分，剥去下半部分外围包裹的大蒜肉质组织，露出蒜心中部的蒜芽，其带底盘高度为1.5-2cm，将蒜芽外层包裹的蒜叶一层一层剥除，在解剖镜下剥生长点，切取0.2mm左右大小的微茎尖，接种在脱毒无菌苗培养基（jd-1）上培养，经暗培养5-7天后转光培养，培养温度23-25℃，光照强度1000-2000lux，光照时间14-16小时/天，微茎尖经过60天的上述培养获得脱毒组培苗，培养成活率不小于70%，所述的脱毒无菌苗培养基作为启动培养基，由ms+6-ba0-1.0mg/l+白砂糖30g/l+琼脂5.0g/l组成；

在上述方案基础上，jd-1为改良ms培养基（kno30.95-1.43g/l，nh4no30.81-1.24g/l，mgso4·7h2o0.19-0.28g/l，kh2po40.09-0.13g/l，cacl2·2h2o0.22-0.44g/l，na2edta·2h2o0.002-0.04g/l,feso4·7h2o0.015-0.03g/l,mnso4·h2o8.45-16.9mg/l，h3bo33.1-6.2mg/l，znso4·7h2o4.3-8.6mg/l，ki0.42-0.83mg/l，na2moo4·2h2o0.13-0.25mg/l，cocl2·6h2o0.01-0.025mg/l，cuso4·5h2o0.01-0.025mg/l，肌醇5-10mg/l,烟酸0.025-0.05mg/l，盐酸硫胺素0.005-0.01mg/l，盐酸吡哆醇0.025-0.05mg/l），附加6-ba0-1.0mg/l、白砂糖30g/l+琼脂5.0g/l，ph值调至6.5-7.0。

所述的试管苗的繁殖是将上述脱毒组培苗按1-2cm株高的单株方式切割接种在试管苗培养基（jd-2）上，以芽繁芽的腋芽繁殖方式进行继代分化培养，培养温度23-25度，光照强度2000-3000lux，湿度50%-60%，光照时间14-16小时每天培养28天，增殖比例在2.5-3.5之间，得单株，所述的试管苗培养基为：ms+附加6-ba0-1.0mg/l、矮壮素0-0.5mg/l、iba0.02mg/l、白砂糖30g/l+琼脂5.0g/l；

在上述方案基础上，jd-2是改良ms培养基（kno30.95-1.43g/l，nh4no30.81-1.24g/l，mgso4·7h2o0.19-0.28g/l，kh2po40.09-0.13g/l，cacl2·2h2o0.22-0.44g/l，na2edta·2h2o0.002-0.04g/l,feso4·7h2o0.015-0.03g/l,mnso4·h2o8.45-16.9mg/l，h3bo33.1-6.2mg/l，znso4·7h2o4.3-8.6mg/l，ki0.42-0.83mg/l，na2moo4·2h2o0.13-0.25mg/l，cocl2·6h2o0.01-0.025mg/l，cuso4·5h2o0.01-0.025mg/l，肌醇5-10mg/l,烟酸0.025-0.05mg/l，盐酸硫胺素0.005-0.01mg/l，盐酸吡哆醇0.025-0.05mg/l），附加6-ba0-1.0mg/l、矮壮素0-0.5mg/l、iba0.02mg/l、白砂糖30g/l+琼脂5.0g/l，ph值调至6.5-7.0。

所述的移栽采用低温预处理移栽，将在鳞茎生根培养基（jd-3）上培养50天形成的组培脱毒鳞茎球出瓶，进行清洗，保存在4-10℃低温下处理4-6周时间，可移栽到50孔穴盘上进行育苗。

所述的育苗基质采用轻基质混合有机肥，混合比例9:1，出苗成活率达95%以上。

本发明的优越性在于：本发明通过大蒜鳞茎茎尖培养可有效脱去大蒜体内的病毒，再对脱毒大蒜进行组织培养，可快速繁殖组培鳞茎，实现工厂化规模育苗，在保持嘉定白蒜优良遗传特性的同时，有效抵御病毒危害，提高地方农民种植积极性，以恢复我国大蒜国际市场竞争地位。出苗成活率可达95%以上。

附图说明

附图1，为外植体蒜芽高度约1.5-2cm（带底盘）照片；

附图2，为切取0.2mm左右大小的微茎尖照片；

附图3，启动培养60天获得脱毒组培苗；

附图4，快繁培养28天；

附图5，单株培养鳞茎；

附图6，鳞茎内部仍清晰可见叶片组织；

图7，鳞茎内部叶片组织消失，鳞茎球长实。

附图8，培养50天鳞茎形成可移栽。

具体实施方式

一种嘉定白蒜组培鳞茎快繁方法，包括：外植体消毒、脱毒无菌苗的建立、试管苗的繁殖、生根培养和移栽，其中：

所述外植体消毒是把大蒜鳞茎剥去大蒜皮，用自来水冲洗干净，再用75%酒精消毒60秒左右，倒出酒精后用无菌水冲洗2~3次，然后再用20%的次录酸钠溶液消毒10-20min，最后用无菌水冲洗4~5次，外植体消毒完毕。

