逐渐分化出生长健壮、颜色 浓绿的不定芽；其中 所述的愈伤组织诱导培养基、继代培养基指的是：MS+1. 5mg/L2, 4-D+0. 5mg/LKT; 所述的不定芽分化的培养基指的是：MS+5mg/L6-BA+l.Omg/LNAA; (4) 壮芽培养： 将分化培养基中诱导出来的愈伤组织和嫩芽一起转移到壮芽培养基或生根培养基中 进行30d壮芽培养；所述的壮芽培养基指的是：MS+1.0mg/LKT+l.Omg/LGA+0.2mg/L NAA+2. 0mg/L6-BA; (5) 生根培养： 将健壮、浓绿的不定芽转移到生根培养基中诱导生根，约4周后不定芽长出数条实生 根，形成完整的试管苗； 所述的生根培养指的是不加激素的MS基础培养基； (6) 试管苗经过室内和田间拱棚中两次练苗，冬前移栽到土壤中，翌年在第一代收获再 生地下鳞茎(把愈伤组织诱导的苗种植到大田土壤中，地上部分长苗，地下部分膨大形成蒜 头--即地下鳞茎，由于愈伤组织苗为再生苗，所以由再生苗长成的蒜头即为地下再生鳞 茎。）。
[0025] 所述的两次练苗指的是：第一次练苗将培养瓶的盖子打开，在培养室中练苗培养 一周；第二次练苗指的是将经过第一次练苗后的试管苗从培养瓶中取出，洗去根部培养基， 剪掉枯黄的叶子，移栽至装有灭菌的珍珠岩、蛭石和泥炭土（ 1:3:6)的培养钵中，在10月初 放置田间小拱棚中，晴好天气揭开小拱棚的薄膜通风，约30d后，试管苗再次长出新根数 条，这时第二次练苗结束，可以进行大田移栽；越冬前移栽到土壤中指的是：1〇月底，日平 均气温KTC以上的时候，把经过两次练苗的试管苗移栽到大田中，这里的土壤没有其它别 要求，只要是一般的土壤就行。
[0026] 实施例2 一种以鳞茎片为外植体构建大蒜微繁的方法： (1) 外植体的获得： 选取生长健壮、无病虫害、自然结束休眠后的大蒜蒜头，剥去外面鳞叶，用自来水冲洗 20min，用0.l%(w/w)升萊浸泡IOmin,无菌水冲洗3次，再在75%(w/w)酒精中浸泡5min，杀 灭表面细菌,无菌水冲洗3次，再用滤纸吸干备用； (2) 大蒜愈伤组织诱导： 在超净台上将大蒜鳞茎切2_厚薄片，接种到愈伤组织诱导培养基中，置人工气候箱 中培养：日温25°C，夜温20°C，光照强度为1500Lux，光照时间14h/d，14天后在外植体 上形成微小的愈伤组织颗粒，接种30天后外植体上已经形成大量的愈伤组织颗粒； (3) 愈伤组织继代及不定芽分化： 将生长旺盛的愈伤组织切下，接种到新鲜的继代培养基中进行继代培养，25天之后愈 伤组织增殖明显，在同样培养基上再继代一次，挑选生长状况良好的愈伤组织颗粒转移到 不定芽分化的培养基上进行分化培养，经过12天的分化培养，逐渐分化出生长健壮、颜色 浓绿的不定芽；其中 所述的愈伤组织诱导培养基、继代培养基指的是：MS+1. 5mg/L2, 4-D+0. 5mg/LKT; 所述的不定芽分化的培养基指的是：MS+5mg/L6-BA+l.Omg/LNAA; (4) 壮芽培养： 将分化培养基中诱导出来的愈伤组织和嫩芽一起转移到壮芽培养基或生根培养基中 进行30-32d壮芽培养；所述的壮芽培养基指的是：MS+1. 0mg/LKT+1.Omg/LGA+0. 2mg/L NAA+2. 0mg/L6-BA; (5) 生根培养： 将健壮、浓绿的不定芽转移到生根培养基中诱导生根，约4周后不定芽长出数条实生 根，形成完整的试管苗； 所述的生根培养指的是不加激素的MS基础培养基； (6) 试管苗经过室内和田间拱棚中两次练苗，冬前移栽到土壤中，翌年在第一代收获再 生地下鳞茎(把愈伤组织诱导的苗种植到大田土壤中，地上部分长苗，地下部分膨大形成蒜 头--即地下鳞茎，由于愈伤组织苗为再生苗，所以由再生苗长成的蒜头即为地下再生鳞 茎)。
[0027] 所述的两次练苗指的是：第一次练苗将培养瓶的盖子打开，在培养室中练苗培养 一周；第二次练苗指的是将经过第一次练苗后的试管苗从培养瓶中取出，洗去根部培养基， 剪掉枯黄的叶子，移栽至装有灭菌的珍珠岩、蛭石和泥炭土（ 1:3:6)的培养钵中，在10月初 放置田间小拱棚中，晴好天气揭开小拱棚的薄膜通风，约30d后，试管苗再次长出新根数 条，这时第二次练苗结束，可以进行大田移栽；越冬前移栽到土壤中指的是：1〇月底，日平 均气温KTC以上的时候，把经过两次练苗的试管苗移栽到大田中，这里的土壤没有其它别 要求，只要是一般的土壤就行。
