一种双水相分离纯化蒜氨酸酶的方法
【专利摘要】本发明属于大蒜精深加工领域，特别公开了一种双水相分离纯化蒜氨酸酶的方法。该方法包括如下步骤：（1）将大蒜鳞茎去皮预冷，加入预冷提取液浸泡，匀浆、离心，弃去蒜渣，上清液即为粗酶液；（2）将硫酸铵、磷酸二氢钠或柠檬酸三钠溶于伯瑞坦-罗宾森缓冲液中，震荡完全溶解后，再加入PEG溶液，震荡混匀，静置分相，得到双水相提取剂；（3）将粗酶液置于双水相提取剂中，震荡后，离心静置分相；（4）对富集蒜氨酸酶的下相超滤，对截留液真空冷冻干燥，得到蒜氨酸酶固体。本发明操作简单，仪器简单，时间上节约，成本低廉，蒜氨酸酶纯化倍数和酶活回收率都比现有技术高，易于放大规模生产。
【专利说明】一种双水相分离纯化蒜氨酸酶的方法
[0001](一)
【技术领域】
本发明属于大蒜精深加工领域，特别涉及一种双水相分离纯化蒜氨酸酶的方法。
[0002](二)
【背景技术】
蒜氨酸酶是存在于大蒜中的一种内源酶，全称S-烷基-L-半胱氨酸亚砜酶，大约占蒜中可溶性蛋白的10-12%，由两个完全相同的亚基构成，每个亚基由448个氨基酸组成，蒜氨酸酶和它的天然底物蒜氨酸位于大蒜的不同部位，蒜氨酸酶位于液泡组织中，底物位于细胞质中，当大蒜破碎时，蒜氨酸和蒜氨酸酶接触生产的硫代亚磺酸酯具有抗癌、抗氧化、抗动脉粥样硬化等作用，可以用蒜氨酸酶和蒜氨酸来制备硫代亚磺酸酯用于大蒜胶囊的生产，因此蒜氨酸酶的分离纯化对于硫代亚磺酸酯的生产很重要。
[0003]目前蒜氨酸酶纯化主要采用一系列的蛋白纯化技术，如盐析、亲和色谱、凝胶过滤等，虽然这些方法都能使蒜氨酸酶达到一定的纯化，但是存在诸多缺点，如操作繁琐，条件苛刻，分离过程容易使蛋白变性，降低酶活以及酶的回收率。蒜氨酸酶在温度大于30°C时酶活会降低，所以纯化蒜氨酸酶对环境的要求较高，找到一种适合蒜氨酸酶纯化的方法尤为重要。本发明提供了一种双水相方法，此种方法操作简单、操作条件温和、易于放大、消耗能量小的分离纯化方法，是目前人们研究和开发的主要课题，用这种方法来纯化蒜氨酸酶能够达到酶活的要求。
[0004](三)
【发明内容】
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种降低生产成本，提高酶活回收率，提高产品生物活性的双水相分离纯化蒜氨酸酶的方法。
[0005]本发明是通过如下技术方案实现的:
一种双水相分离纯化蒜氨酸酶的方法，以大蒜鳞茎为原料，包括如下步骤:
(1)将大蒜鳞茎去皮预冷，加入4°c的预冷提取液浸泡，在预冷的组织匀浆机中匀浆、离心，弃去蒜渣，上清液即为粗酶液；
(2)将硫酸铵、磷酸二氢钠或柠檬酸三钠溶于伯瑞坦-罗宾森缓冲液中，震荡完全溶解后，再加入PEG溶液，震荡混匀，静置分相，得到双水相提取剂；
(3)将粗酶液置于双水相提取剂中，震荡混匀后，离心静置分相；
(4)对富集蒜氨酸酶的下相超滤，对截留液真空冷冻干燥，得到蒜氨酸酶固体。
[0006]本发明的更优技术方案为:
步骤(1)中，预冷提取液的pH为7.0，含有0.05mol/L磷酸二氢钠、0.05mol/L磷酸二氢钾、5mmol/L的EDTA、25 μ mol/L的PLP、体积比为10%的甘油和重量比为1%的氯化钠，大蒜鳞茎和预冷提取液的使用比为Ig:50mL，浸泡时间为20-40min。
[0007]步骤(2)中，双水相提取剂为硫酸铵/PEG体系，PEG的分子量为1000-3000，硫酸铵的质量浓度为10-18% (w/w), PEG的质量浓度为7.5-17.5% (w/w)。
[0008]步骤(3)中，双水相提取剂的pH为2.0-5.0，粗酶液加入量为3-6% (v/v)。
[0009]酶活测定方法为:
以合成的S-烯丙基-L-半胱氨酸为底物，用丙酮法测定酶活性:lmL酶液加IL底物(体系中加入25--mol/LPLP)室温下反应Imin后，加等量10%三氯乙酸终止反应，加入ImL0.1%的2，4- 二硝基苯肼25°C恒温5min,再加入5mL2.5mol/L氢氧化钠摇匀显色1min后，用756紫外分光光度计测波长420nm处的光吸收值(OD)。在25°C条件下，蒜氨酸酶催化的反应中，每分钟产生l--mol丙酮酸定义为一个酶活单位(U)。