脱毒无菌苗的建立是把消毒好的大蒜外植体，将大蒜蒜瓣切去上半部分，剥去下半部分外围包裹的大蒜肉质组织，露出蒜心中部的蒜芽高度约1.5~2cm（带底盘），如图1所示，将蒜芽外层包裹的蒜叶一层一层剥除，在解剖镜下剥生长点，切取0.2mm左右大小的微茎尖（如图2所示），接种在jd1上培养，经暗培养5~7天后转光培养，培养温度23~25度，光照强度1000~2000lux，光照时间14~16小时每天。微茎尖经过60天的上述培养获得脱毒组培苗（如图3所示），培养成活率达70%以上。

jd-1是改良ms培养基（kno30.95-1.43g/l，nh4no30.81-1.24g/l，mgso4·7h2o0.19-0.28g/l，kh2po40.09-0.13g/l，cacl2·2h2o0.22-0.44g/l，na2edta·2h2o0.002-0.04g/l,feso4·7h2o0.015-0.03g/l,mnso4·h2o8.45-16.9mg/l，h3bo33.1-6.2mg/l，znso4·7h2o4.3-8.6mg/l，ki0.42-0.83mg/l，na2moo4·2h2o0.13-0.25mg/l，cocl2·6h2o0.01-0.025mg/l，cuso4·5h2o0.01-0.025mg/l，肌醇5-10mg/l,烟酸0.025-0.05mg/l，盐酸硫胺素0.005-0.01mg/l，盐酸吡哆醇0.025-0.05mg/l），附加6-ba0-1.0mg/l、白砂糖30g/l+琼脂5.0g/l，ph值调至6.5~7.0。

试管苗的繁殖是将在启动培养jd1培养基上生长出的脱毒组培苗，按1~2cm株高的单株方式切割接种在由ms改良的扩繁培养基jd-2上，以芽繁芽的腋芽繁殖方式进行继代分化培养。培养温度23~25度，光照强度2000~3000lux，湿度50%~60%，光照时间14~16小时每天培养28天（如图4），增殖比例在2.5~3.5之间。

jd-2是改良ms培养基（kno30.95-1.43g/l，nh4no30.81-1.24g/l，mgso4·7h2o0.19-0.28g/l，kh2po40.09-0.13g/l，cacl2·2h2o0.22-0.44g/l，na2edta·2h2o0.002-0.04g/l,feso4·7h2o0.015-0.03g/l,mnso4·h2o8.45-16.9mg/l，h3bo33.1-6.2mg/l，znso4·7h2o4.3-8.6mg/l，ki0.42-0.83mg/l，na2moo4·2h2o0.13-0.25mg/l，cocl2·6h2o0.01-0.025mg/l，cuso4·5h2o0.01-0.025mg/l，肌醇5-10mg/l,烟酸0.025-0.05mg/l，盐酸硫胺素0.005-0.01mg/l，盐酸吡哆醇0.025-0.05mg/l），附加6-ba0-1.0mg/l、矮壮素0~0.5mg/l、iba0.02mg/l、白砂糖30g/l+琼脂5.0g/l，ph值调至6.5~7.0。

试管鳞茎生根培养是将在jd-2上培养产生的单株，按株高达到3~4cm，茎粗0.2~0.4cm的标准，切除枯萎黄化老叶，转接到jd-3培养基上（如图5），培养温度16℃~22℃，光照强度500~800lux，湿度50%~60%，培养14天，茎基本开始膨大，外观可见直径0.3~0.5cm大小的鳞茎，根原基形成；培养35天，植株叶片部分开始枯萎，营养向基部输送，鳞茎球膨大至0.5~0.7cm，鳞茎内部仍清晰可见叶片组织（如图6），单株生根3~5根，根长2-4cm；培养50天左右植株叶片部分完全枯萎，鳞茎内部叶片组织消失，鳞茎球长实（如图7），大小0.6~0.8cm，形成肉质大蒜，满足组培鳞茎移栽要求（如图8）。

jd-3培养基，改良ms培养基（kno30.95-1.43g/l，nh4no30.81-1.24g/l，mgso4·7h2o0.19-0.28g/l，kh2po40.09-0.13g/l，cacl2·2h2o0.22-0.44g/l，na2edta·2h2o0.002-0.04g/l,feso4·7h2o0.015-0.03g/l,mnso4·h2o8.45-16.9mg/l，h3bo33.1-6.2mg/l，znso4·7h2o4.3-8.6mg/l，ki0.42-0.83mg/l，na2moo4·2h2o0.13-0.25mg/l，cocl2·6h2o0.01-0.025mg/l，cuso4·5h2o0.01-0.025mg/l，肌醇5-10mg/l,烟酸0.025-0.05mg/l，盐酸硫胺素0.005-0.01mg/l，盐酸吡哆醇0.025-0.05mg/l），附加6-ba0-1.0mg/l、kt0~0.2mg/l、zt0~0.05mg/l、naa0~0.2mg/l、白砂糖100g/l+琼脂5.0g/l，ph值调至6.5~7.0。

低温预处理移栽，将jd-3培养基上培养50天形成的组培脱毒鳞茎球出瓶，进行清洗。保存在4~10℃低温下处理4~6周时间，可移栽到50孔穴盘上进行育苗，育苗基质采用轻基质混合有机肥混合比例9:1。

本实施例中，轻基质由泥炭、珍珠岩、蛭石、椰糠按质量比6~9:0~2:0~1:0~1混合；有机肥由猪粪、羊粪按比6~9:1~3混合，出苗成活率达95%以上。