一种以鳞茎片为外植体构建大蒜微繁的方法
【专利说明】一种以鱗茎片为外植体构建大蒜微繁的方法
[0001] 本专利得到天津市农委重点项目（201302030)和天津师范大学应用开发研究基金 资助。
技术领域
[0002] 本发明属于蔬菜种植技术领域，涉及一种以鳞茎片为外植体构建大蒜微繁的方 法。
【背景技术】
[0003]大蒜作为无性繁殖作物，生产上多以大蒜瓣为种子进行种植，生产成本高、繁殖系 数低、病毒积累、种性退化等问题严重影响大蒜生产(徐培文，2006)。寻找大蒜快繁、脱毒 以及种质遗传改良技术迫在眉睫。前人工作中构建了多种大蒜快繁脱毒技术体系，如用大 蒜幼叶、全展叶根尖、茎尖、花序轴等为外植体构建大蒜组织培养体系；张昌伟等（2004)通 过大蒜根尖诱导不定芽得到试管苗并成功的得到了试管鳞茎；Luciani等（2006)以大蒜 茎尖为外植体诱导出再生能力较强的愈伤组织；张素芝等（2006)利用大蒜茎盘进行愈伤 组织的诱导，并获得了适宜于愈伤组织增殖分化的培养基。众多研究多以获得高效试管苗 为主要目标，但对由这些再生植株从苗期到大蒜成熟期的完整培养体系报道较少，尤其未 见在第一代获得高分辨率大蒜的报道。实践证明，大蒜从组培苗到获得地下鳞茎需要时 间较长，栽培条件要求高，更大的问题是，一般第一代组培苗，种植一个季节多收获独头蒜 (Ljiljana等，2014)，在某种程度上影响着大蒜的进一步扩繁。本发明通过优化愈伤组织诱 导、再分化的培养条件，增加壮芽培养过程、组培苗越冬前移栽以及改善栽培过程管理等措 施，成功构建了能够在第一代收获分瓣率高达94%大蒜鳞茎的技术体系，为大蒜的生产和 遗传改良提供重要的技术资料。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为了获得一种大蒜快繁技术体系，解决用蒜瓣种蒜成本高、由试 管苗繁殖成活率低的问题，本发明通过对愈伤组织诱导的不定芽进行壮芽培养、调整试管 苗移栽方式等，构建一个在第一代收获高分瓣率大蒜新的、完整的技术体系。
[0005]为实现红色那个数目的，本发明公开了一种以鳞茎片为外植体构建大蒜微繁的方 法，其特征在于按如下的步骤进行： (1) 外植体的获得： 选取生长健壮、无病虫害、自然结束休眠后的大蒜蒜头，剥去外面鳞叶，用自来水冲洗 20min，用0.l%(w/w)升萊浸泡IOmin,无菌水冲洗3次，再在75%(w/w)酒精中浸泡5min，杀 灭表面细菌,无菌水冲洗3次，再用滤纸吸干备用； (2) 大蒜愈伤组织诱导： 在超净台上将大蒜鳞茎切2_厚薄片，接种到愈伤组织诱导培养基中，置人工气候箱 中培养：日温25°C，夜温20°C，光照强度为1500Lux，光照时间14h/d，6-14天后在外植 体上形成微小的愈伤组织颗粒，接种25-30天后外植体上已经形成大量的愈伤组织颗粒； (3) 愈伤组织继代及不定芽分化： 将生长旺盛的愈伤组织切下，接种到新鲜的继代培养基中进行继代培养，25天之后愈 伤组织增殖明显，在同样培养基上再继代一次，挑选生长状况良好的愈伤组织颗粒转移到 不定芽分化的培养基上进行分化培养，经过10-12天的分化培养，逐渐分化出生长健壮、颜 色浓绿的不定芽；其中 所述的愈伤组织诱导培养基、继代培养基指的是：MS+1. 5mg/L2, 4-D+0. 5mg/LKT; 所述的不定芽分化的培养基指的是：MS+5mg/L6-BA+l.Omg/LNAA; (4) 壮芽培养： 将分化培养基中诱导出来的愈伤组织和嫩芽一起转移到壮芽培养基或生根培养基中 进行30-32d壮芽培养；所述的壮芽培养基指的是：MS+1. 0mg/LKT+1.Omg/LGA+0. 2mg/L NAA+2. 0mg/L6-BA; (5) 生根培养： 将健壮、浓绿的不定芽转移到生根培养基中诱导生根，约4周后不定芽长出数条实生 根，形成完整的试管苗； 所述的生根培养指的是不加激素的MS基础培养基； (6) 试管苗经过室内和田间拱棚中两次练苗，冬前移栽到土壤中，翌年在第一代收获再 生地下鳞茎.把愈伤组织诱导的苗种植到大田土壤中，地上部分长苗，地下部分膨大形成 蒜头--即地下鳞茎，由于愈伤组织苗为再生苗，所以由再生苗长成的蒜头即为地下再生 鳞茎。