[0028] 实施例3 采用本发明的大蒜快繁技术体系与常规试管苗快繁方法的对比试验结果如下：
【主权项】
1. 一种以鳞茎片为外植体构建大蒜微繁的方法，其特征在于按如下的步骤进行： (1) 外植体的获得： 选取生长健壮、无病虫害、自然结束休眠后的大蒜蒜头，剥去外面鳞叶，用自来水冲洗 20min，用0. l%(w/w)升萊浸泡IOmin,无菌水冲洗3次，再在75%(w/w)酒精中浸泡5min，杀 灭表面细菌,无菌水冲洗3次，再用滤纸吸干备用； (2) 大蒜愈伤组织诱导： 在超净台上将大蒜鳞茎切2_厚薄片，接种到愈伤组织诱导培养基中，置人工气候箱 中培养：日温25°C，夜温20°C，光照强度为1500 Lux，光照时间14 h/d，6-14天后在外植 体上形成微小的愈伤组织颗粒，接种25-30天后外植体上已经形成大量的愈伤组织颗粒； (3) 愈伤组织继代及不定芽分化： 将生长旺盛的愈伤组织切下，接种到新鲜的继代培养基中进行继代培养，25天之后愈 伤组织增殖明显，在同样培养基上再继代一次，挑选生长状况良好的愈伤组织颗粒转移到 不定芽分化的培养基上进行分化培养，经过10-12天的分化培养，逐渐分化出生长健壮、颜 色浓绿的不定芽；其中 所述的愈伤组织诱导培养基、继代培养基指的是：MS+1. 5mg/L 2, 4-D+0. 5 mg/L KT ; 所述的不定芽分化的培养基指的是：MS+5mg/L 6-BA+l. Omg/L NAA ; (4) 壮芽培养： 将分化培养基中诱导出来的愈伤组织和嫩芽一起转移到壮芽培养基中进行25-30d壮 芽培养；所述的壮芽培养基指的是：MS+1. 0 mg/L KT+1. Omg/L GA+0. 2 mg/L NAA+2. 0 mg/L 6-BA ； (5) 生根培养： 将健壮、浓绿的不定芽转移到生根培养基中诱导生根，4周后不定芽长出数条实生根， 形成完整的试管苗；所述的生根培养指的是不加激素的MS基础培养基； (6) 试管苗经过室内和田间拱棚中两次练苗，冬前移栽到土壤中，翌年在第一代收获再 生地下鳞茎把愈伤组织诱导的苗种植到大田土壤中，地上部分长苗，地下部分膨大形成蒜 头一即地下鳞茎，由于愈伤组织苗为再生苗，所以由再生苗长成的蒜头即为地下再生鳞茎。
2. 权利要求1所述的构建大蒜微繁方法，其中所述的两次练苗指的是：第一次练苗将 培养瓶的盖子打开，在培养室中练苗培养一周；第二次练苗指的是将经过第一次练苗后的 试管苗从培养瓶中取出，洗去根部培养基，剪掉枯黄的叶子，移栽至装有灭菌的珍珠岩、蛭 石和泥炭土（1:3:6)的培养钵中，在10月初放置田间小拱棚中，晴好天气揭开小拱棚的薄 膜通风，约30 d后，试管苗再次长出新根数条，这时第二次练苗结束，可以进行大田移栽； 越冬前移栽到土壤中指的是：1〇月底，日平均气温KTC以上的时候，把经过两次练苗的试 管苗移栽到大田中，这里的土壤没有他别要求，只要是一般的土壤就行。
3. 权利要求1所述以鳞茎片为外植体构建大蒜微繁方法在提高试管苗诱导率方面的 应用。
【专利摘要】本发明公开了一种以鳞茎片为外植体构建大蒜微繁的方法。它是以大蒜鳞茎片为外植体，以MS+1.5mg/L2,4-D+0.5mg/LKT为愈伤组织诱导和继代培养基、以MS+5mg/L6-BA+1.0mg/LNAA为诱导不定芽分化培养基、增加以MS+1.0mg/LKT+1.0mg/LGA+0.2mg/LNAA+2.0mg/L6-BA为壮芽培养基的壮芽培养过程、以基础MS培养基为生根培养基的试管苗培养体系；试管苗经过室内和田间拱棚中两次练苗，冬前移栽到土壤中，翌年在第一代收获分瓣率高达94%再生地下鳞茎。该技术体系为优良品种大蒜种质扩繁提供了重要的保障。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104642109
【申请号】CN201510056990
【发明人】王振英, 任春雪, 王珍, 范宝莉, 刘晓颖, 彭永康, 陈宏
【申请人】天津师范大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月4日