[0010]本发明操作简单，仪器简单，时间上节约，成本低廉，蒜氨酸酶纯化倍数和酶活回收率都比现有技术高，分离过程经济，环境温和，对蒜氨酸酶的活性影响较小，可省去反复沉淀的步骤，易于放大规模生产。
[0011](四)
【具体实施方式】
粗酶液的制备:称取大蒜鳞茎100g，去皮，4°c预冷，加4°C预冷提取液(PH7.0、
0.05mol/L磷酸二氢钠、0.05mol/L磷酸二氢钾、体积比为10%的甘油、1%的氯化钠、5mmol/L的EDTA、25--mol/L的PLP)浸提30min，在预冷的组织匀浆机中匀浆，3000rpm离心10min，弃去蒜渣，上清液即为粗酶液，测定其中的酶活和蛋白含量。
[0012]实施例1:
配制质量分数为7.5%(w/w)PEG3000/10%(w/w)硫酸铵，pH=5.0的双水相体系，添加5%(v/v)的蒜氨酸酶粗提液，震荡15min使相完全分散，离心使相完全分离，记录上下相体积。对下相通过超滤除去盐后，真空冷冻干燥，得酶纯化倍数为5.06，酶活回收率为92.2%。
[0013]实施例2:
配制质量分数为17.5% (w/w)PEG3000/18%(w/w)硫酸铵，pH=5.0的双水相体系，添加5%(v/v)的蒜氨酸酶粗提液，震荡15min使相完全分散，离心使相完全分离，记录上下相体积。对下相通过超滤除去盐后，真空冷冻干燥，得酶纯化倍数为5.58，酶活回收率为94.4%。
[0014]实施例3:
配制质量分数为15%(W/W)PEG3000/14%(W/W)硫酸铵，pH=5.0的双水相体系，添加5%(v/v)的蒜氨酸酶粗提液，震荡15min使相完全分散，离心使相完全分离，记录上下相体积。对下相通过超滤除去盐后，真空冷冻干燥，得酶纯化倍数为5.95，酶活回收率为96.2%。
【权利要求】
1.一种双水相分离纯化蒜氨酸酶的方法，以大蒜鳞茎为原料，其特征为，包括如下步骤:(I)将大蒜鳞茎去皮预冷，加入4°c的预冷提取液浸泡，在预冷的组织匀浆机中匀浆、离心，弃去蒜渣，上清液即为粗酶液；(2)将硫酸铵、磷酸二氢钠或柠檬酸三钠溶于伯瑞坦-罗宾森缓冲液中，震荡完全溶解后，再加入PEG溶液，震荡混匀，静置分相，得到双水相提取剂；(3)将粗酶液置于双水相提取剂中，震荡混匀后，离心静置分相；(4)对富集蒜氨酸酶的下相超滤，对截留液真空冷冻干燥，得到蒜氨酸酶固体。
2.根据权利要求1所述的双水相分离纯化蒜氨酸酶的方法，其特征在于:步骤(1)中，预冷提取液的PH为7.0,含有0.05mol/L磷酸二氢钠、0.05mol/L磷酸二氢钾、5mmol/L的EDTA、25 μ mol/L的PLP、体积比为10%的甘油和重量比为1%的氯化钠，大蒜鳞茎和预冷提取液的使用比为Ig:50mL，浸泡时间为20-40min。
3.根据权利要求1所述的双水相分离纯化蒜氨酸酶的方法，其特征在于:步骤(2)中，双水相提取剂为硫酸铵/PEG体系。
4.根据权利要求1所述的双水相分离纯化蒜氨酸酶的方法，其特征在于:步骤(3)中，双水相提取剂的PH为2.0-5.0，粗酶液加入量为3-6% (v/v)0
5.根据权利要求3所述的双水相分离纯化蒜氨酸酶的方法，其特征在于:步骤(2)中，PEG的分子量为1000-3000，硫酸铵的质量浓度为10-18% (w/w), PEG的质量浓度为.7.5-17.5% (w/w)。
【文档编号】C12N9/88GK104073479SQ201410298149
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年6月27日 优先权日:2014年6月27日
【发明者】崔波, 姜秀敏, 檀琮萍, 卢艳敏 申请人:齐鲁工业大学