[0006] 所述的两次练苗指的是：第一次练苗将培养瓶的盖子打开，在培养室中练苗培养 一周；第二次练苗指的是将经过第一次练苗后的试管苗从培养瓶中取出，洗去根部培养基， 剪掉枯黄的叶子，移栽至装有灭菌的珍珠岩、蛭石和泥炭土（ 1:3:6)的培养钵中，在10月初 放置田间小拱棚中，晴好天气揭开小拱棚的薄膜通风，约30d后，试管苗再次长出新根数 条，这时第二次练苗结束，可以进行大田移栽；越冬前移栽到土壤中指的是：1〇月底，日平 均气温KTC以上的时候，把经过两次练苗的试管苗移栽到大田中，这里的土壤没有其它别 要求，只要是一般的土壤就行。
[0007] 本发明更进一步公开了以鳞茎片为外植体构建大蒜微繁方法在提高试管苗诱导 率方面的应用。实验结果显示：本发明的方法为组培苗生根打下基础，提高了试管苗的诱导 率。
[0008] 本发明更加详细的描述如下： 一、试管苗的诱导培养体系 1、外植体的获得 供试材料为天津宝坻六瓣红大蒜satiras?L.):选取生长健壮、无病虫害、自 然结束休眠后的大蒜蒜头，剥去外面鳞叶，选取个大、饱满、无病斑的大蒜蒜瓣，用自来水冲 洗20min,用滤纸吸干大蒜瓣表面的水分,用0. 1%升萊浸泡IOmin,无菌水冲洗3次,用滤纸 将大蒜表面的水分擦干，再在75%酒精中浸泡5min，杀灭表面细菌，无菌水冲洗3次，再用滤 纸吸干备用。
[0009] 、大蒜愈伤组织诱导 在超净台上将大蒜鳞茎切2mm厚薄片，接种到愈伤组织诱导培养基（MS+1.5mg/L2,4-D+0. 5mg/LKT)中，置人工气候箱中培养：日温25°C，夜温20°C，光照强度为1500 Lux，光照时间14h/d。6天后外植体表面结构变得疏松，四周组织逐渐变得水润且呈现浅 黄色。接种14天后在外植体上形成微小的愈伤组织颗粒，接种25-30天后外植体上已经形 成大量的愈伤组织颗粒（图1)。观察、统计愈伤组织诱导率。大约4周左右全部外植体均可 诱导出愈伤组织。
[0010] 、愈伤组织继代及不定芽分化 将生长旺盛的浅黄色愈伤组织（图2a)切下，接种到新鲜的继代培养基（同愈伤组织诱 导培养基)中进行继代培养（图2b)，25天之后愈伤组织增殖明显，颗粒饱满有光泽（图2c)， 在同样培养基上再继代一次。挑选生长状况良好的愈伤组织颗粒转移到不定芽分化的培养 基（MS+5mg/L6-BA+1.0mg/LNAA)上进行分化培养（图2d)，经过10天左右的分化培养，在 愈伤组织表面长出许多绿点和小绿芽（图2e)，随后逐渐分化出一定数目、生长健壮、颜色 浓绿的不定芽（图2f-i) 4、壮芽培养 为了提高分化培养基分化出来的不定芽的利用率，本发明中增加了壮芽培养阶段。将 分化培养基中诱导出来的带绿点愈伤组织和嫩芽一起转移到壮芽培养基(MS+1. 0mg/L KT+l.Omg/LGA+0.2mg/LNAA+2.0mg/L6-BA)中进行壮芽培养（图3a)，经过一段时间培 养，绿点也逐渐长成不定芽，原有的不定芽变健壮（图3b、c)，经过30d左右的培养，不定芽 已经生长成健壮、浓绿的组培苗，可以用于生根培养，提高了试管苗的诱导率。
[0011] 、不同激素配比对试管苗生根的影响 实生根的诱导对不定芽是否能形成完整植株起着至关重要的作用。本发明设置了三套 生根培养基，配比如下：培养基（I)MS;培养基（2)MS+2.Omg/LNAA;培养基（3)MS+0. 5mg/L NAA+1.Omg/L6-BA。从图4中可以看出，将试管苗接种到3种生根培养基中，8天左右均可 以长出2-3条实生根，20天左右能长出8-10天实生根，当培养天数达到30天左右时，实生 根的条数明显增多，根系变得粗壮。不同的是当试管苗在生根培养基培养40d约6周后，培 养基1的生根率可达90%以上；生根培养基2的生根率为63. 3%，但有小鳞茎形成；而生根 培养基3的生根率仅为30%左右。因此，基础MS培养基是高效、经济且快速诱导生根培养 基。
[0012] 二、试管苗移栽及管理 1、 试管苗的练苗及移栽 组培苗虽然具有一定的光合能力，处于高湿、弱光、低CO2、恒温、异养条件下生长，其组 织分化不完善，光合自养能力弱，适应性差，气孔多而且不易关闭、叶绿素少、根毛少，炼苗 过程为逐步改变其生长条件、逐步促使其组织发育完全，以适应外界环境生活，使其叶绿素 增多，改善气孔