本发明属于细胞冻存领域，具体涉及一种用于cik细胞于-80℃直接冻存的冻存液。
背景技术：
冻存cik细胞时，一般降温程序为：首先于4℃冰箱中放置1h，然后-20℃冰箱中放置2h，最后转至-80℃低温冰箱放置(或用液氮保存)，程序繁琐。但是，若直接将cik细胞转至-80℃低温冰箱保存，会显著降低cik细胞对肿瘤细胞的杀伤活性【参考文献：-80℃冰箱直接冻存对细胞因子诱导的杀伤细胞杀伤活性的影响，细胞与分子免疫学杂志，2012，28(10)】。
这主要与细胞冻存液有关，现有冻存液不适合用作cik细胞于-80℃直接冻存的保护剂。
技术实现要素：
本发明旨在克服现有技术的不足，简化cik细胞低温冻存工艺，提供一种用于cik细胞于-80℃直接冻存的冻存液。
本发明通过如下技术方案得以实现：
一种细胞冻存液，以rpmi-1640培养液为基质，在基质中添加dmso、fbs复配而成，基质中还添加有效量的人β2-微球蛋白。
优选地，1l基质添加1-2g人β2-微球蛋白。
优选地，1l基质添加80-120mldmso。
优选地，1l基质添加180-220mlfbs。
上述细胞冻存液在cik细胞冻存方面的应用。
本发明优点：
使用本发明提供的细胞冻存液冻存cik细胞时，可以直接于-80℃冻存，且不会导致cik细胞杀伤力明显降低，可以简化cik细胞低温冻存工艺。
附图说明
图1为不同cik细胞对k562细胞的杀伤率(％)。
具体实施方式
为了更好地解释本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步介绍。实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，属于本领域技术人员易于获得的范畴。
实施例1
一、实验材料和方法
1、细胞冻存液的配制
在rpmi-1640培养液(美国gibco公司)中添加二甲基亚砜(dmso)、胎牛血清(fbs，美国gibco公司)和人β2-微球蛋白(购于武汉戴安生物技术有限公司，货号p0008)，其中：1lrpmi-1640培养液中分别添加1.5g人β2-微球蛋白、100mldmso、200mlfbs。混合均匀后于4℃低温保存，使用前取出并轻轻摇匀。
另按照常规配方配制对比冻存液，对比冻存液的成分为含10％dmso及20％fbs的rpmi-1640作为冻存剂。
2、cik细胞的培养扩增
取肝素抗凝的健康志愿者外周血20ml，用淋巴细胞分离液密度梯度离心(2400×g，20min)，轻轻吸取灰白色层的单个核细胞，用生理盐水洗涤3次，以rpmi-1640培养液调整细胞密度为5×106/ml，加到培养瓶内，每瓶15ml，置37℃、5％co2培养箱中培养2h，轻轻摇匀，吸出悬浮细胞，离心后去上清用rpmi-1640培养液(含100ml/lfbs、rhil-2500u/ml，小鼠抗人cd3单克隆抗体500ng/ml，ifn-γ1000u/ml，rhil-1100u/ml)调细胞密度为2.5×106/ml，加到培养瓶内，每瓶20ml。接种当天记为0天，每隔3d半量换液并补足rhifn-γ及rhil-2。
3、cik细胞的冻存和复苏
cik培养至第12天时，留1瓶cik用于检测杀伤活性外，收集其余细胞，计数，分别用上述本发明配方冻存液和对比冻存液调整细胞密度为5×107/ml，直接冻存于-80℃冰箱。
冻存6个月后，将冻存管从-80℃冰箱取出后立即投入40℃水浴中快速融化，800r/min离心10min，弃上清，用rpmi-1640培养液(含100ml/lfbs、rhil-2500u/ml，ifn-γ1000u/ml，rhil-1100u/ml)重悬细胞，调整细胞密度为2.5×106/ml，37℃、5％co2培养箱内培养。
3、cik细胞的杀伤活性
分别将培养至第12天未冻存、用本发明细胞冻存液冻存6月复苏培养5天、用对比冻存液冻存6月复苏培养5天的cik细胞与对数期的k562细胞按照效靶比20:1混合，同时设单独的靶细胞及效应细胞孔，用ldh释放法，测定490nm的吸光度(a)值，计算各组cik对k562细胞的杀伤率(％)。
二、实验结果
培养至第12天未冻存、用本发明细胞冻存液冻存6月复苏培养5天、用对比冻存液冻存6月复苏培养5天的cik细胞对k562细胞的杀伤率如表1和图1所示。与未冻存的cik细胞相比，用本发明细胞冻存液冻存6月复苏培养5天、用对比冻存液冻存6月复苏培养5天的cik细胞对k562细胞的杀伤率均降低，但是用本发明细胞冻存液冻存6月复苏培养5天的cik细胞对k562细胞的杀伤率降低不明显，显著优于对比冻存液的冻存效果。
表1不同cik细胞对k562细胞的杀伤率(％)
上述结果表明，使用本发明提供的细胞冻存液冻存cik细胞时，可以直接于-80℃冻存，且不会导致cik细胞杀伤力明显降低，可以简化cik细胞低温冻存工艺。
上述实施例仅用于进一步解释本发明的技术方案，本领域技术人员应当明白，任何简单替换或修改均不脱离本发明，本发明的保护范围并不受限于上述具体实施例。